通過(guò)遞送人工轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)受體表達(dá)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及人工轉(zhuǎn)錄因子，其包含融合至抑制或激活蛋白結(jié)構(gòu)域、核定位序列和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的特異性靶向受體基因啟動(dòng)子的多指鋅指蛋白。在具體的實(shí)例中，這些受體基因啟動(dòng)子調(diào)節(jié)內(nèi)皮素受體A、內(nèi)皮素受體B、Toll樣受體4或高親和力IgE受體的表達(dá)。指向內(nèi)皮素A或B受體的人工轉(zhuǎn)錄因子用于治療由內(nèi)皮素調(diào)節(jié)的疾病，諸如心血管疾病和尤其是眼疾病，例如視網(wǎng)膜靜脈阻塞、視網(wǎng)膜動(dòng)脈阻塞、黃斑水腫、視神經(jīng)病變、中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜色素變性、Leber遺傳性視神經(jīng)病變等。指向Toll樣受體4或IgE受體的人工轉(zhuǎn)錄因子分別用于治療自身免疫病癥等，和變應(yīng)性病癥。
【專利說(shuō)明】通過(guò)遞送人工轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)受體表達(dá)
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及人工轉(zhuǎn)錄因子，其包含融合至抑制或激活結(jié)構(gòu)域、核定位序列和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的特異性靶向受體基因啟動(dòng)子的多指鋅指蛋白，以及它們?cè)谥委熡商禺愋孕?yīng)物與此類受體的結(jié)合所調(diào)節(jié)的疾病中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]提出人工轉(zhuǎn)錄因子(ATF)是用于調(diào)芐基因表達(dá)的有用工具(Sera T.，2009, AdvDrug Deliv Rev &1, 513-526)。許多天然存在的轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)抑制或激活基因轉(zhuǎn)錄來(lái)影響表達(dá)，具有識(shí)別某一 DNA序列的復(fù)雜的特定結(jié)構(gòu)域。如果技術(shù)人員意在修飾它們的特異性和一個(gè)或多個(gè)靶基因，則這使得它們對(duì)于操作而言是無(wú)吸引力的目標(biāo)。然而，某一類轉(zhuǎn)錄因子含有幾個(gè)所謂鋅指(ZF)結(jié)構(gòu)域，它們是模塊化的，并因此使得它們可以進(jìn)行遺傳工程。鋅指是幾乎獨(dú)立靶向三個(gè)DNA堿基對(duì)的短(30個(gè)氨基酸)DNA結(jié)合基序。含有幾個(gè)此類鋅指的蛋白因此能夠識(shí)別更長(zhǎng)的DNA序列。六聚鋅指蛋白(ZFP )識(shí)別18個(gè)堿基對(duì)(bp )的DNA靶，其在整個(gè)人基因組中幾乎是唯一的。最初認(rèn)為是完全背景獨(dú)立的，但更深入的分析顯示對(duì)于鋅指的某些背景特異性(KlugA.，2010, AnnuRevBiocheml^, 213-231)。突變?cè)阡\指識(shí)別表面中的某些氨基酸改變ZF模塊的結(jié)合特異性產(chǎn)生對(duì)于大部分的5’-GNN-3’、5’-CNN-3’、5’ -ANN-3’和某些5’ -TNN-3’密碼子的確定的ZF結(jié)構(gòu)單元(例如所謂的Barbas模塊，見(jiàn)Dreier B.，Barbas C.F.3rd 等，2005，JBiol Chem 280, 35588-35597)。盡管關(guān)于人工轉(zhuǎn)錄因子的早期工作集中于基于組合預(yù)先選擇的鋅指與已知的3 bp靶序列的合理設(shè)計(jì)，但意識(shí)到鋅指的某一背景特異性需要產(chǎn)生大的鋅指文庫(kù)，其使用復(fù)雜方法諸如細(xì)菌或酵母單雜交、卩遼菌體展示、區(qū)室化核糖體展示(compartmentalized ribosome display)或使用FACS分析的體內(nèi)選擇來(lái)詢問(wèn)。
[0003]使用此類人工鋅指蛋白，可以以高特異性靶向在人基因組內(nèi)的DNA基因座。因此，這些鋅指蛋白是將具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性的蛋白結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)運(yùn)至特定啟動(dòng)子序列以產(chǎn)生目標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)的理想工具。用于轉(zhuǎn)錄沉默的合適結(jié)構(gòu)域是Kru印pel相關(guān)的結(jié)構(gòu)域(KRAB)如N-末端(SEQ ID NO:1)或C-末端(SEQ ID NO: 2) KRAB結(jié)構(gòu)域、Sin3相互作用結(jié)構(gòu)域(SID, SEQ ID NO: 3)和ERF阻抑蛋白結(jié)構(gòu)域(ERD，SEQ ID NO: 4)，而基因轉(zhuǎn)錄的激活通過(guò)單純皰疹病毒VP16 (SEQ ID NO: 5)或VP64 (VP16的四聚體重復(fù)，SEQ ID NO: 6)結(jié)構(gòu)域來(lái)完成(Beerli R.R.等，Proc Natl Acad Sci USA 95，14628-14633)。此外，考慮通過(guò)基因本體論 G0:0001071 (http://amigo, geneontology.0rg/cg1-bin/amigo/term_details?term=G0:0001071)確定的蛋白的轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)革巴蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。
[0004]所有已知藥物靶的很大百分比是受體分子，其被具有時(shí)常相當(dāng)大的脫靶(off-target)活性的小分子藥物的作用而刺激或阻斷。此類受體的實(shí)例是組胺Hl受體或α和β腎上腺素受體，但通常是通過(guò)基因本體論G0:0004888和G0:0004930確定的蛋白。
[0005] 盡管由于特定特征的高保守性，小分子藥物并非總能選擇性靶向給定蛋白家族的某一成員，但如基于抗體的新藥物所顯示出的，生物制劑提供了巨大的特異性。然而，實(shí)際上所有生物制劑到目前為止均在細(xì)胞外起作用。
[0006]尤其是上文提及的人工轉(zhuǎn)錄因子將適合于以治療上有用的方式影響基因轉(zhuǎn)錄。然而，此類因子向作用位點(diǎn)一細(xì)胞核一的遞送并不容易實(shí)現(xiàn)，因而妨礙了治療性人工轉(zhuǎn)錄因子方法的有效性，例如通過(guò)依賴于逆轉(zhuǎn)錄病毒遞送具有該方法的所有缺點(diǎn)，諸如免疫原性和細(xì)胞轉(zhuǎn)化的潛能(Lund C.V.等，2005，Mol Cell Biol 25，9082-9091)。
[0007]所謂的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)顯示促進(jìn)蛋白經(jīng)質(zhì)膜易位至細(xì)胞溶膠/核質(zhì)中。短肽諸如HIV來(lái)源的TAT肽(SEQ ID NO: 7)和其他顯示出誘導(dǎo)不依賴于細(xì)胞類型的貨物蛋白質(zhì)的大胞飲攝取(ffadia J.S.etal.，2004，NatMed 10，310-315)。當(dāng)?shù)竭_(dá)細(xì)胞溶膠中時(shí)，此類融合蛋白顯示出具有生物活性。有趣的是，在蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)后，極可能是通過(guò)胞內(nèi)蛋白伴侶的作用，即使錯(cuò)誤折疊的蛋白也能夠變得有功能。
[0008]血管活性內(nèi)皮素系統(tǒng)在多種疾病的發(fā)病中起重要作用。內(nèi)皮素一方面參與調(diào)節(jié)血液供給，并且另一方面是由低氧誘導(dǎo)的事件級(jí)聯(lián)中的主要參與者。內(nèi)皮素例如參與血腦或血視網(wǎng)膜屏障的破壞和參與新血管形成。此外，內(nèi)皮素參與神經(jīng)變性以及調(diào)節(jié)痛覺(jué)或甚至口渴感覺(jué)的閾值。內(nèi)皮素還參與調(diào)節(jié)眼內(nèi)壓。
[0009]內(nèi)皮素作用通過(guò)它的同族受體來(lái)介導(dǎo)，主要是內(nèi)皮素受體A，其通常位于環(huán)繞血管的平滑肌細(xì)胞上。影響內(nèi)皮素系統(tǒng)一全身地或局部地一是治療許多疾病諸如蛛網(wǎng)膜下腔或腦出血所關(guān)注的。內(nèi)皮素還影響多發(fā)性硬化的病程。內(nèi)皮素是(肺動(dòng)脈)高血壓的原因，而且也是低動(dòng)脈壓、心肌病和雷諾綜合征、變異型心絞痛和其他心血管疾病的原因。內(nèi)皮素參與糖尿病性腎病和糖尿病性視網(wǎng)膜病變。在眼中，它還對(duì)青光眼性神經(jīng)變性、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、巨細(xì)胞性關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性、中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、Morbus Leber、Susac綜合征、眼內(nèi)出血、視網(wǎng)膜前神經(jīng)膠質(zhì)增生和某些其他病理學(xué)病況起作用。
[0010]眼是精密器官，其強(qiáng)烈依賴于平衡的且充足的灌注以達(dá)到它的高需氧量。無(wú)法提供充足且穩(wěn)定的供氧會(huì)引起局部缺血-再灌注損傷，導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)活化和神經(jīng)元損害，如在患有漸進(jìn)性疾病的青光眼患者中所觀察到的，盡管其具有正?；驑?biāo)準(zhǔn)化的眼內(nèi)壓。如在糖尿病性視網(wǎng)膜病變或濕性年齡相關(guān)性黃斑變性中顯而易見(jiàn)的，不充足的血液供給還導(dǎo)致低氧，引起具有進(jìn)一步視網(wǎng)膜損害潛能的失控的(run-away)新血管形成。眼組織灌注在復(fù)雜控制之下并且依賴于血壓、眼內(nèi)壓以及調(diào)節(jié)血管直徑的局部因子。此類局部因子例如提及的內(nèi)皮素、具有強(qiáng)血管收縮活性的短肽。內(nèi)皮素的三種同工型(ET-1、ET-2和ET-3)由內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶從位于血管壁中的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的前體分子來(lái)產(chǎn)生。成熟ET的兩個(gè)同族受體是已知的，ETRA和ETRB。盡管ETRA位于形成血管壁的平滑肌細(xì)胞中并促進(jìn)血管收縮，但ETRB主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞中，并且通過(guò)促進(jìn)一氧化氮的釋放來(lái)使血管舒張，因而引起平滑肌松弛。ETRA和ETRB屬于G蛋白偶聯(lián)的七跨膜螺旋受體的大類。ET與ETRA或ETRB的結(jié)合導(dǎo)致G蛋白活化，因而引發(fā)胞內(nèi)鈣濃度的升高，并由此引起一大批的細(xì)胞反應(yīng)。
[0011]藥理學(xué)上影響ET系統(tǒng)可能證明在其中ET水平升高并且ET以有害形式起作用的病例中，諸如在視網(wǎng)膜靜脈阻塞、青光眼性神經(jīng)變性、視網(wǎng)膜色素變性、巨細(xì)胞性關(guān)節(jié)炎、中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、多發(fā)性硬化、視神經(jīng)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Susac綜合征、輻射性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜前神經(jīng)膠質(zhì)增生、纖維肌痛和糖尿病性視網(wǎng)膜病變過(guò)程中是有用的。為此目的，下調(diào)ETRA將有助于調(diào)節(jié)疾病結(jié)果。但在某些情況下，上調(diào)ETRA并因此對(duì)ET提高的敏感性可能是希望的，例如以促進(jìn)在從角膜外傷或角膜潰瘍恢復(fù)過(guò)程中的角膜傷口愈合。
[0012]此外,ETRB介導(dǎo)的信號(hào)傳遞例如在癌癥干細(xì)胞維持和腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中與病例生理學(xué)過(guò)程有關(guān)。此外，上調(diào)ETRB與青光眼性神經(jīng)變性有關(guān)，而抑制ETRB則顯示出在青光眼過(guò)程中起神經(jīng)保護(hù)作用。此外，ETRB在炎癥過(guò)程中被上調(diào)。因此，通過(guò)特異性人工轉(zhuǎn)錄因子藥理學(xué)上調(diào)節(jié)ETRB將可用于治療癌癥，預(yù)防神經(jīng)變性和調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程。
[0013]細(xì)菌細(xì)胞壁組分諸如脂多糖(LPS)在多種疾病的發(fā)病中起重要作用。體內(nèi)存在LPS指向需要由免疫系統(tǒng)針對(duì)的細(xì)菌感染。由于LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌的一般組分，因此LPS構(gòu)成了能夠激活免疫系統(tǒng)的所謂的危險(xiǎn)信號(hào)。LPS由Toll樣受體4 (TLR4)所識(shí)別，所述Toll樣受體4是參與識(shí)別多種危險(xiǎn)信號(hào)或與細(xì)菌或病毒感染相關(guān)的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)的Toll樣受體的更大家族的成員。盡管識(shí)別LPS為危險(xiǎn)信號(hào)是先天免疫的重要部分，但TLR4受體的過(guò)度刺激或延長(zhǎng)的刺激與多種與慢性炎癥有關(guān)的病理學(xué)病況相關(guān)。實(shí)例是多種肝疾病，諸如酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、慢性乙型肝炎或丙型肝炎病毒(HCV)感染、和HIV-HCV共感染。其他與TLR4信號(hào)傳遞相關(guān)的疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、銀屑病、克羅恩氏病、葡萄膜炎、接觸鏡相關(guān)性角膜炎和角膜炎癥。此外，TLR4介導(dǎo)的信號(hào)傳遞參與癌癥進(jìn)展(cancer progression)和對(duì)化學(xué)療法的抗性。
[0014]藥理學(xué)上影響LPS識(shí)別和TLR4信號(hào)傳遞可能證明對(duì)于與由于TLR4的不恰當(dāng)活化而導(dǎo)致的慢性炎癥有關(guān)的疾病是有用的。因此，通過(guò)靶向TLR4啟動(dòng)子的特異性負(fù)調(diào)節(jié)的人工轉(zhuǎn)錄因子的作用來(lái)下調(diào)TLR4蛋白，會(huì)有助于通過(guò)破壞由LPS導(dǎo)致的慢性炎癥的惡性循環(huán)來(lái)調(diào)節(jié)疾病結(jié)果。 [0015]免疫球蛋白同種型E(IgE)是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的部分，并且同樣參與針對(duì)感染以及致瘤性轉(zhuǎn)化的保護(hù)。IgE通過(guò)位于肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞上的高親和力IgE受體(FCERl)來(lái)結(jié)合。IgE與FCERl的結(jié)合及隨后經(jīng)稱為變應(yīng)原的特異性抗原交聯(lián)這些復(fù)合體導(dǎo)致多種因子從肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞中釋放，引起變應(yīng)性應(yīng)答。在這些因子中有組胺、白細(xì)胞三烯類、多種細(xì)胞因子以及溶菌酶、類胰蛋白酶或己糖胺酶。這些因子的釋放與變應(yīng)性疾病諸如變應(yīng)性鼻炎、哮喘、濕疹和過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)。
[0016]發(fā)明概述
本發(fā)明涉及人工轉(zhuǎn)錄因子，其包含融合至抑制或激活蛋白結(jié)構(gòu)域、核定位序列和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的特異性靶向受體基因啟動(dòng)子的多指鋅指蛋白，并且涉及包含此類人工轉(zhuǎn)錄因子的藥物組合物。此外，本發(fā)明涉及此類人工轉(zhuǎn)錄因子用于調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)外界刺激和對(duì)其他可溶性信號(hào)分子的反應(yīng)的用途，以及在治療由特異性效應(yīng)物與此類受體的結(jié)合所調(diào)節(jié)的疾病中的用途。
[0017]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，受體基因啟動(dòng)子是內(nèi)皮素受體A啟動(dòng)子。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及此類人工轉(zhuǎn)錄因子，其用于影響對(duì)內(nèi)皮素的細(xì)胞應(yīng)答，以降低或提高內(nèi)皮素受體水平，并且用于治療由內(nèi)皮素調(diào)節(jié)的疾病，尤其用于治療此類眼疾病。同樣，本發(fā)明涉及治療由內(nèi)皮素調(diào)節(jié)的疾病的方法，其包括向有其需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的人工轉(zhuǎn)錄因子。
[0018]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及人工轉(zhuǎn)錄因子中間體，其包含融合至抑制或激活蛋白結(jié)構(gòu)域和核定位序列的特異性靶向內(nèi)皮素受體A啟動(dòng)子的多指鋅指蛋白。
[0019]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，受體基因啟動(dòng)子是內(nèi)皮素受體B啟動(dòng)子。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及此類人工轉(zhuǎn)錄因子，其用于影響對(duì)內(nèi)皮素的細(xì)胞應(yīng)答，以降低或提高內(nèi)皮素受體B水平，并且用于治療由內(nèi)皮素調(diào)節(jié)的疾病，尤其用于治療此類眼疾病。同樣，本發(fā)明涉及治療由內(nèi)皮素調(diào)節(jié)的疾病的方法，其包括向有其需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的人工轉(zhuǎn)錄因子。
[0020]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及人工轉(zhuǎn)錄因子中間體，其包含融合至抑制或激活蛋白結(jié)構(gòu)域和核定位序列的特異性靶向內(nèi)皮素受體B啟動(dòng)子的多指鋅指蛋白。
[0021]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，受體基因啟動(dòng)子是Toll樣受體4啟動(dòng)子。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及此類人工轉(zhuǎn)錄因子，其用于影響對(duì)脂多糖的細(xì)胞應(yīng)答，以降低或提高Toll樣受體4水平，并且用于治療由脂多糖調(diào)節(jié)的疾病，尤其用于治療眼疾病。同樣，本發(fā)明涉及治療由脂多糖調(diào)節(jié)的疾病的方法，其包括向有其需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的人工轉(zhuǎn)錄因子。 [0022]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及人工轉(zhuǎn)錄因子中間體，其包含融合至抑制或激活蛋白結(jié)構(gòu)域和核定位序列的特異性靶向Toll樣受體4啟動(dòng)子的多指鋅指蛋白。
[0023]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，受體基因啟動(dòng)子是高親和力免疫球蛋白ε受體亞基α啟動(dòng)子。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及此類人工轉(zhuǎn)錄因子，其用于影響對(duì)免疫球蛋白E (IgE)的細(xì)胞應(yīng)答，以降低或提高高親和力IgE受體水平，并且用于治療由IgE調(diào)節(jié)的疾病，尤其用于治療眼疾病。同樣，本發(fā)明涉及治療由IgE調(diào)節(jié)的疾病的方法，其包括向有其需要的患者施用治療有效量的本發(fā)明的人工轉(zhuǎn)錄因子。
[0024]在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及人工轉(zhuǎn)錄因子中間體，其包含融合至抑制或激活蛋白結(jié)構(gòu)域和核定位序列的特異性靶向高親和力免疫球蛋白ε受體亞基α啟動(dòng)子的多指鋅指蛋白。
[0025]附圖簡(jiǎn)述
圖1:通過(guò)調(diào)節(jié)受體表達(dá)改變細(xì)胞敏感性
通過(guò)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)諸如TAT或其他的作用將人工轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中，所述人工轉(zhuǎn)錄因子含有融合至抑制/激活結(jié)構(gòu)域(RD=調(diào)節(jié)域)以及核定位序列(NLS)的特異性靶向受體基因(RG)啟動(dòng)子(P)的六聚鋅指(ZF)蛋白。根據(jù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域，受體基因表達(dá)提高(+)或抑制(_)，分別產(chǎn)生增強(qiáng)的或減少的對(duì)受體(R1、R2或R3)激動(dòng)劑(A)的細(xì)胞敏感性。
[0026]圖2:人內(nèi)皮素受體A (ETRA)啟動(dòng)子區(qū)
顯示了含有假定的ETRA啟動(dòng)子的ETRA基因的5’非翻譯區(qū)。突出顯示的是轉(zhuǎn)錄起始(用+1標(biāo)記)和人工轉(zhuǎn)錄因子潛在的15bp和18 bp靶位點(diǎn)(TS)(下劃線表示并標(biāo)記為TS-855、TS-555、TS-487、TS-447、TS-306、TS-230、TS-103、TS-37、TS+74)。
[0027]圖3:人Toll樣等體4 (TLR4)啟動(dòng)子區(qū)
顯示了含有TLR4啟動(dòng)子的TLR4基因的5’區(qū)。突出顯示的是轉(zhuǎn)錄起始(用+1標(biāo)記)、第一外顯子的起始密碼子和可讀框(粗體字母)和特異性人工轉(zhuǎn)錄因子潛在的18 bp靶位點(diǎn)(下劃線表示并標(biāo)記為TS-276、TS-55、TS+113)。
[0028]圖4:高親和力IgE等體A (FCERlA)啟動(dòng)子區(qū)顯示了含有鄰近的、組成型啟動(dòng)子的FCERlA基因的5’區(qū)。突出顯示的是轉(zhuǎn)錄起始(用+1標(biāo)記)、第一外顯子的起始密碼子和可讀框(粗體字母)和特異性人工轉(zhuǎn)錄因子潛在的18bp靶位點(diǎn)(下劃線表示并標(biāo)記為TS-147和TS+17)。
[0029]圖5:人內(nèi)皮素受體B (ETRB)啟動(dòng)子區(qū)
顯示了含有ETRB啟動(dòng)子的ETRB基因的5’區(qū)。突出顯示的是翻譯起始(用+1標(biāo)記)和特異性人工轉(zhuǎn)錄因子潛在的18 bp靶位點(diǎn)(下劃線表示并標(biāo)記為TS-1149和TS-487)。由于報(bào)道了幾個(gè)可變轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(AraiH.等，1993，JBiol Chem 268, 3463-70; TsutsumiM.等，1999，Gene 4, 43_9),選擇翻譯起始位點(diǎn)作為命名祀位點(diǎn)的參考點(diǎn)。
[0030]圖6:人工轉(zhuǎn)錄閔子
A)將多種鋅指蛋白克隆入三個(gè)不同質(zhì)粒中。顯示唯一的限制酶位點(diǎn)以突出多種表達(dá)質(zhì)粒的模塊設(shè)計(jì)。產(chǎn)生的DNA構(gòu)建體編碼以下融合蛋白:KRAB-NLS-6ZFP-3xmyc (SEQ ID NO:8)、SID-NLS-6ZFP-3xmyc、
NLS-6ZFP-GGSGGS (SEQ ID NO: 9)接頭-KRAB A-3xmyc 和
NLS-6ZFP-GGSGGS 接頭-VP64_3xmyc。
[0031]圖7:通討人工轉(zhuǎn)錄閔子A074A、A074E、A074R和A074V調(diào)節(jié)人內(nèi)皮素等體A(ETRA)活性
(A)ETRA啟動(dòng)子驅(qū) 動(dòng)的蛋白表達(dá)的人工轉(zhuǎn)錄因子依賴的阻抑。顯示了表達(dá)指向ETRA啟動(dòng)子內(nèi)的靶位點(diǎn)的A074A (SEQ ID NO: 10)、A074E (SEQ ID NO: 11)、A074R (SEQ ID NO: 12)和A074V (SEQ ID NO: 13)后的螢光素酶報(bào)道基因測(cè)定(RLuA =相對(duì)螢光素酶活性，相對(duì)于對(duì)照C，以％計(jì))的結(jié)果。C =作為對(duì)照的黃色熒光蛋白(YFP)。
(B)A074Vp (SEQ ID NO: 14)，轉(zhuǎn)導(dǎo)的A074V蛋白，相比于對(duì)照B (緩沖液處理的細(xì)胞)不抑制HeLa細(xì)胞增殖。RP =以對(duì)照的％計(jì)的相對(duì)增殖。
(C)A074Vp相比于對(duì)照B (緩沖液處理的細(xì)胞)不抑制人子宮平滑肌細(xì)胞(hUtSMC)的增殖。
(D)A074Vp阻斷了 hUtSMC的ET-1依賴性收縮。將hUtSMC植入三維膠原網(wǎng)格。C =作為對(duì)照的用緩沖液處理的細(xì)胞。B =用緩沖液和ET-1處理的細(xì)胞。A074Vp =用A074Vp和ET-1處理的細(xì)胞。RLA=以對(duì)照C的％計(jì)的相對(duì)網(wǎng)格面積。細(xì)節(jié)描述于下文。
[0032]圖8:通討人工轉(zhuǎn)錄閔子A074Ra和A074Va驅(qū)動(dòng)的ETRA啟動(dòng)子活件的增強(qiáng)
(A)激活人工轉(zhuǎn)錄因子A074Ra(SEQ ID NO: 15)和A074Va (SEQ ID NO: 16)表達(dá)后，ETRA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢光素酶報(bào)道基因的表達(dá)升高。RLuA =相對(duì)螢光素酶活性，以相對(duì)于對(duì)照C(YFP)的％計(jì)。
(B)用A074Vap(SEQ ID NO: 17)處理并不抑制hUtSMCs細(xì)胞增殖。作為蛋白遞送的A074Vp對(duì)hUtSMCs細(xì)胞沒(méi)有毒性，并且并不負(fù)面影響細(xì)胞增殖。B =緩沖液處理的細(xì)胞。RP=以對(duì)照的％計(jì)的相對(duì)增殖。
[0033]圖9:通討A01149N和A01149P的人內(nèi)皮素等體B (ETRB)啟動(dòng)子的陽(yáng).抑 在螢光素酶報(bào)道基因測(cè)定中，人工轉(zhuǎn)錄因子A01149N (SEQ ID NO: 18)和A01149P (SEQ
ID NO: 19)的表達(dá)相對(duì)于YFP (對(duì)照C)阻抑了 ETRB啟動(dòng)子活性。RLuA =相對(duì)螢光素酶活性，以相對(duì)于對(duì)照C的％計(jì)。
[0034]圖10:通討A055B和A055E的人Toll樣等體4 (TLR4)活件的調(diào)節(jié)(A)在螢光素酶報(bào)道基因測(cè)定中，A055B(SEQ ID NO: 20)和A055E (SEQ ID NO: 21)的表達(dá)相對(duì)于YFP (對(duì)照C)阻斷了 TLR4啟動(dòng)子活性。RLuA =相對(duì)螢光素酶活性，以相對(duì)于對(duì)照C的％計(jì)。
(B)在巨噬細(xì)胞樣U937細(xì)胞中表達(dá)A055B后，TLR4依賴性的、LPS誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素(IL) -6 的分泌變?nèi)?blunted)。
(C)用A055Bp(SEQ ID NO: 22)處理并不抑制HeLa細(xì)胞增殖。RP =以對(duì)照的％計(jì)的相對(duì)增殖。B =緩沖液處理的細(xì)胞。RP =以對(duì)照的％計(jì)的相對(duì)增殖。
[0035]圖11:高親和力IgE等體通討AOl47A調(diào)節(jié)
⑷A0147A (SEQ ID NO: 23)表達(dá)后，高親和力IgE受體α亞基(FCERlA)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的螢光素酶報(bào)道基因的表達(dá)在大鼠嗜堿RBL-2H3細(xì)胞中被抑制。RLuA =相對(duì)螢光素酶活性，以相對(duì)于對(duì)照C (YFP)的％計(jì)。
(B)A0147Ap (SEQ ID NO: 24)并不抑制HeLa細(xì)胞增殖。B =緩沖液處理的細(xì)胞。RP =以對(duì)照的％計(jì)的相對(duì)增殖。
C).用Α0147Αρ處理抑制人IgE與人嗜堿KU812F細(xì)胞的結(jié)合為80%左右。IgEB =使用人IgE和用FITC標(biāo)記的小鼠抗人IgE通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的IgE對(duì)FCERl的結(jié)合能力，以相對(duì)于作為對(duì)照的緩沖液處理的細(xì)胞(B)的％計(jì)。 [0036]發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及人工轉(zhuǎn)錄因子，其包含融合至抑制或激活蛋白結(jié)構(gòu)域、核定位序列和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的特異性靶向受體基因啟動(dòng)子的多指鋅指蛋白，并且涉及包含此類人工轉(zhuǎn)錄因子的藥物組合物。
[0037]許多疾病的治療基于調(diào)節(jié)細(xì)胞受體信號(hào)傳遞。實(shí)例是高血壓(其中β阻斷劑抑制β腎上腺素能受體的功能)、抑郁(其中5-羥色胺攝取阻斷劑增加激動(dòng)劑濃度和因此的5-羥色胺受體信號(hào)傳遞)、或青光眼(其中前列腺素類似物活化前列腺素受體，繼而降低眼內(nèi)壓)。傳統(tǒng)上，為了治療目的，使用以受體激動(dòng)劑或拮抗劑形式的小分子來(lái)影響受體信號(hào)傳遞。然而，細(xì)胞受體信號(hào)傳遞還能夠被受體蛋白表達(dá)的直接調(diào)節(jié)所影響。
[0038]順從于受體表達(dá)水平的直接調(diào)節(jié)的病理學(xué)過(guò)程例如為以下:患有由于先天性心臟病的充血性心力衰竭的患者將受益于β腎上腺素受體的上調(diào)，這是由于該受體在心肌中的下調(diào)與手術(shù)后心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。在帕金森氏病中，用多巴胺能藥療法的治療抑制多巴胺受體的可利用性，因此，多巴胺受體的上調(diào)將改善多巴胺能藥療法的效力。在癲癇中，海馬中大麻素受體表達(dá)不足涉及疾病病因?qū)W，因此，大麻素受體的上調(diào)將是癲癇患者的可行療法。
[0039]對(duì)于由受體蛋白的單倍劑量不足引起的遺傳疾病，諸如引起生長(zhǎng)遲緩的胰島素樣生長(zhǎng)因子I受體，但還有其他的，額外激活剩余的有功能的受體基因?qū)⒂幸嬗诨颊?。此外并在其他中，病理性自身免疫的誘導(dǎo)和永續(xù)性(perpetuation)與從Toll樣受體的不恰當(dāng)信號(hào)傳遞相關(guān)聯(lián)。因此，下調(diào)Toll樣受體破壞多種自身免疫疾病的惡性循環(huán)。在變應(yīng)性疾病中，通過(guò)高親和力IgE受體防止IgE介導(dǎo)的信號(hào)傳遞用于操縱變應(yīng)性反應(yīng)。在癌癥中，下調(diào)生長(zhǎng)因子受體或上調(diào)胞外基質(zhì)受體對(duì)于防止腫瘤進(jìn)展是有利的。
[0040]在此類受體分子中的是來(lái)自所謂的七跨膜或G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)蛋白家族的蛋白，其特征在于將受體錨定在質(zhì)膜中的七跨膜結(jié)構(gòu)域和G蛋白依賴性信號(hào)級(jí)聯(lián)放大。此類蛋白的實(shí)例是內(nèi)皮素的受體A和B。其他受體蛋白經(jīng)單跨膜區(qū)錨定，例如脂多糖的受體、Toll樣受體4或多種細(xì)胞因子受體諸如IL-4受體。其他受體由多聚蛋白復(fù)合體組成，例如由α、β和Y鏈組成的IgE抗體的高親和力受體，或者由α、β、Y、δ、ε和ζ鏈組成的T細(xì)胞受體。因此，在術(shù)語(yǔ)“受體分子”下包含的是來(lái)自不同蛋白家族具有非常不同的作用模式的蛋白。
[0041]本發(fā)明中考慮的受體是人受體分子，其由以下編碼:
【權(quán)利要求】
1.人工轉(zhuǎn)錄因子，其包含融合至抑制或激活蛋白結(jié)構(gòu)域、核定位序列和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的特異性靶向受體基因啟動(dòng)子的多指鋅指蛋白。
2.人工轉(zhuǎn)錄因子，其中受體基因啟動(dòng)子是內(nèi)皮素受體A啟動(dòng)子。
3.人工轉(zhuǎn)錄因子，其中受體基因啟動(dòng)子是內(nèi)皮素受體B啟動(dòng)子。
4.人工轉(zhuǎn)錄因子，其中受體基因啟動(dòng)子是Toll樣受體4啟動(dòng)子。
5.人工轉(zhuǎn)錄因子，其中受體基因啟動(dòng)子是FCERlA啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求1、2、3、4或5的人工轉(zhuǎn)錄因子，其包含六聚鋅指蛋白。
7.權(quán)利要求2、3、4或5的人工轉(zhuǎn)錄因子，其包含具有選自以下的蛋白序列的鋅指蛋白:SEQ ID NO: 31 至 SEQ ID NO: 37,SEQ ID NO: 39 至 SEQ ID NO: 43,SEQ ID NO: 45 至 SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO:52,SEQ IDN0:54 至 SEQ ID NO:57,SEQ IDN0:59 至 SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:66 MSEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82 至 SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97 至 SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 120至 SEQ ID NO: 136,SEQ ID NO: 138 至 SEQ ID NO: 143,SEQ ID NO: 145 至 SEQ ID NO: 153,SEQ IDNO: 155 至 SEQ ID NO: 164,SEQ ID NO: 166 至 SEQ ID NO: 173,SEQ ID NO: 175 至 SEQ ID NO: 181、和 SEQ ID NO: 183 至 SEQ ID NO: 191。
8.權(quán)利要求 2、3、4或5的人工轉(zhuǎn)錄因子，其包含具有選自以下蛋白序列的鋅指蛋白:SEQ ID NO 56、83、85、101、114、118、127、133、140、142、146、147、156、159、175、和 181。
9.權(quán)利要求2、3、4或5的人工轉(zhuǎn)錄因子，其包含SEQID NO 118、133、156、或175的鋅指蛋白。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的人工轉(zhuǎn)錄因子，其中所述鋅指蛋白融合至抑制蛋白結(jié)合域。
11.權(quán)利要求10的人工轉(zhuǎn)錄因子，其中所述抑制蛋白結(jié)構(gòu)域是SEQID NO:1的N-末端KRAB, SEQ ID NO: 2 的 C-末端的 KRAB、SEQ ID NO: 3 的 SID、或 SEQ ID NO: 4 的 ERD。
12.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的人工轉(zhuǎn)錄因子，其中所述鋅指蛋白融合至激活蛋白結(jié)合域。
13.權(quán)利要求12的人工轉(zhuǎn)錄因子，其中所述激活蛋白結(jié)構(gòu)域是SEQID NO: 5的VP16或SEQ ID NO: 6 的 VP64。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的人工轉(zhuǎn)錄因子，其中所述核定位序列是含有K-K/R-X-K/R共有序列的堿性氨基酸簇或SEQ ID NO: 196的SV40 NLS。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的人工轉(zhuǎn)錄因子，其中所述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是SEQIDNO: 7 的 HIV 衍生的 TAT 肽、HSV-1 VP22 肽、SEQ ID NO: 192 的合成肽 mT02、SEQ ID NO: 193的合成肽mT03、SEQ ID NO: 194的R9肽、ANTP結(jié)構(gòu)域、或保護(hù)性抗原/致死因子N末端PTD。
16.人工轉(zhuǎn)錄因子，其包含融合至抑制或激活蛋白結(jié)構(gòu)域和核定位序列的特異性靶向內(nèi)皮素受體A啟動(dòng)子的多指鋅指蛋白。
17.人工轉(zhuǎn)錄因子，其包含融合至抑制或激活蛋白結(jié)構(gòu)域和核定位序列的特異性靶向內(nèi)皮素受體B啟動(dòng)子的多指鋅指蛋白。
18.人工轉(zhuǎn)錄因子，其包含融合至抑制或激活蛋白結(jié)構(gòu)域和核定位序列的特異性靶向Toll樣受體4啟動(dòng)子的多指鋅指蛋白。
19.人工轉(zhuǎn)錄因子，其包含融合至抑制或激活蛋白結(jié)構(gòu)域和核定位序列的特異性靶向FCERlA啟動(dòng)子的多指鋅指蛋白。
20.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-19的人工轉(zhuǎn)錄因子。
21.權(quán)利要求1-19的人工轉(zhuǎn)錄因子，其用于調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)外界刺激和對(duì)其他可溶性信號(hào)分子的反應(yīng)。
22.權(quán)利要求1-19的人工轉(zhuǎn)錄因子，其用于治療由特異性效應(yīng)物與受體的結(jié)合所調(diào)節(jié)的疾病，為此所述多指鋅指蛋白特異性靶向所述受體基因啟動(dòng)子。
23.權(quán)利要求2或6-16的人工轉(zhuǎn)錄因子，其用于影響對(duì)內(nèi)皮素的細(xì)胞應(yīng)答，以降低或提高內(nèi)皮素受體A水平，并且用于治療由內(nèi)皮素調(diào)節(jié)的疾病。
24.權(quán)利要求3、6-15或17的人工轉(zhuǎn)錄因子，其用于影響對(duì)內(nèi)皮素的細(xì)胞應(yīng)答，以降低或提高內(nèi)皮素受體B水平，并且用于治療由內(nèi)皮素調(diào)節(jié)的疾病。
25.權(quán)利要求4、6-15或18的人工轉(zhuǎn)錄因子，其用于影響對(duì)脂多糖的細(xì)胞應(yīng)答，以降低或提高Toll樣受體4水平，并且用于治療由脂多糖調(diào)節(jié)的疾病。
26.權(quán)利要求5-15或19的人工轉(zhuǎn)錄因子，其用于影響對(duì)IgE的細(xì)胞應(yīng)答，以降低或提高IgE受體水平，并且用于治療由IgE調(diào)節(jié)的疾病。
27.治療疾病的方法，其包括向有其需要的患者施用治療有效量的權(quán)利要求1-26的人工轉(zhuǎn)錄因子，其中待治療疾病由特異性效應(yīng)物與受體的結(jié)合所調(diào)節(jié)，為此所述多指鋅指蛋白特異性靶向所述受體基因啟動(dòng)子。
28.治療由內(nèi)皮素調(diào) 節(jié)的疾病的方法，其包括向有其需要的患者施用治療有效量的權(quán)利要求2、3或6-17的人工轉(zhuǎn)錄因子。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK103998609SQ201280049781
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月11日
【發(fā)明者】J.弗拉梅, A.紐茨納, A.赫克斯利 申請(qǐng)人:阿里奧弗塔股份公司