專利名稱：水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物生物技術(shù)的最新發(fā)展不僅實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)農(nóng)藝性狀的改良(如提高作物產(chǎn)量，增強(qiáng)抗病、抗蟲、抗除草劑特性，改良品質(zhì)等)，而且使植物成為生物醫(yī)藥和工業(yè)產(chǎn)品的生物反應(yīng)器。絕大多數(shù)禾本科作物具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、耐儲(chǔ)藏、生產(chǎn)規(guī)模容易控制、可直接食用等特點(diǎn)，并且其具備體內(nèi)翻譯后修飾的能力，因而成為第二代轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的理想載體。近年來(lái)利用水稻種子生產(chǎn)具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究發(fā)展很快，且已經(jīng)取得了巨大成功。如維生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有預(yù)防和治療缺鐵性貧血和提高自身免疫功能的大豆鐵蛋白(Ferritin)、具有刺激胰島素分泌預(yù)防糖尿病發(fā)生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉過(guò)敏癥疫苗等均成功地在水稻中表達(dá)并高水平累積。然而，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)必須在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平同時(shí)提高基因表達(dá)。啟動(dòng)子主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)，終止子則在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平同時(shí)起調(diào)控作用。盡管目前廣泛應(yīng)用的終止子，如NOS、0cS，與異源啟動(dòng)子組合后可啟動(dòng)報(bào)告基因在植物中的高表達(dá)，能夠滿足生物化學(xué)、生理學(xué)以及細(xì)胞定位方面的研究需求。然而，對(duì)于其他能夠提高基因表達(dá)的終止子研究較少。由于一些重要農(nóng)藝性狀以及植物次生代謝產(chǎn)物都是由多基因控制，提高單個(gè)基因的表達(dá)對(duì)于相關(guān)性狀改良作用不明顯。通過(guò)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法， 如重復(fù)轉(zhuǎn)化或雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)多基因轉(zhuǎn)化卻費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的多基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以在一個(gè)表達(dá)載體中同時(shí)插入多個(gè)基因，為了避免轉(zhuǎn)基因同源性過(guò)高引起的轉(zhuǎn)基因沉默，這些基因需要由不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)，不同的終止子終止轉(zhuǎn)錄。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一個(gè)終止子，名稱為tCluB-4，該終止子與nos終止子相比，可以提高外源基因的表達(dá)水平。本發(fā)明所提供的終止子，為如下1)或2)或3)的DNA分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列組成的DNA分子；2)與1)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交的分子。所述嚴(yán)格條件可為如下50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0. SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS、0. 5M Na3POjP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，1 X SSC，0. SDS中漂洗；還可為50°C，在 7% SDS,0. 5M Νει3Ρ04 Π ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. 5X SSC, 0. SDS 中漂洗； 還可為50°C，在 7% SDS,0. 5M Na3POjP ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0. IX SSC,0. 1% SDS中漂洗；還可為50°C，在7% SDS,0. 5M Na3PO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交， 在65°C，0. 1XSSC，0. 1% SDS中漂洗；也可為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, 0. 1% SDS 和 1XSSC，0. 1% SDS 各洗膜一次。其中，序列表中序列1由469個(gè)核苷酸組成。含有所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述DNA分子的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pROKII、pBin438、 PCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391_Xa 或 pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司)等。使用所述DNA分子構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在外源基因轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子(如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子⑴biquitin))、組成型啟動(dòng)子或組織特異表達(dá)啟動(dòng)子(如種子特異表達(dá)的啟動(dòng)子)，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的DNA分子構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)外源基因序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工， 如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因， 賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì) methatrexate抗性的dhfr基因，賦予對(duì)草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。所述重組載體具體可為任一如下載體pGluB-3-tGluB-4、pGluC-tGluB-4及 pActin-tGluB-4。所述PGluB-3-tGluB-4是將pGluB-3-nos中的nos終止子替換為序列表序列1所示的tGluB-4終止子得到的重組載體，所述pGluC-tGluB-4是將pGluC_nos中的nos終止子替換為序列表序列1所示的tGluB-4終止子得到的重組載體，所述pActin-tGluB-4是將 pActin-nos中的nos終止子替換為序列表序列1所示的tGluB-4終止子得到的重組載體。所述表達(dá)盒是指由啟動(dòng)子、由所述啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的目的基因和位于所述目的基因下游的所述DNA分子組成的。其中，所述啟動(dòng)子可為組成型啟動(dòng)子或組織特異表達(dá)啟動(dòng)子(如胚乳特異性啟動(dòng)子)。所述目的基因可為蛋白編碼基因和/或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優(yōu)選為品質(zhì)改良基因；所述非蛋白編碼基因?yàn)檎xRNA基因和/或反義RNA 基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將含有所述DNA分子的表達(dá)盒導(dǎo)入目的植物中，得到所述目的基因表達(dá)水平高于將如下表達(dá)盒導(dǎo)入所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物將所述的表達(dá)盒中的所述DNA分子替換為胭脂堿合成酶的nos終止子得到的表達(dá)盒。所述目的植物具體可為單子葉植物或雙子葉植物。
所述單子葉植物具體可為水稻，小麥，玉米，高粱或大麥，所述雙子葉植物具體可為大豆，油菜，棉花，煙草，馬鈴薯，甘薯或油桐。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述含有所述DNA分子的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該含有所述DNA分子的表達(dá)盒，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該含有所述DNA分子的表達(dá)盒轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述DNA分子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用或作為終止子的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。利用本發(fā)明的終止子與不同的啟動(dòng)子配合，可提高外源基因在目的植物中的表達(dá)和累積水平，可改良種子品質(zhì)、將具有生理活性的蛋白或短肽導(dǎo)入種子中創(chuàng)制保健型功能新品種、利用種子作生物反應(yīng)器生產(chǎn)有用外源蛋白或可食性疫苗，增加農(nóng)產(chǎn)品科技附加值等。本發(fā)明的終止子及其應(yīng)用為利用生物技術(shù)改良種子品質(zhì)、分子醫(yī)藥農(nóng)場(chǎng)等研究奠定了基礎(chǔ)，具有極大的應(yīng)用前景。


圖1為從水稻基因組DNA中PCR擴(kuò)增谷蛋白GluB_4基因終止子(tGluB_4)的電泳圖譜。其中1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為tGluB-4的片段。其中，標(biāo)準(zhǔn)分子量大小由下至上依次為0. Ikb,0. 2kb，0. 3kb，0. 4kb，0. 5kb，0. 6kb，0. 7kb，0. 8kb，0. 9kb, 1. Okb, 1. 2kb, 1. 5kb, 2. Okb，3. Okb，4. Okb，5. Okb，6. Okb，8. Okb，10. Okb。圖2為載體pMD-tGluB-4經(jīng)&ic I和EcoR I的雙酶切鑒定圖譜。其中1為DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為pMD-tGluB-4的酶切片段。其中，標(biāo)準(zhǔn)分子量大小由下至上依次為100bp， 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 2000bp, 3000bp, 5000bp,酶切片段由下至上依次為tGluB_4， 469bp ；pMD-tGluB-4 載體框架片段，2700bp。圖3為含有tGluB-4的載體結(jié)構(gòu)示意圖。其中，A圖為PGluB-3-tGluB_4結(jié)構(gòu)示意圖，B圖為pGluC-tGluB-4結(jié)構(gòu)示意圖，C圖為pActin-tGluB-4結(jié)構(gòu)示意圖，GluB_4T為 tCluB-4。圖4為含有tGluB-4的重組載體的雙酶切鑒定圖譜。其中，A圖為 PGluB-3-tGluB-4經(jīng)&ic I和EcoR I雙酶切圖，2代表酶切片段由下至上依次為tGluB_4， 469bp ；pGluB-3-tGluB-4 載體框架片段，16. 6kb ；B 圖為 pGluC_tGluB_4 經(jīng) Sac I 和 EcoR I雙酶切圖，2代表酶切片段由下至上依次為tGluB-4，469bp ；pGluC-tGluB-4載體框架片段，16. 6kb ;C圖為pActin-tGluB-4經(jīng)Sma I和EcoR I雙酶切圖，2代表酶切片段由下至上依次為11Λ的Actin啟動(dòng)子一部分、2. 4kb的⑶S與GluB_4終止子的片段、余下的載體大片段；A-C圖中的1代表標(biāo)準(zhǔn)分子量，其大小由下至上依次為100bp，250bp，500bp，750bp， IOOObp,2000bp,3000bp,5000bp。圖 5 為部分轉(zhuǎn) pGluB-3-tGluB-4、pGluC_tGluB_4 和 pActin-tGluB-4 的 Ttl 代水稻植株嵌合引物PCR擴(kuò)增電泳圖譜。1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2為以PGluB-3-tGluB-4為模板的陽(yáng)性對(duì)照，3為以未轉(zhuǎn)化株系為模板的陰性對(duì)照，4 20為部分轉(zhuǎn)pGluB-3-tGluB-4、 pGluC-tGluB-4及pActin-tGluB-4植物表達(dá)載體的再生植株。圖6為未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake植株⑶S染色結(jié)果。其中，1、2、3、4分別為未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake植株根、莖、葉及種子的染色結(jié)果。圖7為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos植株GUS染色結(jié)果。其中，1、2、3、 4分別為轉(zhuǎn)pGluB-3-nos植株根、莖、葉及種子的染色結(jié)果。圖8為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluB_4植株⑶S染色結(jié)果。其中，1、 2、3、4分別為轉(zhuǎn)PGluB-3-tGluB-4植株根、莖、葉及種子的染色結(jié)果。圖9為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pActin-nos植株⑶S染色結(jié)果。其中，1、2、3、4 分別為轉(zhuǎn)pActin-nos植株根、莖、葉及種子的染色結(jié)果。圖10為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pActin-tGluB-4植株⑶S染色結(jié)果。其中，1、 2、3、4分別為轉(zhuǎn)pActin-tGluB-4植株根、莖、葉及種子的染色結(jié)果。圖11為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluB-4所結(jié)種子的⑶S熒光活性測(cè)
定結(jié)果。圖12為T1代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluB-4所結(jié)種子的⑶S熒光活性測(cè)
定結(jié)果。圖13為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluC-tGluB-4所結(jié)種子的⑶S熒光活性測(cè)定結(jié)果。圖14為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pActin-tGluB-4所結(jié)種子的⑶S熒光活性測(cè)
定結(jié)果。圖15為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pActin-tGluB-4植株莖稈中的⑶S熒光活性測(cè)定結(jié)果。圖16為Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pActin-tGluB-4植株葉片中的⑶S熒光活性
測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子(tGluB-4)的獲得根據(jù)水稻谷蛋白GluB-4基因的cDNA序列(GenBank號(hào)為X14393)，從GenBank中查找谷蛋白GluB-4基因的基因組DNA序列，終止密碼子后469bp的序列即為本發(fā)明的水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子(tGluB-4)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增tGluB-4。為便于載體構(gòu)建，在引物上分別添加酶切位點(diǎn)(下劃線所示)。tGluB-4的正向引物為tGluB-4SacF 5' GGAGCTC GAATTCAAGGGCTATCTTCC-3 ‘ (Sac I)，反向引物為 tGluB_4EcoR 5 ‘ -AGAATTCTGTACTAATGAA ATAGTAT-3‘ (EcoR I)。CTAB 法從野生型水稻 Kitaake (文獻(xiàn) Qu et al.，J. Exp. Bot. 2008,59 :2417-2424) 葉片中小量提取基因組DNA,以其為模板，以tGluB-4 SacF和tGluB-4 EcoR為引物，PCR 擴(kuò)增tGluB-4序列。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，然后94°C 30sec，55°C 30sec, 72°C lmin，30個(gè)循環(huán)，最后72°C IOmin0 PCR擴(kuò)增得到469bp的目的條帶，如圖1所示?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，直接連接到PMD18-T載體(購(gòu)自TaKaRa公司)上，進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的tGluB-4序列大小為469bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列。將測(cè)序檢測(cè)表明含有tGluB-4片段的重組載體命名為pMD-tGluB-4。pMD_tGluB_4經(jīng)&ic I和EcoR I的雙酶切鑒定圖譜如圖2所示。實(shí)施例2、水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子(tGluB_4)的載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化1、tGluB-4融合⑶S基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建用&ic I禾Π EcoR I雙酶切pMD-tGluB-4質(zhì)粒，回收tGluB-4的469bp酶切片段， 將該片段分別插入到含有GluB-3啟動(dòng)子的pGluB-3-nos、含有GluC啟動(dòng)子的pGluC-nos和含有Actin啟動(dòng)子的pActin-nos的McI和EcoR I雙酶切識(shí)別位點(diǎn)之間構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)化載體PGluB-3-tGluB-4(其結(jié)構(gòu)示意圖如圖3A所示)、pGluC-tGluB_4 (其結(jié)構(gòu)示意圖如圖所示)和pActin-tGluB-4(其結(jié)構(gòu)示意圖如圖3C所示)。以上3種重組質(zhì)粒載體的雙酶切鑒定圖譜如圖4。pGluB-3-nos、pGluC—nos 禾口 pActin—nos 按照文獻(xiàn) Qu et al.，J. Exp. Bot. 2008， 59 =2417-2424所述的方法構(gòu)建以水稻臺(tái)中65的基因組DNA為模板，以GluB_3正向引物 5，-CCCAAGCTTATTTTACTTGTACTGTTTAACC-3‘ (HindIII)和 GluB-3 反向引物 5，AAACCCG GGAGCTTTCTGTATATGCTAATG-3‘ (SmaI)為引物，PCR 擴(kuò)增得到 GluB-3 啟動(dòng)子，將 GluB-3 啟動(dòng)子用 HindIII 和 SmaI 雙酶切，插入到 pGPTV_35S_HPT(Qu et al.，J. Exp. Bot. 2008,59 2417-2424)的GUS上游的HindIII和SmaI位點(diǎn)，得到的重組載體即為pGluB-3-nos。以水稻臺(tái)中65的基因組DNA為模板，以GluC正向引物5’GGGAAGCTTGTTCAAGATTTATTTTTGG-3’ ( HindIII)和 GluC 反向引物 5，-ACGCGTCGACAGTTATTCACTTAGTTTCCC-3‘ (Sail)為引物，PCR 擴(kuò)增得到GluC啟動(dòng)子，將GluC啟動(dòng)子用HindIII和MlI雙酶切，插入到pGPTV-35S_HPT的 GUS上游的HindIII和SalI位點(diǎn)，得到的重組載體即為pGluC-nos。以水稻臺(tái)中65的基因組 DNA 為模板，以 Actin 正向引物 5，-AAAAGCTTTAGCTAGCATACTCGA-3’ (HindIII)和 Actin 反向引物 5，-AATCTAGAGATATCCTCGGCGTCA-3’ (XbaI)為引物，PCR 擴(kuò)增得到 Actin 啟動(dòng)子， 將Actin啟動(dòng)子用HindIII和)(bal雙酶切，插入到pGPTV_35S_HPT的GUS上游的HindIII 和XbaI位點(diǎn)，得到的重組載體即為pActin-nos。pGPTV-35S_HPT以⑶S為外源基因，nos為終止子。2、轉(zhuǎn) pGluB-3-tGluB-4, pGluC_tGluB_4、pActin_tGluB_4、pGluB-3-nos、 pGluC-nos及pActin-nos水稻再生植株的獲得構(gòu)建完成的pGluB-3-tGluB-4、pGluC_tGluB_4 及 pActin-tGluB-4 表達(dá)載體經(jīng)過(guò)酶切與測(cè)序驗(yàn)證其正確后，利用凍融法分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，具體方法如下吸取 7 μ 1表達(dá)載體質(zhì)粒加入100 μ 1 ΕΗΑ105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻后置于液氮中冷凍 7min，之后轉(zhuǎn)入37°C水浴中靜置3min，然后加入SOOulYEB液體培養(yǎng)基于靜置恢復(fù)培養(yǎng)3 5小時(shí)，取400 μ 1菌液涂布于YEB抗性平板上(卡那霉素50mg/L，利福平RiKOmg/ L)，于倒置培養(yǎng)2 3天。挑取少許農(nóng)桿菌單菌落進(jìn)行目標(biāo)基因的菌落PCR檢測(cè)后將陽(yáng)性菌落在YEB抗性平板上劃線擴(kuò)繁培養(yǎng)，利用農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化水稻品種kitaake的愈傷組織，用潮霉素篩選抗性愈傷，并進(jìn)一步培養(yǎng)分化成幼苗后移栽溫室。利用潮霉素篩選方法(按照文獻(xiàn)Hiei et al.，Plant J. 1994，6 :271-282所述方法進(jìn)行)，獲得7株Ttl代轉(zhuǎn)PGluB-3-tGluB-4水稻植株、10株Ttl代轉(zhuǎn)pGluC-tGluB_4水稻植株及2株pActin-tGluB-4水稻植株。利用PCR方法對(duì)上述篩選得到的轉(zhuǎn)PGluB-3-tGluB_4 水稻、轉(zhuǎn)pGluC-tGluB-4水稻及轉(zhuǎn)pActin-tGluB-4水稻進(jìn)行PCR分子檢測(cè)，PCR引物為tGluB-4和GUS基因序列的嵌合引物，即:tGluB-4序列反向引物tGluB_4EcoR 5 ‘ -AGAATTC TGTACTAATGAAATAGTAT-3 ‘禾Π GUS 序列內(nèi)部的正向弓丨物 GUSF185 5 ‘ -TCGTCGGTGAACAGGTATGG-3 ‘。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?MV 預(yù)變性 5min，然后 94 °C 30sec, 55°C 30sec,72°C lmin，30個(gè)循環(huán)，最后72 °C IOmin0 PCR擴(kuò)增得到0. 71Λ的目的條帶即為檢測(cè)陽(yáng)性(如圖5所示)。結(jié)果表明7株轉(zhuǎn)PGluB-3-tGluB-4植株(表示為Kitaake/ pGluB-3-tGluB-4) PCR 檢測(cè)均呈陽(yáng)性，10 株轉(zhuǎn) pGluC-tGluB-4 植株(表示為 Kitaake/ pGluC-tGluB-4)及 2 株轉(zhuǎn) pActin-tGluB-4 植株(表示為 Kitaake/pActin-tGluB-4) PCR 檢測(cè)均呈陽(yáng)性。按照上述方法，將pGluB-3-nos、pGluC-nos及pActin-nos分別轉(zhuǎn)入野生型水稻 Kitaake,得到 9 株轉(zhuǎn) pGluB-3-nos 的陽(yáng)性植株(表示為 Kitaake/pGluB-3-nos)，10 株轉(zhuǎn) pGluC-nos的陽(yáng)性植株(表示為Kitaake/pGluC-nos)和7株轉(zhuǎn)pActin-nos的陽(yáng)性植株(表示為 Kitaake/pActin-nos)。轉(zhuǎn) pGluB_3_nos、pGluC_nos 禾口 pActin_nos 白勺^K禾白勺 PCR 檢測(cè)方法以tnos序列反向引物tnosR 5' -GATCTAGTAACATAGATGAC-3‘和GUS序列內(nèi)部的正向引物GUSF185 5' -TCGTCGGTGAACAGGTATGG-3‘為引物，擴(kuò)增tnos和GUS基因的嵌合序列，得到500bp的目的條帶即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株。T0代轉(zhuǎn)基因植株所結(jié)的種子和由該種子長(zhǎng)成的植株為T1代，依此類推，T2、T3分別表示轉(zhuǎn)基因植株第2代和第3代。實(shí)施例3、水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子(tGluB_4)的功能驗(yàn)證UT0代轉(zhuǎn)基因水稻的⑶S組織化學(xué)檢測(cè)對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/ pGluB-3-tGluB-4、Kitaake/pActin-nos 和 Kitaake/pActin-tGluB-4 的 Ttl 代植株進(jìn)行組織化學(xué)染色，以未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake植株為對(duì)照。具體步驟為將轉(zhuǎn)基因水稻 Kitaake/pGluB-3-nos 禾口 Kitaake/pGluB-3-tGluB_4、Kitaake/pActin-nos 禾口 Kitaake/ pActin-tGluB-4的Ttl代植株和未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake植株的部分葉片、根、莖桿組織切成小塊；將開(kāi)花后17天的灌漿期種子用解剖刀從中部縱切開(kāi)。將處理好的樣品浸泡于GUS染色反應(yīng)液(0. IM磷酸鈉緩沖液(pH 7. 0)，IOmM Na2-EDTA (pH7. 0)，5mM鐵氰化鉀， 5mM 亞鐵氰化鉀，1. OmM X-Gluc, 0. 1% Triton X-100)，37°C反應(yīng) 0. 5-4 小時(shí)。70% 乙醇中保存、觀察。體視鏡下觀察并拍照。結(jié)果如圖6-10所示未轉(zhuǎn)基因的野生型水稻Kitaake 植株的根、葉片、莖桿和開(kāi)花后17天的種子的糊粉層和亞糊粉層均未觀察到GUS表達(dá)(圖 6) ；T0 代轉(zhuǎn)基因水稻 Kitaake/pGluB-3-nos 和 Kitaake/pGluB-3-tGluB_4 植株的根、葉片、 莖桿均未觀察到⑶S表達(dá)(圖7，圖8)，Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos開(kāi)花后17 天的種子僅在糊粉層和亞糊粉層有所表達(dá)，而Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-tGluB-4 的糊粉層、亞糊粉層及整個(gè)胚乳藍(lán)色均清晰可見(jiàn)表達(dá)。結(jié)果表明tGluB-4與nos終止子相比增強(qiáng)了葡萄糖苷酸酶(GUQ報(bào)告基因在水稻種子胚乳中的表達(dá)強(qiáng)度，但并未改變 ⑶S報(bào)告基因在胚乳中的特異性表達(dá)。Ttl代轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pActin-nos和Kitaake/ pActin-tGluB-4植株的根莖葉片均能觀察到⑶S表達(dá)，但是強(qiáng)度基本相似，而種子中則 Kitaake/pActin-tGluB-4 的 GUS 表達(dá)強(qiáng)度強(qiáng)于 Kitaake/pActin-nos，說(shuō)明 tGluB-4 與 nos 終止子相比能夠增強(qiáng)⑶S基因在水稻胚乳中的表達(dá)(圖9，圖10)。2、T0及T1代轉(zhuǎn)基因水稻的⑶S熒光活性測(cè)定對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因水稻Kitaake/pGluB-3-nos和Kitaake/PGluB-3-tGluB-4的Ttl代及T1代植株開(kāi)花后17天的灌漿期種子、Kitaake/pGluC-nos和 Kitaake/pGluC-tGluB-4的Ttl代植株開(kāi)花后17天的灌漿期種子及Kitaake/pActin-nos 和Kitaake/pActin-tGluB-4的Ttl代植株根、莖、葉片及開(kāi)花后17天的灌漿期種子進(jìn)行 ⑶S定量分析。方法按照J(rèn)efferson等的熒光檢測(cè)方法(Jefferson，Plant Mol. Biol. Report, 1987, 5 :387-405)進(jìn)行。具體為每株分別取種子或者根、莖、葉片，分別置于3 個(gè)1. 5ml印pendorf管中，用研棒將其碾碎，加入200 μ 1抽提液(50mM磷酸鈉緩沖溶液 (ρΗ7· 0)，IOmM β -巰基乙醇，IOmM Na2EDTA (ρΗ 8. 0) ,0. 1% SDS, 0. 1% TritonX-100)，振蕩混勻。4113，000卬111離心51^11，取上清于新管中。10 μ 1上清，加入90 μ 1反應(yīng)液(ImM 4-MUG溶于⑶S抽提液)，37°C反應(yīng)60分鐘，加入900 μ 1終止液(0. 2Μ Na2CO3)，室溫終止反應(yīng)。以4-MU做標(biāo)準(zhǔn)曲線，用F-4500 (日立)型熒光分光光度計(jì)在360nm激發(fā)波長(zhǎng)和460nm 吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)相對(duì)4-MU含量。以牛血清白蛋白為對(duì)照，利用BIO-Rad Protein Assay Kit II (購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司，編號(hào)GPR6611)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的7個(gè)Ttl代Kitaake/pGluB-3-tGluB-4所結(jié)種子進(jìn)行GUS活性測(cè)定(結(jié)果如圖11所示)。⑶S活性最高值為36.71pmol 4-MU mirT1 μ g—1蛋白，最低值為 16. 56pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 27. 8士7. 3pmol 4-MU mirr^g—蛋白。而 9 個(gè)對(duì)照 Kitaake/pGluB-3-nos 的 T0 株系中，GUS 活性最高值為 17. 38pmol 4-MUmirT1 μ 蛋白，最低值為 2. 39pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 11. 2士5. Opmol 4-MUmirT1 μ 蛋白。轉(zhuǎn)PGluB-3-tGluB-4載體的7個(gè)株系⑶S表達(dá)量均大于或者等于轉(zhuǎn)pGluB-3-nos植株最大值，前者最大值是后者最大值的2. 1倍，是其最小值的15. 33倍，平均值為對(duì)照平均值的2. 5倍。對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的5個(gè)T1代Kitaake/pGluB-3-tGluB_4所結(jié)種子進(jìn)行⑶S活性測(cè)定(結(jié)果如圖12所示)。⑶S活性最高值為54. 72pmol 4-MU mirT1 μ g—1蛋白，最低值為 9. 69pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 39. 5士 17. 3pmol 4-MU mirT、蛋白。而 7 個(gè)對(duì)照 Kitaake/pGluB-3-nos 的 T1 株系中，則 GUS 活性最高值為 21. 52pmol 4-MUmirT1 μ
蛋白，最低值為 2. 82pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白，平均值為 9. 9 士 5. 8pmol 4-MUmirT1 μ 蛋白。前者平均值為后者的3. 98倍。對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的10個(gè)Ttl代Kitaake/pGluC-tGluB-4所結(jié)種子進(jìn)行⑶S活性測(cè)定(結(jié)果如圖13所示)。⑶S活性最高值為48. 82pmol 4-MU mirT1 μ g—1蛋白，最低值為 22. 07pmol 4-MU mirT1 μ g-1 蛋白，平均值為 38. 8士8. 3pmol 4-MU mirT1 μ g-1 蛋白。而 10 個(gè)對(duì)照 Kitaake/pGluC-nos 的 Ttl 株系中，GUS 活性最高值為 51. 65pmol 4-MU mirT1 μ g-1 蛋白， 最低值為 5. 17pmol 4-MU mirT1 μ g-1 蛋白，平均值為 23. 36士 13. 77pmol 4-MUmirT1 μ 蛋白。前者平均值為后者平均值的1. 66倍。對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的2個(gè)Ttl代Kitaake/pActin-tGluB-4所結(jié)種子、植株莖桿和葉片進(jìn)行GUS活性測(cè)定(結(jié)果如圖14，15，16)，種子GUS活性平均值為3. 8 士 2. 4pmol4-MU mirT1 μ g—1蛋白；莖桿GUS活性平均值為5. 9 士 0. 8pmol 4-MU mirT1 μ g—1蛋白；葉片GUS活性值分別為 3. 1,1. 27pmol 4-MU mirT1 μ g—1 蛋白。而 7 個(gè)對(duì)照 Kitaake/pActin-nos 的 T0 株系中，種子⑶S活性平均值為1.75士0.8pmol 4-MU mirT1 μ g—1蛋白；植株莖桿⑶S活性平均值為 5. 1 士4. 7pmol 4-MU mirT1 μ 蛋白；葉片 GUS 活性最高值為 2. 22pmol 4-MU mirT1 μ
蛋白，最低值為0.05pmol 4-MU mirr^g—1蛋白。前者種子平均值為后者的2. 18倍；前者莖桿平均值與后者沒(méi)有明顯差別；前者葉片與后者差異不明顯。 結(jié)果表明，tGluB-4與nos終止子相比增強(qiáng)了外源基因在水稻胚乳中的表達(dá)水平。
權(quán)利要求
1.DNA分子，其特征在于所述DNA分子為如下1)或2)或3)的分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列組成的DNA分子；2)與1)限定的DNA的序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性的分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交的分子。
2.含有權(quán)利要求1所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒，其特征在于所述表達(dá)盒由啟動(dòng)子、由所述啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的目的基因和位于所述目的基因下游的權(quán)利要求1所述的DNA分子組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒，其特征在于所述啟動(dòng)子為組成型表達(dá)啟動(dòng)子或組織特異表達(dá)啟動(dòng)子，所述組織特異表達(dá)啟動(dòng)子為胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的表達(dá)盒，其特征在于所述目的基因?yàn)榈鞍拙幋a基因和/ 或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優(yōu)選為品質(zhì)改良基因；所述非蛋白編碼基因?yàn)檎x RNA基因和/或反義RNA基因。
6.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求3-5中任一所述的表達(dá)盒導(dǎo)入目的植物中，得到所述目的基因表達(dá)水平高于將如下表達(dá)盒導(dǎo)入所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物將權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒中的權(quán)利要求1所述的DNA分子替換為nos終止子得到的表達(dá)盒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述單子葉植物為水稻，小麥，玉米，高粱或大麥，所述雙子葉植物為大豆，油菜，棉花，煙草，馬鈴薯，甘薯或油桐。
9.權(quán)利要求1所述的DNA分子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的DNA分子作為終止子的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種水稻種子谷蛋白GluB-4基因終止子及其應(yīng)用。該終止子為一種DNA分子，為如下1)或2)或3)的分子1)由序列表中序列1所示的核苷酸序列組成的DNA分子；2)與1)限定的DNA的序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交的分子。利用本發(fā)明的終止子與不同的啟動(dòng)子配合，可提高外源基因在目的植物中的表達(dá)和累積水平，為利用生物技術(shù)改良種子品質(zhì)、分子醫(yī)藥農(nóng)場(chǎng)等研究奠定了基礎(chǔ)，具有極大的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N7/01GK102260674SQ20111019762
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月15日
發(fā)明者曲樂(lè)慶, 李文靜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所