專利名稱：山羊葡萄糖轉(zhuǎn)運載體4基因及其重組表達載體和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及山羊葡萄糖轉(zhuǎn)運載體4基因及其重組表達載體和應用。
背景技術：
葡萄糖是一種極性分子，需要借助于胞膜上的運載蛋白進入細胞內(nèi)。在哺乳類細胞內(nèi)有兩類葡萄糖轉(zhuǎn)運載體Na+葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白和易化葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(Glut)。參與人體葡萄糖轉(zhuǎn)運的主要的是易化葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白。至今在哺乳類動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)13種Glut，其中Glut4是一個主要的研究熱點。由于葡萄糖是乳腺上皮細胞合成乳糖的主要前體，所以給泌乳動物的乳腺提供葡萄糖是新陳代謝的重點。因為乳糖維持著乳的滲透壓，所以乳糖合成速率是影響產(chǎn)奶量的 主要原因。另外，葡萄糖除了是重要的乳糖合成前體，還可以產(chǎn)生ATP、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，也是合成蛋白質(zhì)、脂肪和核苷酸的前體。一頭泌乳牛每產(chǎn)Ikg牛奶需要72g葡萄糖。因此，一頭日產(chǎn)奶量40kg的奶牛，它的乳腺每天需要攝入3kg的葡萄糖。事實如此，乳腺攝入的葡萄糖是血糖總量的60 85%。Glut4是胰島素依賴型蛋白，主要存在于胰島素敏感的組織中骨骼肌，心肌和脂肪組織，Glut4是這些組織中的主要的葡萄糖運載體。近年來由于葡萄糖鉗夾技術的應用，已經(jīng)證實細胞外膜上葡萄糖載體的含量與細胞葡萄糖最大轉(zhuǎn)運能力呈正相關關系，葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運是骨骼肌利用葡萄糖的主要限速過程。基礎狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)下，葡萄糖利用分別占全身的20 %和70 % 85 %。Glut4在促進葡萄糖的吸收和利用上起了關鍵限速的作用。尤其是在胰島素狀態(tài)下，Glut4起決定性作用。通過增加細胞GLUT4的表達，可以達到促進細胞吸收葡萄糖，增加細胞能量代謝和合成代謝的目的。本發(fā)明提供了山羊葡萄糖轉(zhuǎn)運載體4基因GLUT4序列及其相應的氨基酸序列。提供了含有山羊葡萄糖轉(zhuǎn)運載體4基因的真核表達載體P⑶NA3. 1-GLUT4和含有這種載體的大腸桿菌(E. coli)細胞JMI09/pCDNA3. 1-GLUT4以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細胞株GMGE/p⑶NA3. 1-GLUT4。利用本發(fā)明成果，可以用于構建轉(zhuǎn)基因整合載體，提高山羊乳腺對葡萄糖的攝取能力，增加產(chǎn)奶量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種山羊葡萄糖轉(zhuǎn)運載體4基因。本發(fā)明的另一目的是提供含有該基因的重組表達載體。本發(fā)明的又一目的是提供該基因的應用。本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)一種葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因GLUTl，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
所述的基因GLUT4，該基因的編碼序列如序列表SEQ ID NO : I中第144-1673位所
示核昔酸。含有本發(fā)明所述的GLUT4基因的真核表達載體pCDNA3. 1-GLUT4。含有真核表達載體pCDNA3. 1-GLUT4的大腸桿菌(E. coli)受體細胞JM109/pCDNA3. 1-GLUT4。 本發(fā)明所述真核表達載體P⑶NA3. 1-GLUT4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細胞株GMGE/pCDNA3. 1-GLUT4。本發(fā)明所述的葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因GLUT4在提高哺乳動物乳腺細胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的應用。本發(fā)明所述的真核表達載體P⑶NA3. 1-GLUT4在提高哺乳動物乳腺細胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的應用。有益效果葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因可以提高山羊乳腺上皮細胞的葡萄糖的吸收和乳糖的合成。體外轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細胞的熒光定量PCR結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組(只轉(zhuǎn)染P⑶NA3. 1-GLUT4)的GLUT4表達量高于對照組(正常培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細胞)接近55倍。通過測定培養(yǎng)24h和48h的培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，24h轉(zhuǎn)染組葡萄糖的吸收量達到1.990±0. 0141yg/yg蛋白，顯著高于對照組的1.771±0. 00346 yg/yg蛋白；48h轉(zhuǎn)染組葡萄糖的吸收量達到9. 287±0. 278μ g/μ g蛋白，極顯著的高于對照組細胞(I. 99±0· 014μ g/μ g蛋白)。48h轉(zhuǎn)染組乳糖合成量達到178. 679±32· 968ng/y g蛋白顯著高于對照組細胞(49. 926±4. 192ng/yg蛋白)。


圖I :真核表達載體pCDNA3. 1-GLUT4的質(zhì)粒圖譜圖2 :GLUT4基因的克隆圖片圖3 NheI/HindIII 雙酶切 pCDNA3. 1-GLUT4 鑒定4 :轉(zhuǎn)染GLUT4基因的山羊乳腺上皮細胞GLUT4基因相對表達量圖5 :轉(zhuǎn)染GLUT4基因的山羊乳腺上皮細胞對葡萄糖吸收的變化圖6 :轉(zhuǎn)染GLUT4基因的山羊乳腺上皮細胞乳糖合成量的變化
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。具體涉及的材料和試劑如下羊肌肉組織來自于無感染病史的薩能奶山羊(購自南京溧水種山羊養(yǎng)殖場)，將組織于液氮冷凍，骨架載體 pCDNA3. I ( + ) (Company Invitrogen ；Catalog Number V79020 ；Product pCDNA3. I ( + ) Vector);山羊乳腺上皮細胞(實驗室分離);E. coli JM109 (購自大連寶生物，Takara )。試劑TRizol, MLV-反轉(zhuǎn)錄酶，rTaq 酶，pMD19_T 載體，Agarose Gel DNAPurification Kit, TaKaRa DNA Ligation Kit 內(nèi)切酶 Xho I, Not I, KpnI, Cla I等均購自TAKARA公司；0MEGA無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自OMEGA公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000,胎牛血清購自 Invitrogen 公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基(貨號C12430)購自Gibco公司；青鏈雙抗(購自碧云天)；胰島素、催乳素、氫化可的松(購自南京生興生物有限公司)；進口葡萄糖檢測試劑盒(Company :Biovisin Catalog Number K606-100Product Glucose Assay Kit)乳糖檢測試劑盒(Company :Biovisin CatalogNumber :K624_100Product Lactose Assay Kit),其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純級。實施例I載體pCDNA3. 1-GLUT4的構建及酶切驗證I. 1GLUT4基因的克隆首先勻漿器勻漿肌肉組織樣品，然后TRizol法提取總RNA。以薩能奶山羊肌肉織的總RNA為模板，以oligod(T)18引物采用invirtrogen公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA
第一鏈。引物設計和合成參照NCBI上的牛GLUT4基因全序列(Bos taurus solute carrier family2 (facilitated glucose transporter)，member4 (SLC2A4)，mRNA)登錄號NM174604。用DNASTAR做限制性內(nèi)切酶分析，用primer5. O設計引物擴增GLUT4基因的CDS區(qū)。引物設計如下GLUT4引物上游引物GLUT4-F :5’ -TCTCGCCAGACTCGCACTC-3’ (SEQ ID NO. 3)；下游引物GLUT4-R :5，-TGCTCAGACCACCGTTCCCT-3’ (SEQ ID NO. 4)反應條件為94°C預變性5min ;94°C變性30s，55°C復性30s，72°C延伸2min，共30個循環(huán)；然后72°C延伸10min，4°C終止。I. 2將GLUT4基因克隆到pMD19_T載體上將PCR擴增的目的條帶經(jīng)膠回收純化后，與PMD19-T載體連接得到質(zhì)粒PMD19-T-GLUT4，轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)，挑取菌落做菌落PCR鑒定篩選陽性克隆；篩選出陽性克隆，提質(zhì)粒PMD19-T-GLUT4，酶切、PCR鑒定，送交上海生工測序。測序結(jié)果生物信息學分析顯示1837bp的序列包含了 GLUT4中的⑶S部分。I. 3將GLUT4插入到骨架載體pCDNA3. I ( + )的Nhe I和HindIII之間GLUT4基因酶切連接引物上游引物F :5’ -GCTAGCATGCCGTCGGGCTTCCAACA-3’ (SEQ ID NO. 5)下游引物R :5’ -AAGCTTTCAGTCATTCTCATCCGGCCCT-3’ (SEQ ID NO. 6)提取步驟I. 3中含有質(zhì)粒PMD19-T-GLUT4的大腸桿菌的質(zhì)粒，使用Nhe I和HindIII內(nèi)切酶分別酶切質(zhì)粒pMD19-T-GLUT4和pCDNA3. I ( + )。經(jīng)切膠回收后，將GLUT4片段與骨架載體P⑶NA3. I ( + )用T4連接酶相連接，如(圖2)。I. 4 重組質(zhì)粒 pCDNA3. 1-GLUT4 的鑒定用克隆GLUT4基因CDS區(qū)的引物分別進行PCR擴增檢驗。同時使用內(nèi)切酶Nhe I和HindIII對質(zhì)粒進行酶切鑒定。由圖可知載體pCDNA3. 1-GLUT4經(jīng)Nhe I和HindIII酶切后，切出大小1539p和5428bp的片段，與預期結(jié)果一致(圖3)。同時進行PCR驗證。以上鑒定證實pCDNA3. 1-GLUT4載體構建成功。I. 5轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCDNA3. 1-GLUT4的提取和純化將重組質(zhì)粒P⑶NA3. 1-GLUT4用OMIGA無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取和純化質(zhì)粒，_20°C保存，用于細胞轉(zhuǎn)染。
實施例2.山羊乳腺上皮細胞的分離和培養(yǎng)(I)準備材料高壓后的眼科剪刀(一大一小)，刮毛刀，鑷子各兩把，小的術齒鑷一把，無菌培養(yǎng)皿2個，小青瓶兩個。2%的碘酊I瓶，75%的酒精I瓶，加雙抗的PBS兩瓶。DMEM/F12培養(yǎng)基，添加15%的胎牛血清，EGF10ng/ml, 200ug/ml的雙抗。(2)實驗步驟①、取材選取兩個月左右的小羊，盡量挑選耳組織上血管組織較少的部位用刮毛刀刮毛，先用2%的碘酊棉球擦拭要切取部位，I分鐘后用75%的酒精擦拭，用高壓消毒后的眼科剪刀，剪取Icm2左右的耳部組織，放人含250u/ml的青鏈雙抗的PBS中，4度浸泡，立即帶回實驗室(四小時之內(nèi))。②、處理將樣品移入超凈臺中，將山羊的皮膚置于無菌培養(yǎng)皿中，用含500IU · mL-1雙抗的PBS洗滌2次，剪除毛茬，輕輕刮去表皮組織和皮下組織，保留真皮層，將剩余組織在70%乙醇中浸泡30s，再含200ug/ml的雙抗PBS洗滌組織3 5次，然后剪·成Imm3大小的組織塊，移入組織培養(yǎng)瓶的底壁上，用吸管將組織塊均勻地鋪開，小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，置于37度、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置4 6h。在組織塊周圍開始變干以前加入DMEM培養(yǎng)液，浸沒組織塊，過夜，第2天補加入2 3mL DMEM培養(yǎng)液，每隔2 3d觀察并換液。原代細胞采用DMEM添加15%胎牛血清進行貼壁培養(yǎng)，細胞長成致密單層后，用O. 25%胰酶消化，待大部分細胞變圓時，加培養(yǎng)液終止消化，并反復吹打。因為成纖維細胞消化脫壁比上皮細胞快，在前3代傳代經(jīng)酶消化，待細胞剛變圓即終止消化，只收集脫壁細胞，這樣便可得到純化的成纖維細胞。當細胞生長至70% 80%匯合狀態(tài)時即可冷凍保存，以備細胞特性分析以及基因轉(zhuǎn)染使用。實施例3.山羊乳腺上皮細胞的轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選將山羊乳腺上皮細胞接種于60mm孔培養(yǎng)板中，每個板用5ml培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1山待細胞鋪滿培養(yǎng)皿底的70% 80%時，改用無血清、無抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基洗滌細胞2次，用不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后轉(zhuǎn)染。次日轉(zhuǎn)染按Lipofectamine2000說明書進行轉(zhuǎn)染,脂質(zhì)體(uL)與質(zhì)粒(ug)的比例為3 : 2。細胞培養(yǎng)6h后棄去混合液，加入體積分數(shù)10%胎牛血清、不含抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。第2天，想培養(yǎng)基中加入700 μ g/ml的G418藥物，篩選14天。挑去單克隆匯集到24孔培養(yǎng)板中，將G418的濃度降至400 μ g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)和傳代，直至6孔培養(yǎng)板。乳腺上皮細胞的轉(zhuǎn)染效率比較低，瞬時轉(zhuǎn)染后檢測葡萄糖和乳糖的變化不明顯，并且受轉(zhuǎn)染時細胞狀態(tài)的影響較大。所以我們篩選了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細胞用于檢測培養(yǎng)上清中葡萄糖和乳糖的變化。實施例4. pCDNA3. 1-GLUT4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細胞GLUT4基因的表達檢測細胞誘導表達及樣品處理山羊乳腺上皮細胞和P⑶NA3. 1-GLUT4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細胞分別大量繁殖后，以IXio5的密度接種6孔培養(yǎng)板，分別培養(yǎng)，在細胞漲至50%時加誘導培養(yǎng)基。誘導培養(yǎng)基成分DMEM+10%胎牛血清、胰島素(10μ g/mL)、催乳素(I μ g/mL)、氫化可的松(20μ g/mL)和1%青鏈雙抗。在誘導后4天,用TRizol提取每孔細胞的總RNA，用MLV-反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行熒光定量PCR檢測GLUT4基因表達量的變化，使用的熒光定量PCR儀為ABI7500，使用的試劑為TAKARA公司的SYBR Premix ExTaq II (TlRNaseH Plus)。熒光定量PCR結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組(只轉(zhuǎn)染pCDNA3. 1-GLUT4)的GLUT4表達量高于對照組(正常培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細胞)接近55倍(圖4)。實施例5.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細胞培養(yǎng)液中葡萄糖吸收和乳糖合成的檢測細胞誘導表達及樣品處理山羊乳腺上皮細胞和P⑶NA3. 1-GLUT4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細胞分別大量繁殖后，以IXio5的密度接種6孔培養(yǎng)板，分別培養(yǎng)，在細胞漲至50%時加誘導培養(yǎng)基。誘導培養(yǎng)基成分DMEM+10%胎牛血清、胰島素(10 μ g/mL)、催乳素(1μ g/mL)、氫化可的松(20μ g/mL)和1%青鏈雙抗。在誘導后4天更換新鮮培養(yǎng)基，并在之后的24h和48h分別收細胞培養(yǎng)液上清和細胞蛋白，使用葡萄糖檢測試劑盒和乳糖檢測試劑盒分別檢測培養(yǎng)液上清中的葡萄糖含量和乳糖含量；測定細胞蛋白用于矯正細胞數(shù)量。結(jié)果顯示，24h轉(zhuǎn)染組葡萄糖的吸收量達到1.990±0. 0141yg/yg蛋白，顯著高于對照組的I. 771 ±O. 00346 μ g/ μ g蛋白；48h轉(zhuǎn)染組葡萄糖的吸收量達到9. 287±0. 278μ g/μ g蛋白，極顯著的高于對照組細胞(I. 99+0. 014 μ g/μ g蛋白)(圖 5)。而48h轉(zhuǎn)染組乳糖合成量達到178. 679±32. 968ng/yg蛋白顯著高于對照組細胞(49·926±4· 192ng/yg 蛋白)(圖 6)。
權利要求
1.一種葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因GLUTl，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.根據(jù)權利要求I所述的基因GLUT4，其特征在于該基因的編碼序列如序列表SEQIDNO. I中第144-1673位所示核昔酸。
3.含有權利要求I所述的GLUT4基因的真核表達載體pCDNA3.1-GLUT4。
4.含有權利要求3所述的真核表達載體P⑶NA3.1-GLUT4的大腸桿菌(E. coli)受體細胞 JM109/pCDNA3. 1-GLUT4。
5.權利要求3所述真核表達載體P⑶NA3.1-GLUT4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的山羊乳腺上皮細胞株GMGE/pCDNA3. 1-GLUT4。
6.權利要求I所述的葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因GLUT4在提高哺乳動物乳腺細胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的應用。
7.權利要求3所述的真核表達載體pCDNA3.1-GLUT4在提高哺乳動物乳腺細胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及山羊葡萄糖轉(zhuǎn)運載體4基因及其重組表達載體和應用。葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因GLUT1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。含有本發(fā)明所述的GLUT4基因的真核表達載體pCDNA3.1-GLUT4。本發(fā)明葡萄糖轉(zhuǎn)運載體基因可以提高山羊乳腺上皮細胞的葡萄糖的吸收和乳糖的合成。因此可在提高哺乳動物乳腺細胞葡萄糖吸收和/或乳糖合成中應用。
文檔編號C12R1/91GK102899328SQ201210374619
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權日2012年9月28日
發(fā)明者庾慶華, 朱立麒, 楊倩, 林 建 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學