專利名稱：水稻種子16kD醇溶蛋白基因終止子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種水稻種子16kD醇溶蛋白基因終止子及其應用。
背景技術：
植物生物技術的最新發(fā)展不僅實現(xiàn)了傳統(tǒng)農(nóng)藝性狀的改良(如提高作物產(chǎn)量，增強抗病、抗蟲、抗除草劑特性，改良品質(zhì)等)，而且使植物成為生物醫(yī)藥和工業(yè)產(chǎn)品的生物反應器。絕大多數(shù)禾本科作物具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、耐儲藏、生產(chǎn)規(guī)模容易控制、可直接食用等特點，并且其具備體內(nèi)翻譯后修飾的能力，因而成為第二代轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的理想載體。近年來利用水稻種子生產(chǎn)具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究發(fā)展很快，且已經(jīng)取得了巨大成功。如維生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有預防和治療缺鐵性貧血和提高自身免疫功能的大豆鐵蛋白(Ferritin)、具有刺激胰島素分泌預防糖尿病發(fā)生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉過敏癥疫苗等均成功地在水稻中表達并高水平累積。然而，進一步實現(xiàn)外源基因的高效表達必須在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平同時提高基因表達。啟動子主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達，終止子則在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平同時起調(diào)控作用。盡管目前廣泛應用的終止子，如NOS、0cS，與異源啟動子組合后可啟動報告基因在植物中的高表達，能夠滿足生物化學、生理學以及細胞定位方面的研究需求。然而，對于其他能夠提高基因表達的終止子研究較少。由于一些重要農(nóng)藝性狀以及植物次生代謝產(chǎn)物都是由多基因控制，提高單個基因的表達對于相關性狀改良作用不明顯。通過傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法， 如重復轉(zhuǎn)化或雜交來實現(xiàn)多基因轉(zhuǎn)化卻費時費力。近年來發(fā)展起來的多基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以在一個表達載體中同時插入多個基因，為了避免轉(zhuǎn)基因同源性過高引起的轉(zhuǎn)基因沉默，這些基因需要由不同的啟動子驅(qū)動表達，不同的終止子終止轉(zhuǎn)錄。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一個終止子，名稱為tl6kD prolamine，該終止子與nos 終止子相比，可以提高外源基因的表達水平。本發(fā)明所提供的終止子，為如下1)或2)或3)的DNA分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列組成的DNA分子；2)與1)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交的分子。所述嚴格條件可為如下50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0. SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS、0. 5M Na3POjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，1 X SSC，0. SDS中漂洗；還可為50°C，在 7% SDS,0. 5M Νει3Ρ04 Π ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. 5X SSC, 0. SDS 中漂洗； 還可為50°C，在 7% SDS,0. 5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. IX SSC,0. 1% SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交， 在65°C，0. 1XSSC，0. 1% SDS中漂洗；也可為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, 0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗膜一次。其中，序列表中序列1由531個核苷酸組成。含有所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或重組病毒也屬于本發(fā)明的保護范圍。可用現(xiàn)有的植物表達載體構建含有所述DNA分子的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pROKII、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa 或 pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。使用所述DNA分子構建重組植物表達載體時，在外源基因轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子(如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、玉米的泛素啟動子⑴biquitin))、組成型啟動子或組織特異表達啟動子(如種子特異表達的啟動子)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發(fā)明的DNA分子構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個外源基因序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結構基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工， 如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標記基因(如賦予對卡那霉素和相關抗生素抗性的nptll基因， 賦予對除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對 methatrexate抗性的dhfr基因，賦予對草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學試劑標記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構酶基因。所述重組載體具體可為PGluB-3-tl6kD prolamine。所述 pGluB_3_tl6kD prolamine是將pGluB-3-nos中的nos終止子替換為序列表中序列1所示的tl6kD prolamine終止子得到的重組載體。所述表達盒是指由啟動子、由所述啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的目的基因和位于所述目的基因下游的所述DNA分子組成的。其中，所述啟動子可為組成型啟動子或組織特異表達啟動子(如胚乳特異性啟動子)。所述目的基因可為蛋白編碼基因和/或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優(yōu)選為品質(zhì)改良基因；所述非蛋白編碼基因為正義RNA基因和/或反義RNA 基因。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將含有所述DNA分子的表達盒導入目的植物中，得到所述目的基因表達水平高于將如下表達盒導入所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物將所述的表達盒中的所述DNA分子替換為胭脂堿合成酶的nos終止子得到的表達盒。所述目的植物具體可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為水稻，小麥，玉米，高粱或大麥，所述雙子葉植物具體可為大豆，油菜，棉花，煙草，馬鈴薯，甘薯或油桐。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述含有所述DNA分子的表達盒轉(zhuǎn)化目的植
4物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該含有所述DNA分子的表達盒，也可用常規(guī)育種技術將該含有所述DNA分子的表達盒轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述DNA分子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應用或作為終止子的應用也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。利用本發(fā)明的終止子與不同的啟動子配合，可提高外源基因在目的植物中的表達和累積水平，可改良種子品質(zhì)、將具有生理活性的蛋白或短肽導入種子中創(chuàng)制保健型功能新品種、利用種子作生物反應器生產(chǎn)有用外源蛋白或可食性疫苗，增加農(nóng)產(chǎn)品科技附加值等。本發(fā)明的終止子及其應用為利用生物技術改良種子品質(zhì)、分子醫(yī)藥農(nóng)場等研究奠定了基礎，具有極大的應用前景。


圖1為從水稻基因組DNA中PCR擴增16kD prolamine終止子(tl6kD prolamine) 的電泳圖譜。其中1為DNA分子量標準，2為16kD prolamine終止子的片段。其中，標準分子量大小由下至上依次為:0. Ikb, 0. 2kb,0. 3kb,0. 4kb,0. 5kb,0. 6kb,0. 7kb,0. 8kb,0. 9kb, 1. Okb, 1. 2kb, 1. 5kb，2. 0kb，3. 0kb，4. 0kb，5. 0kb，6. 0kb，8. Okb, 10. Okb。圖2為載體pMD_tl6kD prolamine經(jīng)Sac I禾Π EcoR I的雙酶切鑒定圖譜。其中 1為DNA分子量標準，2為pMD-tl6kD prolamine的酶切片段。其中，標準分子量大小由下至上依次為:0. Ikb, 0. 2kb,0. 3kb,0. 4kb，0. 5kb，0. 6kb，0. 7kb,0. 8kb,0. 9kb, 1. Okb, 1. 2kb, 1. 5kb，2. Okb, 3. Okb, 4. Okb, 5. Okb, 6. Okb, 8. Okb, 10. Okb，酶切片段由下至上依次為:tl6kD prolamine, 531bp ；pMD_tl6kD prolamine 載體框架，2700bp。圖 3 為載體pGluB-3-tl6kD prolamine 的結構示意圖。其中，16kD proT代表 tl6kD prolamine。圖4為轉(zhuǎn)PGluB-3-tl6kD prolamine載體Ttl代水稻植株嵌合引物PCR擴增電泳圖譜。1為DNA分子量標準，2為以PGluB-3-tl6kD prolamine為模板的陽性對照，3為以未轉(zhuǎn)化株系為模板的陰性對照，4 13為轉(zhuǎn)pGluB-3-tl6kD prolamine植物表達載體的再生植株。圖5為未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake植株⑶S染色結果。其中，1、2、3、4分別為未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake植株根、莖、葉及種子的染色結果。圖6為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos植株GUS染色結果。其中，1、2、3、 4分別為轉(zhuǎn)pGluB-3-nos植株根、莖、葉及種子的染色結果。圖7為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-tl6kD prolamine植株⑶S染色結果。 其中，1、2、3、4分別為轉(zhuǎn)PGluB-3-tl6kD prolamine植株根、莖、葉及種子的染色結果。圖 8 為 Ttl 代轉(zhuǎn)基因水稻 Kitaake/pGluB-3-tl6kD prolamine 所結種子的 GUS 熒光活性測定結果。圖9為T1代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-tl6kD prolamine所結種子的GUS熒光活性測定結果。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、水稻種子16kD醇溶蛋白基因終止子(tl6kD prolamine)的獲得根據(jù)水稻16kD醇溶蛋白基因cDNA序列(GenBank號為AK107785)，從GenBank中查找16kD醇溶蛋白基因的基因組DNA序列，終止密碼子后531bp的序列即為本發(fā)明的水稻種子16kD醇溶蛋白基因終止子(tl6kD prolamine)，設計引物擴增tl6kD prolamine。為便于載體構建，在引物上分別添加酶切位點(下劃線所示)。tl6kD prolamine的正向引物為 16kD prolamine SacF :5' -AAGAGCTCTAAAATTTGGAATAGTCTTTGG-3‘ (Sac I)，反向引物為 16kD prolamine EcoR :5, -AAAGAATTCACTTCTTCTATGTTTATAG-3‘ (EcoR I)。CTAB 法從野生型水稻 Kitaake (文獻 Qu et al.，J. Exp. Bot. 2008,59 :2417-2424) 葉片中小量提取基因組DNA，以其為模板，以16kD prolamine SacF和16kD prolamine EcoR 為引物，PCR擴增tl6kD prolamine序列。反應程序為94°C預變性5min，然后94°C 30sec， 55°C 30sec,72°C lmin，30個循環(huán)，最后72°C IOmin0 PCR擴增得到531bp的目的條帶，如圖1所示?；厥諗U增產(chǎn)物，直接連接到PMD18-T載體(購自TaKaRa公司)上，進行測序，結果表明，擴增得到的tl6kD prolamine序列大小為531bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列。將測序檢測表明含有tl6kD prolamine片段的重組載體命名為pMD-tl6kD prolamine0 pMD-tl6kD prolamine經(jīng)Sac I和EcoR I的雙酶切鑒定圖譜如圖2所示。實施例2、水稻種子16kD醇溶蛋白基因終止子(tl6kD prolamine)的穩(wěn)定表達載體構建1、tl6kD prolamine融合GUS基因的植物穩(wěn)定表達載體構建用 Sac I 禾口 EcoR I 雙醇切 pMD_tl6kD prolamine 質(zhì)粒，回收 tl6kD prolamine 531bp酶切片段，將該片段插入到含有GluB-3啟動子的pGluB-3-nos的McI和EcoR I雙酶切識別位點之間構建穩(wěn)定轉(zhuǎn)化載體pGluB-3-tl6kD prolamine (其結構示意圖如圖3所示)。pGluB-3-nos 按照文獻 Qu et al.，J. Exp. Bot. 2008，59 :2417-2424 所述的方法構建 以水稻臺中65的基因組DNA為模板，以GluB-3正向引物5，-CCCAAGCTTATTTTACTTGTACTG TTTAACC-3，(HindIII)和 GluB-3 反向引物 5’ -AAACCCGGGAGCTTTCTGTATATGCTAATG-3’ (Sma I)為引物，PCR擴增得至IJ GluB-3啟動子，將GluB-3啟動子用HindIII和SmaI雙酶切，插入到 pGPTV-35S-HPT(Qu et al.，J. Exp. Bot. 2008,59 :2417-2424)的 GUS 上游的 HindIII 和 SmaI位點，得到的重組載體即為pGluB-3-nos。pGPTV-35S_HPT以⑶S為外源基因，nos為終止子。將得到的重組載體PGluB-3-tl6kD prolamine在PCR鑒定的基礎上利用&ic I和 EcoR I進行雙酶切鑒定，得到含有531bp tl6kD prolamine的片段。2、轉(zhuǎn) pGluB-3-tl6kD prolamine 及 pGluB-3-nos 水稻再生植株的獲得pGluB-3-nos和構建完成的pGluB_3_tl6kD prolamine表達載體經(jīng)過酶切與測序驗證其正確性后，利用凍融法分別導入農(nóng)桿菌EHA105中，具體方法如下吸取7μ 1表達載體質(zhì)粒加入100 μ 1 ΕΗΑ105農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，輕彈混勻后置于液氮中冷凍7min，之后轉(zhuǎn)入37°C水浴中靜置3min，然后加入SOOulYEB液體培養(yǎng)基于靜置恢復培養(yǎng)池 5h， 取400 μ 1菌液涂布于YEB抗性平板上(卡那霉素50mg/L，利福平Rif 50mg/L)，于倒置培養(yǎng)2 3天。挑取少許農(nóng)桿菌單菌落進行目標基因的菌落PCR檢測后將陽性菌落在YEB抗性平板上劃線擴繁培養(yǎng)，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化水稻品種kitaake的愈傷組織，用潮霉素篩選抗性愈傷，并進一步培養(yǎng)分化成幼苗后移栽溫室。利用潮霉素篩選方法(按照文獻Hiei et al.，Plant J. 1994,6 :271-282所述方法進行)，獲得10株TciRRpGluBHiekD prolamine水稻植株。利用PCR方法對上述篩選得到的部分轉(zhuǎn)PGluB-3-tl6kD prolamine水稻進行PCR分子檢測，PCR引物為 tl6kD prolamine和GUS基因序列的嵌合引物，即:tl6kD prolamine序列反向引物16kD prolamine EcoR :5 ‘ -AAAGAATTCACTTCTTCTATGTTTATAG-3 ‘和 GUS 序列內(nèi)部的正向引物 GUSF185 5 ‘ -TCGTCGGTGAACAGGTATGG-3 ‘。PCR 反應程序為94 "C 預變性 5min，然后 940C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin,30 個循環(huán)，最后 72°C IOmin0 PCR 擴增得到 0. 7kb 的目的條帶即為檢測陽性。結果表明PCR檢測的10株轉(zhuǎn)PGluB-3-tl6kD prolamine植株(表示為 Kitaake/pGluB-3-tl6kD prolamine)均呈陽性(如圖 4 所示)。按照上述方法，將pGluB-3-nos轉(zhuǎn)入野生型水稻Kitaake，得到9株轉(zhuǎn) pGluB-3-nos 的陽性 pGluB-3-nos 植株(表示為 Kitaake/pGluB-3-nos)。轉(zhuǎn) pGluB-3-nos 水稻植株的PCR檢測方法以tnos序列反向引物tnosR 5' -GATCTAGTAACATAGATGAC-3‘ 和GUS序列內(nèi)部的正向引物GUSF185 5' -TCGTCGGTGAACAGGTATGG-3‘為引物，擴增tnos 和GUS基因的嵌合序列，得到500bp的目的條帶即為陽性轉(zhuǎn)化株。T0代轉(zhuǎn)基因植株所結的種子和由該種子長成的植株為T1代，依此類推，T2、T3分別表示轉(zhuǎn)基因植株第2代和第3代。實施例3、水稻種子16kD醇溶蛋白基因終止子(tl6kD prolamine)的功能驗證UT0代轉(zhuǎn)基因水稻的⑶S組織化學檢測對PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/ pGluB-3-tl6kD prolamine的Ttl代植株進行組織化學染色，以未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻 Kitaake植株為對照。具體步驟為將轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/ PGluB-3-tl6kD prolamine!；代植株和未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake植株的部分葉片、 根、莖桿組織切成小塊；將開花后17天的灌漿期種子用解剖刀從中部縱切開。將處理好的樣品浸泡于GUS染色反應液(0. IM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0)，IOmM Na2-EDTA (pH7. 0)，5mM鐵氰化鉀，5mM 亞鐵氰化鉀，1. OmM X-Gluc, 0. 1% Triton X-100)，37°C反應 0. 5-4 小時。70% 乙醇中保存、觀察。體視鏡下觀察并拍照。結果如圖5、圖6、圖7所示未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake植株的根、葉片、莖桿和開花后17天的種子的糊粉層和亞糊粉層均未觀察到 GUS 表達；Ttl 代轉(zhuǎn)基因水稻 Kitaake/pGluB-3-nos 和 Kitaake/pGluB-3_tl6kD prolamine 植株的根、葉片、莖桿均未觀察到GUS表達，而開花后17天的種子的糊粉層和亞糊粉層均有 ⑶S表達。結果表明pGluB-3-tl6kD prolamine與pGluB-3-nos在胚乳中表達強度相似， tl6kD prolamine和nos終止子均未改變胚乳特異性表達。2、T0及T1代轉(zhuǎn)基因水稻的⑶S熒光活性測定對PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和部分Kitaake/ pGluB-3-tl6kD prolamine的Ttl代及T1代植株開花后17天的灌漿期種子進行⑶S定量分析。方法按照 Jefferson 等的熒光檢測方法(Jefferson, Plant Mol. Biol. Report, 1987, 5 :387-405)進行。具體為每株取3粒種子，分別置于3個1.5ml印pendorf管中，用研棒將種子碾碎，加入200 μ 1抽提液(50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH7. 0)，IOmM β -巰基乙醇，IOmMNa2EDTA (pH 8. 0) ,0. 1% SDS,0. 1% Triton X-100)，振蕩混勻。4°C 13，OOOrpm 離心 5min，取上清于新管中。10 μ 1上清，加入90 μ 1反應液(ImM 4-MUG溶于⑶S抽提液)，37°C反應60 分鐘，加入900μ 1終止液(0. 2Μ Na2CO3)，室溫終止反應。以4-MU做標準曲線，用F-4500(日立)型熒光分光光度計在360nm激發(fā)波長和460nm吸收波長下檢測相對4-MU含量。以牛血清白蛋白為對照，利用BIO-Rad Protein Assay Kit II (購自美國伯樂公司，編號GPR6611) 測定蛋白質(zhì)含量。對轉(zhuǎn)基因株系Ttl代所結種子進行⑶S活性測定結果如圖8所示。在9個Kitaake/ pGluB-3-tl6kD prolamine 的 T0 株系中，GUS 活性最高值為 34. 34pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，最低值為 5. 36pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 13. 2士 10. 2pmol 4-MU min-1 μ 蛋白。而9個Kitaake/pGluB-3-nos的對照T0株系中，GUS活性最高值為17. 38pmol 4-MU mirT、蛋白，最低值為 2. 39pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 11. 2士5. Opmol 4-MU HiirT1yg-1蛋白。轉(zhuǎn)pGluB-3-tl6kD prolamine載體最大值是后者最大值的1. 97倍，是其最小值的14. 34倍，平均值為對照平均值的1. 17倍。對轉(zhuǎn)基因株系部分的T1代所結種子進行GUS活性測定結果如圖9所示。8 個 Kitaake/pGluB-3-tl6kD prolamine 的 T1 株系 GUS 活性最高值為 29. 24pmol 4-MU mirT、蛋白，最低值為 6. 38pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 15. 97 士8. 3pmol 4-MU mirT1 μ g—1蛋白。而7個對照Kitaake/pGluB-3-nos的T1株系中，則GUS活性最高值為 21.52pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，最低值為 2. 82pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 9. 9士5. 8pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白。前者平均值為對照的1. 60倍。結果表明，tl6kD prolamine與nos終止子相比增強了外源基因在水稻胚乳中的表達水平。
權利要求
1.DNA分子，其特征在于所述DNA分子為如下1)或2)或3)的分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列組成的DNA分子；2)與1)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交的分子。
2.含有權利要求1所述DNA分子的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系、重組菌或重組病
3.根據(jù)權利要求2所述的表達盒，其特征在于所述表達盒由啟動子、由所述啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的目的基因和位于所述目的基因下游的權利要求1所述的DNA分子組成。
4.根據(jù)權利要求3所述的表達盒，其特征在于所述啟動子為組成型啟動子或組織特異表達啟動子，所述組織特異表達啟動子具體可為胚乳特異性表達啟動子。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的表達盒，其特征在于所述目的基因為蛋白編碼基因和/ 或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優(yōu)選為品質(zhì)改良基因；所述非蛋白編碼基因為正義 RNA基因和/或反義RNA基因。
6.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權利要求3-5中任一所述的表達盒導入目的植物中，得到所述目的基因表達水平高于將如下表達盒導入所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物將權利要求3所述的表達盒中的權利要求1所述的DNA分子替換為nos終止子得到的表達盒。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所述單子葉植物為水稻，小麥，玉米，高粱或大麥；所述雙子葉植物為大豆，油菜，棉花，煙草，馬鈴薯，甘薯或油桐。
9.權利要求1所述的DNA分子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應用。
10.權利要求1所述的DNA分子作為終止子的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻種子16kD醇溶蛋白基因終止子及其應用。該終止子為一種DNA分子，為如下1)或2)或3)的分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列組成的DNA分子；2)與1)限定的DNA的序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交的分子。利用本發(fā)明的終止子與不同的啟動子配合，可提高外源基因在目的植物中的表達和累積水平，為利用生物技術改良種子品質(zhì)、分子醫(yī)藥農(nóng)場等研究奠定了基礎，具有極大的應用前景。
文檔編號C12N15/82GK102250905SQ20111019763
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月15日 優(yōu)先權日2011年7月15日
發(fā)明者曲樂慶, 李文靜 申請人:中國科學院植物研究所