專利名稱：淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基及發(fā)酵普魯蘭多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵普魯蘭多糖的方法，具體涉及一種以淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基來(lái)發(fā)酵普魯蘭多糖的方法。
背景技術(shù)：
普魯蘭多糖是一類具有重要應(yīng)用價(jià)值的微生物胞外多糖，成膜性、成纖維、阻氣性、生物安全且無(wú)毒的特點(diǎn)，使其在食品、醫(yī)藥、化工和石油領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。淀粉廢水是加工淀粉過(guò)程中不可避免的一種副產(chǎn)物，營(yíng)養(yǎng)豐富；麥芽根為麥芽制造過(guò)程中的副產(chǎn)物，含有豐富的淀粉酶、麥芽酶、果酸酶及蛋白酶，富含B族維生素，并含有大量未知生長(zhǎng)因子。目前文獻(xiàn)中報(bào)道的普魯蘭多糖發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源較多的是使用耐高溫淀粉酶酶解后的淀粉或者蔗糖，價(jià)格昂貴，工藝復(fù)雜，增加了普魯蘭多糖發(fā)酵成本。此外目前缺少色素產(chǎn)生少和胞外多糖合成能力高的菌株，這些都促使普魯蘭多糖整體成本的上升。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述由于技術(shù)不足產(chǎn)生的問(wèn)題，進(jìn)一步降低普魯蘭多糖的成本，本發(fā)明的目的在于提供一種以淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基來(lái)發(fā)酵普魯蘭多糖的方法，原料來(lái)源廣泛，利用麥芽根所含有的豐富酶系和生長(zhǎng)因子來(lái)酶解淀粉工業(yè)廢水，培養(yǎng)基簡(jiǎn)單，既提高了多糖產(chǎn)量，降低了多糖生產(chǎn)成本，也解決了由淀粉廢水及麥芽根帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題。此外，通過(guò)該方法培養(yǎng)的菌株色素產(chǎn)生能力明顯下降，減少了脫色這個(gè)步驟，大大降低了普魯蘭多糖的成本。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種以淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基來(lái)發(fā)酵普魯蘭多糖的方法，包括以下步驟:所述培養(yǎng)基制備方法如下:(I)將麥芽根粉碎，過(guò)20目篩，制備麥芽根汁，質(zhì)量濃度20%_50% ；(2)將麥芽根汁與工業(yè)淀粉廢水按照質(zhì)量比20 40:100添加混合，在38 40°C浸潰25-40min ;控制溫度為45°C進(jìn)行蛋白質(zhì)(Pr)休止，保持20_40min，控制溫度為55°C進(jìn)行第二次蛋白質(zhì)休止保持30分鐘，控制溫度在63°C進(jìn)行第一段糖化，保持時(shí)間40min ;第二段糖化溫度為68°C，至碘液反應(yīng)為無(wú)色；升溫到76 78°C，過(guò)濾，洗糟，調(diào)pH到5.6-7.4，添加2 3g/L的NaCU0.2 0.4g/L的MgSO4,3 5g/L的K2HPO4,滅菌成為培養(yǎng)基。所述發(fā)酵培養(yǎng)方法如下:(I)將出芽短梗霉(Aureobsidium pullulans)CGMCCN0.7055 菌株活化，即將其從蔗糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上轉(zhuǎn)接到500ml的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為80ml，在恒溫28°C轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng) 30h。(2)以4%體積比將(I)所得種子菌液轉(zhuǎn)接到500ml培養(yǎng)基的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為100ml，在恒溫28°C轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)84 104h后，取發(fā)酵液離心去除菌絲體。
(3)在上層清液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌，4°C放置過(guò)夜，使普魯蘭多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min離心30min得普魯蘭多糖沉淀,沉淀用無(wú)水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或淺黃色多糖粗品。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:本發(fā)明利用工業(yè)廢棄物-淀粉工業(yè)廢水進(jìn)行普魯蘭多糖的制備，不僅能變廢為寶，大大降低普魯蘭多糖的生產(chǎn)成本，還會(huì)減少淀粉工業(yè)廢水對(duì)環(huán)境所造成的污染，起到了資源和環(huán)境雙贏的效果。本發(fā)明利用了麥芽制造廠的副產(chǎn)物一麥芽根中的豐富酶系代替水解酶進(jìn)行廢水中的淀粉水解，還利用了麥芽根中豐富的生長(zhǎng)因子促進(jìn)出芽短梗霉菌的生長(zhǎng)代謝，提高了
普魯蘭多糖的產(chǎn)量。經(jīng)本發(fā)明培養(yǎng)的菌株色素產(chǎn)生明顯降低，從而減少產(chǎn)品脫色步驟，大大降低了成本。
具體實(shí)施實(shí)例下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1一種以淀粉廢水及麥芽根制備材料來(lái)發(fā)酵普魯蘭多糖的方法，包括以下步驟:一、將麥芽根粉碎，過(guò)20目篩，制備麥芽根汁濃度50%。二、將麥芽根汁 與工業(yè)淀粉廢水按照質(zhì)量比20:100的添加混合一浸潰(38 40°C，30min) — Pr 休止 I (45°C，30min) — Pr 休止 II (55°C，30min)—第一段糖化(63°C，40min)—第二段糖化(68°C，至碘液反應(yīng)為無(wú)色一升溫(76 78°C )—過(guò)濾一洗槽一調(diào)節(jié)pH至5.8，添加2g/L的NaCl、0.2g/L的MgS04、3g/L的K2HPO4經(jīng)滅菌成為培養(yǎng)基。三、將CGMCCN0.7055活化，即將其從蔗糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上轉(zhuǎn)接到500ml的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為80ml，在恒溫28°C轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)30h。三、以4%體積比將種子菌液轉(zhuǎn)接到500ml的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為100ml，在恒溫28°C轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)84h后，取發(fā)酵液離心去除菌絲體。四、在上層清液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌，4°C放置過(guò)夜，使普魯蘭多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min離心30min得普魯蘭多糖沉淀,沉淀用無(wú)水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或淺黃色多糖粗品，產(chǎn)量98g/L。實(shí)施例2一、將麥芽根粉碎，過(guò)20目篩，制備麥芽根汁濃度30%。二、將麥芽根汁與工業(yè)淀粉廢水按照質(zhì)量比30:100添加混合一浸潰(38 40°C，30min) — Pr 休止 I (45 °C, 30min) — Pr 休止 II (55 °C, 30min)—第一段糖化(63 °C,40min)—第二段糖化(68°C，至碘液反應(yīng)為無(wú)色)一升溫(76 78°C )—過(guò)濾一洗槽一調(diào)節(jié)pH至6.6，添加3g/L的NaCl、0.3g/L的MgS04、4g/L的K2HPO4經(jīng)滅菌成為培養(yǎng)基。三、將CGMCCN0.7055活化，即將其從蔗糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上轉(zhuǎn)接到500ml裝有上述培養(yǎng)基的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為80ml，在恒溫28°C轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)30h。三、以4%體積比將種子菌液轉(zhuǎn)接到500ml裝有上述培養(yǎng)基的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為100ml，在恒溫28°C轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)96h后，取發(fā)酵液離心去除菌絲體。
四、在上層清液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌，4°C放置過(guò)夜，使普魯蘭多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min離心30min得普魯蘭多糖沉淀,沉淀用無(wú)水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或淺黃色多糖粗品，產(chǎn)量105g/L。實(shí)施例3一、將麥芽根粉碎，過(guò)20目篩，制備麥芽根汁濃度20%。二、將麥芽根汁與工業(yè)淀粉廢水按照質(zhì)量比40:100添加混合一浸潰(38 40°C，30min) — Pr 休止 I (45 °C, 30min) — Pr 休止 II (55 °C, 30min)—第一段糖化(63 °C,40min)—第二段糖化(68°C，至碘液反應(yīng)為無(wú)色)一升溫(76 78°C )—過(guò)濾一洗槽一調(diào)節(jié)pH至7.1，添加2g/L的NaCl、0.4g/L的MgS04、5g/L的K2HPO4經(jīng)滅菌成為培養(yǎng)液。三、將CGMCCN0.7055活化，即·將其從蔗糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上轉(zhuǎn)接到500ml的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為80ml，在恒溫28°C轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)30h。三、以4%體積比將種子菌液轉(zhuǎn)接到500ml的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為100ml，在恒溫28°C轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)104h后，取發(fā)酵液離心去除菌絲體。四、在上層清液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌，4°C放置過(guò)夜，使普魯蘭多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min離心30min得普魯蘭多糖沉淀,沉淀用無(wú)水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或淺黃色多糖粗品，產(chǎn)量102g/L。一株出芽短梗霉(Aureobsidium pullulans),該菌株已經(jīng)于2012年12月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，(郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCCN0.70551.誘變菌株的獲得(I)選擇生長(zhǎng)良好的出芽短梗霉菌株TKPM10017斜面菌種，用無(wú)菌生理鹽水洗下孢子，制做106個(gè)/mL的孢子懸浮液，于30W紫外燈下,30cm處，分別照射0.5min、lmin、
1.5min、2min、2.5min3min、3.5min、4min將孢子懸液梯度稀釋涂平板,避光28°C培養(yǎng),計(jì)算致死率；(2)選擇0.5min、2min、4min三個(gè)不同劑量的照射時(shí)間分別對(duì)菌株TKPM10017的孢
子懸浮液進(jìn)行紫外照射處理；(3)然后把三個(gè)不同照射時(shí)間的孢子懸液混合均勻，進(jìn)行10-1 10-6梯度稀釋，取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6三個(gè)稀釋度的孢子懸浮液涂布平板，28°C避光培養(yǎng)3d ；(4)將(3)中的誘變菌株接種到含有10mg/L寡霉素的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)；將種子液置于28°C恒溫?fù)u床，200r/min，振蕩培養(yǎng)3d ；(5)將(4)中的種子液進(jìn)行梯度稀釋，取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6三個(gè)稀釋度的孢子懸浮液涂布斜面培養(yǎng)基平板，28°C培養(yǎng)3d，篩選培養(yǎng)基中顏色乳白色、菌落大而粘稠、濕潤(rùn)的菌株。(6)再將(5)中篩選的菌株分別接種到種子培養(yǎng)基中，在28°C，200r/min下，振蕩培養(yǎng)36h，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C、200r/min下發(fā)酵3d，離心，蒽酮硫酸法測(cè)定上清液中普魯蘭多糖的含量，復(fù)篩出普魯蘭多糖高產(chǎn)菌株BCSWGHPL101。2.誘變菌株BCSWGHPL101的特性(I)菌落形態(tài):發(fā)酵液中主要呈現(xiàn)酵母樣形態(tài)，橢圓形且大小均一，菌株的繁殖方式類似于酵母的出芽生殖方式。
(2)菌落形態(tài):菌落呈圓形，中心隆起，表面光滑，濕潤(rùn)，不易挑取，生長(zhǎng)后期有菌絲體產(chǎn)生。(3)培養(yǎng)特征:28°C，200rpm下震蕩培養(yǎng)3d，發(fā)酵液顏色乳白到乳黃色。(4)可以利用的碳源:葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、糊精其中之一。(5)可以利用的氮源:牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、硝酸鈉、酵母膏、硫酸銨、硝酸銨等，上述氮源可以混合使用，也可單一使用。(6)可以在10mg/L寡霉素存在的情況下生長(zhǎng)良好。1.培養(yǎng)基的配置:(I)菌種活化培養(yǎng)基:土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):去皮馬鈴薯200g/L，加葡萄糖 20g/L，瓊脂 20g/L，，pH 自然。121。。20min 滅菌。(2)種子培養(yǎng)基:蛋白胨 3g/L，蔗糖 50g/L，K2HPO4.7Η202.0g/L，MgSO4.7Η200.4g/L, NaC12.5g/L，調(diào)節(jié) pH 至 7.0，121 °C 高壓滅菌 20min，備用。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨 3g/L，蔗糖 100g/L，K2HPO4.7H203.0g/L,MgSO4.7Η20 0.4g/L, NaC12.5g/L, FeSO40.0lg/L 調(diào)節(jié) pH 至 7.0，121 °C 高壓滅菌 20min,備用。

(4)選擇培養(yǎng)基:寡霉素5mg/L(單獨(dú)滅菌)，蛋白胨3g/L,鹿糖50g/L,K2HPO4.7Η202.0g/L, MgSO4.7Η200.4g/L，NaC12.5g/L，調(diào)節(jié) pH 至 7.0，121 °C 高壓滅菌 20min,備用。(5)初篩培養(yǎng)基即PDA培養(yǎng)基:去皮馬鈴薯200g/L，加葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，pH 自然。121 °C 20min 滅菌。
權(quán)利要求
1.粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟: (1)將麥芽根粉碎，過(guò)20目篩，制備麥芽根汁，質(zhì)量濃度控制20-50%; (2)將麥芽根汁與工業(yè)淀粉廢水按照質(zhì)量比20 40:100添加混合，在38 40°C浸潰25-40min ;控制溫度為45°C進(jìn)行蛋白質(zhì)休止，保持20_40min，控制溫度為55°C進(jìn)行第二次蛋白質(zhì)休止保持30分鐘，控制溫度在63°C進(jìn)行第一段糖化，保持時(shí)間40min，第二段糖化溫度為68°C，至碘液反應(yīng)至無(wú)色，升溫到76 78°C，過(guò)濾，洗槽，調(diào)pH到5.6-7.4，添加2 3g/L的NaCU0.2 0.4g/L的MgS04、3 5g/L的K2HP04,滅菌成為培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基的制備方法，所述PH為5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基的制備方法，所述PH為6.6。
4.一種利用如權(quán)利要求1所述淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基發(fā)酵的方法，包括如下步驟: (1)將普魯蘭多糖高產(chǎn)菌株(Aureobsidiumpullulans) CGMCCN0.7055菌株活化； (2)以4%體積比將種子菌液轉(zhuǎn)接到500ml培養(yǎng)基的擋板瓶中，擋板瓶裝液量為100ml，在恒溫28°C轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)84 104h后，取發(fā)酵液離心去除菌絲體； (3)在上層清液中加入三倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌，4°C放置過(guò)夜，使普魯蘭多糖充分沉淀，沉淀液以5000r/min離心30min得普魯蘭多糖沉淀,沉淀用無(wú)水乙醇洗漆2次,干燥得到白色或淺黃色多糖粗品 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基來(lái)發(fā)酵普魯蘭多糖的方法。所述以淀粉廢水及麥芽根制備培養(yǎng)基來(lái)發(fā)酵普魯蘭多糖的方法，培養(yǎng)基的制備制備包括以下步驟培養(yǎng)基的制備、菌株活化、發(fā)酵培養(yǎng)、乙醇處理干燥即得到白色或淺黃色多糖粗品。其中所述培養(yǎng)基制備方法包括(1)麥芽根粉碎，過(guò)篩，制備麥芽根汁；(2)將麥芽根汁與工業(yè)淀粉廢水混合，浸漬；控溫進(jìn)行蛋白質(zhì)(Pr)休止；控溫進(jìn)行糖化；升溫，過(guò)濾，洗糟，調(diào)pH，添加無(wú)機(jī)鹽，滅菌。本發(fā)明利用工業(yè)廢棄物—淀粉工業(yè)廢水進(jìn)行普魯蘭多糖的制備，不僅能變廢為寶，大大降低普魯蘭多糖的生產(chǎn)成本，還會(huì)減少淀粉工業(yè)廢水對(duì)環(huán)境所造成的污染，起到了資源和環(huán)境雙贏的效果。
文檔編號(hào)C12P19/10GK103088085SQ201210594838
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者喬長(zhǎng)晟, 宋亞瓊, 郝華璇, 李振海, 李政, 蓋麗豐 申請(qǐng)人:天津北洋百川生物技術(shù)有限公司