專(zhuān)利名稱(chēng)：一種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3基因的cRNA 原位雜交探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種探針及其設(shè)計(jì)方法，尤其是一種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3基因cRNA原位雜交的探針及其制備方法。
背景技術(shù)：
谷氨酸是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在體內(nèi)主要與親離子性和親代謝性?xún)煞N谷氨酸受體家族結(jié)合發(fā)揮活化作用。谷氨酸如果在細(xì)胞外濃度過(guò)高，過(guò)度興奮谷氨酸受體可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，由于細(xì)胞外沒(méi)有能分解谷氨酸的酶，釋放的谷氨酸幾乎完全依賴(lài)神經(jīng)元以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(EAAT)的攝取來(lái)保持濃度的相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)EAAT也為體內(nèi)很多代謝途徑提供谷氨酸來(lái)源。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分高親合力和低親合力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白兩種，高親合力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都作用于依賴(lài)鈉-鉀的L-谷氨酸，L-和 D-天冬氨酸，所以也稱(chēng)為鈉-鉀谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Excitatory amino acid transporter，EAAT)。目前已有五種被克隆，它們是它們是谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1 (EAAT1 或 GLAST, Glutamate-aspartate transporter)，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 _2 (EAAT2 或 GLT, glial glutamate transporter),SSS -3 (EAAT3EAAC, excitatory amino acid Carrier)，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4 (EAAT4)和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白_5 (EAAT5)。在形態(tài)學(xué)研究方面，關(guān)于谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3基因在活體動(dòng)物中mRNA水平的檢測(cè)顯示尚屬空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3基因cRNA原位雜交的探針及其設(shè)計(jì)方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)解決的一種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3基因cRNA原位雜交的探針，該探針的序列為5 ‘ GCTGTGCGGAAGAAAAGAACCACGTGGACAAGAGGATCACAAGATTTGTGCTGCCCGTCGGCGCCA CCATCAACATGGACGGCACTGCGCTCTATGAAGCCGTGGCAGCTGTGTTCATTGCGCAGCTGAACGGCATGGACCTG-AGCATTGGGCAGATCATCACGATCAGCATCACAGCCACCGCTGCTAGCATTGGAGCTGCCGGTGTGCCCCAGGCTGG CCTGGTGACCATGGTGATCGTGTTGAGTGCCGTGGGGCTGCCTGCTGAGGACGTCACCCTCATCATTGCCGT 3‘。所述探針的制備方法(1)根據(jù)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的Gene bank序列我們?cè)O(shè)計(jì)了谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白_3特異的引物，并且此對(duì)引物擴(kuò)增出的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3片段作為谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3 特異的探針序列；(2)構(gòu)建谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA原位雜交的探針質(zhì)粒；將探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序；(3)制備谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA原位雜交探針；(4)檢測(cè)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA探針的原位雜交。
所述步驟(1)中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3特異的引物是上游引物是5' GCTGTGCGGAAGAAAAGAAC 3'；下游引物是5' ACGGCAATGATGAGGGTGAC 3'。所述步驟(2)按照如下步驟進(jìn)行(a)將大鼠的cDNA用設(shè)計(jì)的弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(b)將PCR產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；(c)將回收后的產(chǎn)物于4°C與多克隆位點(diǎn)兩端具有T7，SP6啟動(dòng)子的載體進(jìn)行連接；(d)將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序。所述步驟(3)按照如下步驟進(jìn)行(a)步驟O)的到的細(xì)菌測(cè)序正確后，經(jīng)判斷確認(rèn)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3探針序列插入載體的順序是正向的；(b)需要使用BamH I限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切；(c)將酶切產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；(d)用SP6 RNA聚合酶對(duì)探針進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記。所述步驟(4)按照如下步驟進(jìn)行(a)將大鼠用0.4%戊巴比妥鈉深麻后，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，用0. Olmol/ L的DEPC-PBS的快速?zèng)_洗去除血液，再以4 %多聚甲醛灌注固定；所述的0. 0 Imo 1 /L DEPC-PBS是2. 9克磷酸氫二鈉，0. 29克磷酸二氫鈉，9. 0克氯化鈉用超純水定容至IL后，再加入體積百分比為0. 的DEPC Iml放置過(guò)夜后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述4% 的多聚甲醛是40. 0克多聚甲醛加入500. Oml蒸餾水加熱使之解聚溶解后，再加入500. Oml 的0. 2mol/L PB緩沖液定容至1000ml。所述0. 2mol/L PB緩沖液是用29. 01克磷酸氫二鈉，2. 96克磷酸二氫鈉加超純水定容至500ml配制而成。(b)取材后進(jìn)行腦組織的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定M小時(shí)；(c)將固定好的組織進(jìn)行切片將組織切成25 30 μ m組織切片，并將切好的切片保存于0. 01mol/L的DEPC-PBS中，放于4°C冰箱備用；(d)將切好的組織片用0. 01mol/L的DEPC-PBS清洗1次，室溫，每次5-10分鐘；(e)將上述清洗過(guò)的片子用5 χ SSC清洗2次，室溫，每次5-10分鐘；所述5 χ SSC 是由20 χ SSC用超純水稀釋的，20 χ SSC為一種檸檬酸緩沖液。(f)將5 χ SSC清洗后的組織片浸入預(yù)雜交液中，于55°C，在雜交爐孵育1-2 小時(shí)；所述預(yù)雜交液是由5ml的去離子甲酰胺，2.5ml的20 χ SSC溶液，200 μ 1的50 χ Denhardt，s溶液，50 μ 1的濃度為200mg/ml的H印arin溶液，100 μ 1的濃度為10mg/ml的 tRNA溶液，100 μ 1的濃度為10 %的CHAPS溶液，100 μ 1的濃度為10 %的Tween-20溶液， 100 μ 1的濃度為0. 5mol/L的ρΗ8. 0的EDTA溶液和1. 85ml的DEPC-H2O混合配制而成。所述 50 χ Denhardt，s為一種常用的雜交試劑；所述200mg/ml的!feparin為200mg的!feparin 粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10mg/ml的tRNA為IOmg的tRNA粉末溶于Iml 的DEPC-H20中配制而成；所述10%的CHAPS為Ig的CHAPS溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10%的Tween-20為100 μ 1的Tween-20溶于900 μ 1的DEPC-H20中配制而成； 所述0. 5mol/L的pH8. 0的EDTA為186. Ig 二水乙二胺四乙酸二鈉加入800ml的DEPC-H20中在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)pH值至8. 0然后定容至IL配制而成高壓滅菌備用；所述DEPC-H2O為IL超純水加入體積百分比為0. 1 %的DEPC 1ml，放置過(guò)夜并高壓滅菌處理后的水。(g)將預(yù)雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55°C，在雜交爐中孵育16-20小時(shí)；所述雜交液是上述預(yù)雜交液中加入終濃度為1. Oug/ml的cRNA探針配置成的。(h)雜交后用1 χ SSC洗滌雜交的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘；(i)用2 χ SSC洗滌上述的組織切片，37°C，2次，每次10-15分鐘；(j)用 10ug/ml 的 RNase A 處理，37°C，1 次，每次 30-40 分鐘；(k)用2 χ SSC洗滌上述的組織切片，室溫，1次，每次10分鐘；(1)用0. Olmol/L PBS洗滌上述的組織切片，室溫，1次，每次10分鐘；所述 0. 01mol/L PBS是2. 9克磷酸氫二鈉，0. 29克磷酸二氫鈉，9. 0克氯化鈉用超純水定容至IL 配置的磷酸緩沖液。(m)按1 2000的抗體效價(jià)，在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗體，對(duì)洗滌后的組織切片進(jìn)行孵育，室溫，放置過(guò)夜；(η)將經(jīng)過(guò)上步抗體孵育的組織片用0. Olmol/L PBS洗滌，于室溫，清洗3次，每次 10-15分鐘；(ο)用TS9. 5洗滌上述PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，每次15-20分鐘；所述TS9. 5為是由終濃度為摩爾濃度為0. lmol/L Tris-HCl (PH9. 5)，摩爾濃度為0. lmol/L NaCl溶液和摩爾濃度為50mmol/L MgCL2用超純水配制而成；(ρ)將上述切片放于NBT-BCIP反應(yīng)液中避光孵育4 6小時(shí)，在此過(guò)程中觀察切片呈色強(qiáng)度；所述NBT-BCIP是一種Roche公司生產(chǎn)的呈色反應(yīng)液。(q)當(dāng)呈色完成后，將切片用PBS清洗3次，室溫，每次10-15分鐘；(r)將上述洗滌后切片表于載玻片上；(s)晾干切片，再經(jīng)過(guò)二甲苯脫色，封片，以備觀察。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明對(duì)活體動(dòng)物建立模型后進(jìn)行灌注、取材、切片，通過(guò)地高辛標(biāo)記的cRNA探針與組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3基因的mRNA發(fā)生特異性的結(jié)合，從而方便、準(zhǔn)確的觀察到組織中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3基因mRNA水平的變化。本發(fā)明使用的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的探針序列，對(duì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3基因mRNA的顯示有明確的特異性，實(shí)現(xiàn)了對(duì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3基因mRNA水平的顯示作用。


圖1為本發(fā)明的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3在海馬的分布X4倍圖；圖2為本發(fā)明的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3在海馬的分布X40倍圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述參見(jiàn)圖1和圖2，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3基因cRNA原位雜交探針的制備方法，按照如下步驟(1)根據(jù)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的Gene bank序列我們?cè)O(shè)計(jì)了谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白_3特異的引物，并且此對(duì)引物擴(kuò)增出的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3片段作為谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3 特異的探針序列；(2)構(gòu)建谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA原位雜交的探針質(zhì)粒；將探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序；(3)制備谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA原位雜交探針；(4)檢測(cè)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA探針的原位雜交。探針的設(shè)計(jì)根據(jù)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的Gene bank序列我們?cè)O(shè)計(jì)了谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白_3特異的引物，并且此對(duì)引物擴(kuò)增出292bp的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3片段作為谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3特異的探針序列。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3特異的引物如下上游引物5' GCTGTGCGGAAGAAAAGAAC3‘；下游引物5' ACGGCAATGATGAGGGTGAC3‘。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3特異的探針序列5 ‘ GCTGTGCGGAAGAAAAGAACCACGTGGACAAGAGGATCACAAGATTTGTGCTGCCCGTCGGCGCC ACCATCAACATGGACGGCACTGCGCTCTATGAAGCCGTGGCAGCTGTGTTCATTGCGCAGCTGAACGGCATGGACCT GAGCATTGGGCAGATCATCACGATCAGCATCACAGCCACCGCTGCTAGCATTGGAGCTGCCGGTGTGCCCCAGGCTG GCCTGGTGACCATGGTGATCGTGTTGAGTGCCGTGGGGCTGCCTGCTGAGGACGTCACCCTCATCATTGCCGT3'谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA原位雜交的探針質(zhì)粒的構(gòu)建1.將大鼠的cDNA用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2.將PCR產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。3.將回收后的產(chǎn)物于4°C與多克隆位點(diǎn)兩端具有T7，SP6啟動(dòng)子的載體進(jìn)行連接。4.將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，搖菌培養(yǎng)送金斯瑞公司進(jìn)行測(cè)序。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA原位雜交探針的制備1.測(cè)序正確后，經(jīng)判斷確認(rèn)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3探針序列插入載體的順序是正向的。2.需要使用BamH I限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，3.將酶切產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。4.用SP6 RNA聚合酶對(duì)探針進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記，體外轉(zhuǎn)錄的試劑盒(Ambion MEGAscript)是Ambion公司的產(chǎn)品。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA探針的原位雜交檢測(cè)1.將大鼠用0.4%戊巴比妥鈉深麻后，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，用O.Olmol/L的 DEPC-PBS的快速?zèng)_洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定。2.取材后進(jìn)行腦組織的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定M小時(shí)。3.將固定好的組織進(jìn)行切片將組織切成25 30 μ m組織切片，并將切好的切片保存于0. 01mol/L DEPC-PBS中，放于4°C冰箱備用。4.將切好的組織片用0. 01mol/L DEPC-PBS清洗1次，室溫，每次5分鐘。5.將上述清洗過(guò)的片子用5 χ SSC清洗2次，室溫，每次5分鐘。6.將5 χ SSC清洗后的組織片浸入預(yù)雜交液中，于55°C，在雜交爐孵育1小時(shí)。
7.將預(yù)雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于55°C，在雜交爐中孵育16-20小 時(shí)。8.雜交后用1 X SSC洗滌雜交的組織切片，37°C，2次，毎次10分鐘。9.用2 X SSC洗滌上述的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘。10.用 10ug/ml 的 RNase A 處理，37°C，1 次，每次 30 分鐘。11.用2 X SSC洗滌上述的組織切片，室溫，1次，毎次10分鐘。12.用0. Olmol/L PBS洗滌上述的組織切片，室溫，1次，每次10分鐘。13 按 1 2000 的抗體效價(jià)，在0. Olmol/L PBS溶液中加入 Anti-Digoxigenin-AP 抗體，對(duì)洗滌后的組織切片進(jìn)行孵育，室溫，放置過(guò)夜。14.將經(jīng)過(guò)上步抗體孵育的組織片用0. Olmol/L PBS的洗滌，于室溫，清洗3次，每 次10分鐘。15.用TS9. 5洗滌上述0. 01mol/L PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，毎次15分鐘。16.將上述切片放于NBT-BCIP反應(yīng)液中避光孵育4 6小吋，在此過(guò)程中觀察切
片呈色強(qiáng)度。17.當(dāng)呈色完成后，將切片用0. 01mol/L PBS清洗3次，室溫，毎次10分鐘。18.將上述洗滌后切片表于載玻片上。19.晾干切片，再經(jīng)過(guò)ニ甲苯脫色，封片，以備觀察。所用試劑TIANGEN膠回收試劑盒公司天根貨號(hào)DP214-02兩端具有T7，SP6啟動(dòng)子的載體公司invitrogen 貨號(hào)K466001BamH I限制性?xún)?nèi)切酶公司Takara 貨號(hào)D1010ASP6 RNA聚合酶試劑盒公司Ambion 貨號(hào)AM133020 X SSC公司invitrogen 貨號(hào)AM976350 X Denhardt' s公司invitrogen 貨號(hào)750018Heperine公司sigma貨號(hào)H3393tRNA公司sigma貨號(hào)R8759CHAPS公司sigma貨號(hào)C9426Tween-20公司sigma貨號(hào)P9416Anti-Digoxigenin-AP公司Roche貨號(hào)11093274910以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，雖 然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述掲示的方法及技術(shù)內(nèi)容作出些許的更 動(dòng)或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的 技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的 范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3基因cRNA原位雜交的探針，其特征在于，該探針的序列為5' GCTGTGCGGAAGAAAAGAACCACGTGGACAAGAGGATCACAAGATTTGTGCTGCCCGTCGGCGCCACCATCAACATGGACGGCACTGCGCTCTATGAAGCCGTGGCAGCTGTGTTCATTGCGCAGCTGAACGGCATGGACCTGAGCA TTGGGCAGATCATCACGATCAGCATCACAGCCACCGCTGCTAGCATTGGAGCTGCCGGTGTGCCCCAGGCTGGCCTG GTGACCATGGTGATCGTGTTGAGTGCCGTGGGGCTGCCTGCTGAGGACGTCACCCTCATCATTGCCGT 3‘。
2.如權(quán)利要求1所述探針的制備方法，其特征在于(1)根據(jù)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的Genebank序列我們?cè)O(shè)計(jì)了谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白_3特異的引物，并且此對(duì)引物擴(kuò)增出的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3片段作為谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3特異的探針序列；(2)構(gòu)建谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA原位雜交的探針質(zhì)粒；將探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序；(3)制備谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA原位雜交探針；(4)檢測(cè)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA探針的原位雜交。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3特異的引物是上游引物是 5' GCTGTGCGGAAGAAAAGAAC 3'；下游引物是 5' ACGGCAATGATGAGGGTGAC 3'。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)按照如下步驟進(jìn)行(a)將大鼠的cDNA用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(b)將PCR產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；(c)將回收后的產(chǎn)物于4°C與多克隆位點(diǎn)兩端具有T7，SP6啟動(dòng)子的載體進(jìn)行連接；(d)將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序。
5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)按照如下步驟進(jìn)行(a)步驟O)的到的細(xì)菌測(cè)序正確后，經(jīng)判斷確認(rèn)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3探針序列插入載體的順序是正向的；(b)需要使用BamHI限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切；(c)將酶切產(chǎn)物用TIANGEN膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；(d)用SP6RNA聚合酶對(duì)探針進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記。
6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)按照如下步驟進(jìn)行(a)將大鼠用0.4%戊巴比妥鈉深麻后，經(jīng)左心室插管至升主動(dòng)脈，用O.Olmol/L的 DEPC-PBS的快速?zèng)_洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；所述的0. 01mol/L DEPC-PBS 是2. 9克磷酸氫二鈉，0. 29克磷酸二氫鈉，9. 0克氯化鈉用超純水定容至IL后，再加入體積百分比為0. 的DEPC Iml放置過(guò)夜后，高壓滅菌制成的磷酸鹽緩沖液；所述4%的多聚甲醛是40. 0克多聚甲醛加入500. Oml蒸餾水加熱使之解聚溶解后，再加入500. Oml的 0. 2mol/L PB緩沖液定容至1000ml ；所述0. 2mol/L PB緩沖液是用29. 01克磷酸氫二鈉， 2. 96克磷酸二氫鈉加超純水定容至500ml配制而成；(b)取材后進(jìn)行腦組織的后固定于4°C，用4%的多聚甲醛后固定M小時(shí)；(c)將固定好的組織進(jìn)行切片將組織切成25 30μ m組織切片，并將切好的切片保存于0. 01mol/L的DEPC-PBS中，放于4°C冰箱備用；(d)將切好的組織片用0.01mol/L的DEPC-PBS清洗1次，室溫，每次5_10分鐘；(e)將上述清洗過(guò)的片子用5χ SSC清洗2次，室溫，每次5-10分鐘；所述5 χ SSC是由20 χ SSC用超純水稀釋的，20 χ SSC為一種檸檬酸緩沖液；(f)將5χ SSC清洗后的組織片浸入預(yù)雜交液中，于55°C，在雜交爐孵育1-2小時(shí)；所述預(yù)雜交液是由5ml的去離子甲酰胺，2.5ml的20 χ SSC溶液，200 μ 1的50 χ Denhardt's 溶液，50 μ 1的濃度為200mg/ml的H印arin溶液，100 μ 1的濃度為10mg/ml的tRNA溶液， 100 μ 1的濃度為10%的CHAPS溶液，100 μ 1的濃度為10 %的Tween-20溶液，100 μ 1的濃度為0. 5mol/L的pH8. 0的EDTA溶液和1. 85ml的DEPC-H2O混合配制而成；所述50 χ Denhardt，s為一種常用的雜交試劑；所述200mg/ml的!feparin為200mg的!feparin粉末溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10mg/ml的tRNA為IOmg的tRNA粉末溶于Iml的 DEPC-H20中配制而成；所述10%的CHAPS為Ig的CHAPS溶于Iml的DEPC-H20中配制而成；所述10%的Tween-20為100 μ 1的Tween-20溶于900 μ 1的DEPC-H20中配制而成；所述0. 5mol/L的pH8. 0的EDTA為186. Ig 二水乙二胺四乙酸二鈉加入800ml的DEPC-H20中在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)pH值至8. 0然后定容至IL配制而成高壓滅菌備用； 所述DEPC-H2O為IL超純水加入體積百分比為0. 的DEPC 1ml，放置過(guò)夜并高壓滅菌處理后的水；(g)將預(yù)雜交孵育后的組織切片浸入雜交液中，于^°C，在雜交爐中孵育16-20小時(shí)； 所述雜交液是上述預(yù)雜交液中加入終濃度為1. Oug/ml的cRNA探針配置成的；(h)雜交后用1χ SSC洗滌雜交的組織切片，37°C，2次，每次10分鐘；(i)用2χ SSC洗滌上述的組織切片，37°C，2次，每次10-15分鐘； (j)用 10ug/ml 的 RNase A 處理，37°C，1 次，每次 30-40 分鐘；(k)用2 χ SSC洗滌上述的組織切片，室溫，1次，每次10分鐘； (1)用0. 01mol/L PBS洗滌上述的組織切片，室溫，1次，每次10分鐘；所述0. 01mol/L PBS是2. 9克磷酸氫二鈉，0. 29克磷酸二氫鈉，9. 0克氯化鈉用超純水定容至IL配置的磷酸緩沖液；(m)按1 2000的抗體效價(jià)，在PBS溶液中加入Anti-Digoxigenin-AP抗體，對(duì)洗滌后的組織切片進(jìn)行孵育，室溫，放置過(guò)夜；(η)將經(jīng)過(guò)上步抗體孵育的組織片用O.Olmol/L PBS洗滌，于室溫，清洗3次，每次 10-15分鐘；(ο)用TS9. 5洗滌上述PBS洗滌后的組織片，室溫，清洗2次，每次15-20分鐘；所述 TS9. 5為是由終濃度為摩爾濃度為0. lmol/L Tris-HCl (PH9. 5)，摩爾濃度為0. Imol/L NaCl 溶液和摩爾濃度為50mmol/L MgCL2用超純水配制而成；(P)將上述切片放于NBT-BCIP反應(yīng)液中避光孵育4 6小時(shí)，在此過(guò)程中觀察切片呈色強(qiáng)度；所述NBT-BCIP是一種Roche公司生產(chǎn)的呈色反應(yīng)液；(q)當(dāng)呈色完成后，將切片用PBS清洗3次，室溫，每次10-15分鐘；(r)將上述洗滌后切片表于載玻片上；(s)晾干切片，再經(jīng)過(guò)二甲苯脫色，封片，以備觀察。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3基因cRNA原位雜交的探針及其設(shè)計(jì)方法，按照如下步驟(1)根據(jù)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的Gene bank序列我們?cè)O(shè)計(jì)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3特異的引物，并且此對(duì)引物擴(kuò)增出292bp的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3片段作為谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3特異的探針序列；(2)構(gòu)建谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA原位雜交的探針質(zhì)粒；將探針質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，細(xì)菌培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序；(3)制備谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA原位雜交探針；(4)檢測(cè)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3的cRNA探針的原位雜交。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102559904SQ20121002200
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月1日
發(fā)明者李云慶, 武勝昔, 王亞云, 陳晶, 魏燕燕, 黃靜 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)