專利名稱：利用脂肪酸生物合成途徑的脂肪酸含量改善用異種大腸桿菌及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂肪酸生物合成途徑的過量表達(dá)用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的制備方法及利用上述制備方法制造的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌。
背景技術(shù)：
使用化石燃料時(shí)大量排放地球暖化氣體及廢棄物，從而給人類帶來了嚴(yán)重的環(huán)境危機(jī)。因此，迫切需要開發(fā)能夠替代基于化石燃料的化學(xué)工業(yè)，亦即，以盡量減少有害于人類的廢棄物的生產(chǎn)及能源消耗的生物物質(zhì)作為原料的新環(huán)保生物工藝。生物乙醇、生物柴油、生物氣(biogas)、丁醇作為生物能(Bioenergy)而受到人們重視，上述的生物能雖然都能作為發(fā)電或運(yùn)輸用燃料使用，但因?yàn)樗鼈冊(cè)趯?shí)際應(yīng)用與生產(chǎn)方法上的若干缺點(diǎn)而使得作為新再生能源的烴(hydrocarbon)形態(tài)的化合物日益受到關(guān)注。因此，能夠以代謝產(chǎn)物的 方式生成長鏈脂肪酸(long chain fatty acid)的重組菌株也日益受到人們關(guān)注。銅綠假單抱菌(Pseudomonas aeruginosa)是綠胺桿菌，1882年由Gessard在綠色的膿汁發(fā)現(xiàn)，由于形成綠色而被稱為綠膿桿菌。綠膿桿菌廣泛存在于自然界，可以從膿、咳痰、糞便、尿、膽汁、子宮分泌物、血、脊髓液等分離。銅綠假單孢菌綠膿桿菌的形態(tài)為革蘭陰性桿菌，培養(yǎng)時(shí)形成類似于莢膜的細(xì)胞外多糖粘質(zhì)層。形成類似于莢膜的細(xì)胞外多糖粘質(zhì)層。它是一種對(duì)自然界具有強(qiáng)大適應(yīng)能力的微生物。該菌生長所需營養(yǎng)條件非常單純?；撔枣溓蚓?Streptococcus pyogenes)能夠引起肺炎、咽喉炎、急性腎炎、毒性休克癥候群之類的疾病。脂肪酸(fatty acid)是具有I個(gè)羧基(-C00H)的烴鏈的羧酸，表示鏈狀I(lǐng)價(jià)羧酸(Carboxylic acid)。由于水解脂肪時(shí)生成而使用該名稱。脂肪酸分子由烴鏈(hydrocarbonchain)構(gòu)成，烴在碳的基本架構(gòu)上以側(cè)鏈鏈接氫并且在一端附著羧基。在生體內(nèi)部，脂肪酸可由脂肪酸循環(huán)(fatty acid cycle)分解或合成。該循環(huán)以2個(gè)碳為單位合成或分解脂肪酸，因此存在于自然界的脂肪酸幾乎大部分以雙數(shù)碳數(shù)形成。微生物生體內(nèi)起自糖的脂肪酸生物合成的第一個(gè)步驟從乙酰輔酶A(acetyl-CoA)開始，之后以兩個(gè)碳原子為單位連接到烴鏈而拉長鏈。在細(xì)胞質(zhì)中由乙酰輔酶A羧化而生成作為脂肪酸生物合成中重要中間物的丙二酰-輔酶A(malonyl-CoA)。該反應(yīng)由乙酰輔酶A羧酶(carboxylase)復(fù)合體催化,該復(fù)合體由三個(gè)酶構(gòu)成,為了酶活性,不僅需要ATP,還需要Mn2+與蛋白生物素(Biotin)。丙二酰-輔酶A的丙二酰基(Group)里的三個(gè)碳原子中兩個(gè)在生物合成反應(yīng)的每個(gè)步驟添加到脂肪酸鏈。與丙二酰-輔酶A的形成相同地，該反應(yīng)需要位于細(xì)胞質(zhì)且沒有與膜結(jié)合的多酶復(fù)合體。由個(gè)別酶構(gòu)成的該復(fù)合體指的是脂肪酸合成酶。作為該脂肪酸合成酶復(fù)合體的一部分，酰基載體蛋白質(zhì)(acyl carrier protein ACP)參與到增加脂肪酸(fatty acid)碳數(shù)的結(jié)合。
權(quán)利要求
1.一種脂肪酸過量表達(dá)用大腸桿菌，由表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因，該表達(dá)載體包括選自下列組的至少一個(gè)核苷酸序列 (a)編碼銅綠假單孢菌的乙酰輔酶A羧酶羧基轉(zhuǎn)移酶阿爾法亞基的核苷酸序列、 (b)編碼銅綠假單孢菌的丙二酰-輔酶A-[?；d體蛋白質(zhì)]轉(zhuǎn)酰酶的核苷酸序列、及 (c)編碼化膿性鏈球菌的酰基-?；d體蛋白質(zhì)硫酯酶的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂肪酸過量表達(dá)用大腸桿菌，其特征在于， 上述脂肪酸過量表達(dá)用大腸桿菌由包括下列核苷酸序列的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化而成(a)編碼銅綠假單孢菌的乙酰輔酶A羧酶羧基轉(zhuǎn)移酶阿爾法亞基的核苷酸序列、及(b)編碼銅綠假單孢菌的丙二酰-輔酶A-[?；d體蛋白質(zhì)]轉(zhuǎn)酰酶的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂肪酸過量表達(dá)用大腸桿菌，其特征在于， 上述脂肪酸過量表達(dá)用大腸桿菌由包括編碼化膿性鏈球菌的?；??；d體蛋白質(zhì)硫酯酶的核苷酸序列的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂肪酸過量表達(dá)用大腸桿菌，其特征在于， 上述脂肪酸過量表達(dá)用大腸桿菌由包括下列核苷酸序列的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化而成(a)編碼銅綠假單孢菌的乙酰輔酶A羧酶羧基轉(zhuǎn)移酶阿爾法亞基的核苷酸序列、(b)編碼銅綠假單孢菌的丙二酰-輔酶A-[?；d體蛋白質(zhì)]轉(zhuǎn)酰酶的核苷酸序列、及(c)編碼化膿性鏈球菌的?；??；d體蛋白質(zhì)硫酯酶的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂肪酸過量表達(dá)用大腸桿菌，其特征在于， 上述表達(dá)載體是具有圖2所示基因地圖的大腸桿菌-綠膿桿菌穿梭載體PUCP19，上述核苷酸序列插入PUCP19的MCS。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂肪酸過量表達(dá)用大腸桿菌，其特征在于， 上述乙酰輔酶A羧酶羧基轉(zhuǎn)移酶阿爾法亞基由記載為編碼1的氨基酸序列構(gòu)成，上述丙二酰-輔酶A-[酰基載體蛋白質(zhì)]轉(zhuǎn)酰酶由記載為編碼3的氨基酸序列構(gòu)成，上述酰基-?；d體蛋白質(zhì)硫酯酶由記載為編碼5的氨基酸序列構(gòu)成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂肪酸過量表達(dá)用大腸桿菌，其特征在于， 編碼上述乙酰輔酶A羧酶羧基轉(zhuǎn)移酶阿爾法亞基的核苷酸序列由記載為編碼2的鹽基順序構(gòu)成，編碼上述丙二酰-輔酶A-[?；d體蛋白質(zhì)]轉(zhuǎn)酰酶的核苷酸序列由記載為編碼4的鹽基順序構(gòu)成，編碼上述?；??；d體蛋白質(zhì)硫酯酶的核苷酸序列由記載為編碼6的鹽基順序構(gòu)成。
8.一種脂肪酸過量表達(dá)用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的制備方法，包括下列步驟(a)到步驟(b) (a)把選自下列i)到iii)所構(gòu)成的組中一個(gè)以上的核苷酸序列插入表達(dá)載體的步驟；及 i)編碼銅綠假單孢菌的乙酰輔酶A羧酶羧基轉(zhuǎn)移酶阿爾法亞基的核苷酸序列， )編碼銅綠假單孢菌的丙二酰-輔酶A-[?；d體蛋白質(zhì)]轉(zhuǎn)酰酶的核苷酸序列，及 iii)編碼化膿性鏈球菌的?；?酰基載體蛋白質(zhì)硫酯酶的核苷酸序列， (b)利用插入了上述核苷酸序列的表達(dá)載體讓大腸桿菌轉(zhuǎn)基因的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的脂肪酸過量表達(dá)用轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的制備方法，其特征在于，表達(dá)上述大腸桿菌的步驟(b)由電擊方法實(shí)行。
10.一種脂肪酸生物合成方法，包括下列步驟 (a)培養(yǎng)權(quán)利要求I到權(quán)利要求7的任一項(xiàng)所述的大腸桿菌并生物合成脂肪酸的步驟；及 (b)收取上述步驟(a)的生物合成的脂肪酸的步驟。
11.權(quán)利要求I到權(quán)利要求7的任一項(xiàng)所述的大腸桿菌應(yīng)用于脂肪酸生物合成的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種把參與脂肪酸生物合成途徑的酶予以加密的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的脂肪酸過量表達(dá)用大腸桿菌及其制備方法。本發(fā)明的脂肪酸過量表達(dá)用大腸桿菌不僅遺傳穩(wěn)定性優(yōu)異，還因?yàn)榛A(chǔ)物質(zhì)通過兩種途徑被誘導(dǎo)向脂肪酸循環(huán)而大幅提高了脂肪酸過量表達(dá)效果。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102939374SQ201180020272
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月22日
發(fā)明者李辰遠(yuǎn), 李善熙, 全恩英 申請(qǐng)人:西江大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)