修飾植物基因組的方法和手段的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了使用雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)酶以靶向方式緊靠現(xiàn)有原種事件修飾植物的基因組的方法和手段。還提供了植物，特別是棉花植物和制備此類植物的方法，所述植物對至少1X田間劑量的至少一種HPPD抑制劑顯示出耐受性。
【專利說明】修飾植物基因組的方法和手段
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)學(xué)領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明提供使用定制設(shè)計的雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)酶在植物基因組中精確定位的核苷酸序列上引入靶向修飾，包括插入、缺失或取代的方法和手段。本發(fā)明還涉及包含嵌合基因的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子，所述嵌合基因包含編碼具有HPro活性的蛋白質(zhì)的核酸序列，其中所述蛋白質(zhì)在對應(yīng)于SEQ ID N0:1的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白質(zhì)向所述植物提供對至少IX田間劑量的至少一種HPro抑制劑的耐受性；并且提供制備此類植物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在植物基因組中引入靶向修飾的需求，例如以向植物提供農(nóng)學(xué)上有用的性狀，如除草劑耐受性(包括控制在植物中外源DNA整合的定位)已變得日益重要。為了滿足這一需求，已經(jīng)開發(fā)了若干方法(綜述參見Kumar (庫馬爾)和Fladung (弗拉東)，2001, Trendsin Plant Science (《植物科學(xué)趨勢》)，6，ppl55_159)。這些方法大部分依賴于經(jīng)由雙鏈斷裂誘導(dǎo)(DSBI)酶的表達，在靶向位置初始引入的雙鏈DNA斷裂。
[0003]經(jīng)由罕見切割內(nèi)切核酸酶(例如1-SceI)，通過誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂(DSB)，激活靶基因座和/或修復(fù)或供體DNA，已經(jīng)示出出增加若干數(shù)量級的同源重組的頻率(Puchta (普赫塔)等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(美國國家科學(xué)院院刊)),93, pp5055-5060; Chilton (奇爾頓)和 Que (秋)，Plant Physiol.(《植物生理學(xué)》)，2003; D’Halluin(阿呂安)等人，2008Plant Biotechnol.J.(《植物生物技術(shù)雜志》)6,93-102)。
[0004]W096/14408描述了一種編碼酶1-SceI的分離DNA。這種DNA序列可以并入克隆和表達載體、轉(zhuǎn)化細胞系和轉(zhuǎn)基因動物中。在基因作圖和基因的定點插入中這些載體可以是有用的。
[0005]W000/46386描述了通過1-SceI誘導(dǎo)的雙鏈斷裂，在細胞中修飾、修復(fù)、減弱和滅活一個基因或其他染色體DNA的方法。還披露了在需要其的個體中治療或預(yù)防遺傳性疾病的方法。進一步披露了嵌合的限制性內(nèi)切酶。
[0006]W02005/049842描述了使用罕見分裂“雙鏈斷裂”誘導(dǎo)(DSBI)酶連同改進的1-SceI編碼核苷酸序列改進植物中靶向DNA插入的方法和手段。
[0007]W02006/105946描述了用于通過同源重組在植物細胞和植物中將靶DNA序列精確交換為感興趣的DNA序列的方法，由此可以隨后去除在用于基因取代事件的臨時選擇的同源重組階段期間使用的可選擇的或可篩選的標(biāo)記，而在去除步驟期間不遺留痕跡并且不依靠體外培養(yǎng)，采用其中描述的方法用于通過小孢子特異性表達的DSBI罕見分裂內(nèi)切核酸酶去除選擇的DNA。
[0008]W02008/037436描述了 W02006/105946方法和手段的變體，其中通過雙鏈斷裂誘導(dǎo)罕見分裂內(nèi)切核酸酶誘導(dǎo)的選擇的DNA片段的去除步驟處于種系特異啟動子的控制下。該方法的其他實施例依賴在修復(fù)DNA的一端的非同源末端-連接和在另一端的同源重組。W008/148559描述了 W02008/037436方法的變體，即在真核細胞中(例如植物細胞)中通過同源重組用于將靶DNA序列精確交換為感興趣的DNA序列的方法，由此可以隨后去除在用于基因取代事件的臨時選擇的同源重組階段期間使用的可選擇的或可篩選的標(biāo)記，而不遺留痕跡，采用用于去除在直接重復(fù)中側(cè)翼是兩個核苷酸序列的選擇的DNA的方法。
[0009]W02003/004659披露了重組系統(tǒng)以及用于從真核生物染色體DNA去除核酸序列的方法。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因生物(優(yōu)選地植物)，包含所述系統(tǒng)或由所述方法產(chǎn)生。
[0010]W02006/032426披露了改進的重組系統(tǒng)以及用于從植物基因組中消除標(biāo)記序列的方法。具體地，本發(fā)明基于一種表達盒的用途，該表達盒包括歐芹泛素啟動子，以及可操作地連接到其上的編碼特異DNA-核酸內(nèi)切酶序列的核酸序列。
[0011]美國臨時申請61/493579和EP11004570.5描述了使用雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)酶和胚胎發(fā)生性愈傷組織以靶定方式修飾棉花植物的基因組的方法和手段。
[0012]此外，已經(jīng)描述了這樣的方法，其允許設(shè)計稀有切割內(nèi)切核酸酶，以改變酶的底物或序列特異性，因此允許在目的基因座上誘導(dǎo)雙鏈斷裂，但不依賴于任何天然稀有切割內(nèi)切核酸酶的識別位點的存在。簡言之，可以使用設(shè)計用于識別特異性核苷酸序列的鋅指結(jié)構(gòu)域與來自天然限制性內(nèi)切核酸酶，如FokI的非特異性DNA切割結(jié)構(gòu)域之間的雜合體來制備嵌合的限制酶。此類方法已經(jīng)描述于例如W003/080809、W094/18313或W095/09233和Isalan 等,2001, Nature Biotechnologyl9, 656-660;Liu 等 1997, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94, 5525-5530)中。通過從變體文庫中進行選擇來產(chǎn)生定制的大范圍核酸酶的另一方式描述于W02004/067736中。還可以通過如W02007/047859中描述的合理設(shè)計獲得具有改變的序列特異性和DNA結(jié)合親和力的定制大范圍核酸酶或重新設(shè)計的大范圍核酸酶。
[0013]W02007/049095描述了 “LADGLIDADG”歸巢內(nèi)切核酸酶變體，其在兩個分開的亞結(jié)構(gòu)域中具有突變，每一個亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合修飾的DNA靶半位點的不同部分，從而內(nèi)切核酸酶變體能夠切割包含每一個亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合的核苷酸的嵌合DNA靶序列。
[0014]W02007/049156和W02`007/093836描述了具有新的切割特異性的1-CreI歸巢內(nèi)切核酸酶變體及其用途。
[0015]W02007/047859描述了合理設(shè)計的具有改變的序列特異性和DNA結(jié)合親和力的大范圍內(nèi)切核酸酶。
[0016]WOl 1/064736描述了優(yōu)化的內(nèi)切核酸酶，以及使用優(yōu)化的內(nèi)切核酸酶靶向整合、靶向缺失或靶向突變多核苷酸的方法。W011/064750描述了包含內(nèi)切核酸酶和異源DNA結(jié)合域(其包含一個或多個Zn2C6鋅指)的嵌合內(nèi)切核酸酶，以及使用嵌合內(nèi)切核酸酶靶向整合、靶向缺失或靶向突變多核苷酸的方法，并且W011/064751描述了包含內(nèi)切核酸酶和異源DNA結(jié)合域的嵌合內(nèi)切核酸酶，以及使用嵌合內(nèi)切核酸酶靶向整合、靶向缺失或靶向突變多核苷酸的方法。
[0017]PCT/EP11/002894和PCT/EP11/002895描述了以靶定方式修飾包含嵌合基因的轉(zhuǎn)基因植物的植物基因組的方法和手段，其中所述嵌合基因具有通常用于植物分子生物學(xué)中的DNA元件，以及重新設(shè)計的大范圍內(nèi)切核酸酶，以切割通常用于植物分子生物學(xué)中的該元件。
[0018]W02009/006297描述了用于改變單子葉植物細胞和單子葉植物的基因組的方法和組合物，其涉及使用雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑，以改變包含雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑的識別序列的單子葉植物或植物細胞基因組序列。
[0019]Gao等2010，The Plant Journal61,第176 - 187頁描述了使用重新設(shè)計的內(nèi)切核
酸酶在玉米中進行可遺傳定向誘變。
[0020]然而，為了有效產(chǎn)生農(nóng)藝學(xué)有用性狀的組合而不必借助于精細的育種方案或不必測試大量單一事件，因此仍然需要在功能上重新設(shè)計的大范圍核酸酶(其可以識別緊靠已存在的原種事件的識別位點)，及其用途，以在單個遺傳基因座上產(chǎn)生賦予農(nóng)藝學(xué)上有用的性質(zhì)的大量基因。
[0021]此類農(nóng)藝學(xué)上有用的性狀之一是對除草劑，如HPPD-抑制劑型除草劑的耐受性。HPro(羥苯丙酮酸二加氧酶)蛋白質(zhì)是催化這樣的反應(yīng)的酶，在所述反應(yīng)中對羥基苯丙酮酸(本文中縮寫為HPP)(其為酪氨酸降解產(chǎn)物)被轉(zhuǎn)化成尿黑酸(本文中縮寫為HG)，尿黑酸為植物中生育酚和質(zhì)體醌的前體(Crouch N.P.等(1997)Tetrahedron, 53，20，6993-7010，F(xiàn)ritze 等，(2004), Plant Physiologyl34:1388-1400)。生育酹作為膜結(jié)合的抗氧化劑起作用。質(zhì)體醌首先作為光系統(tǒng)II (PSII)與細胞色素b6/f復(fù)合體之間的電子載體起作用，其次是八氫番茄紅素去飽和酶(其參與類胡蘿卜素的生物合成)的氧化還原輔助因子。
[0022]迄今為止，NCBI數(shù)據(jù)庫中存在的多種生物的多于700條核酸序列被注解為編碼具有HPro結(jié)構(gòu)域的推測蛋白質(zhì)。已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中描述了若干HPro蛋白質(zhì)及其一級序列，特別是細菌，如假單胞菌屬(Pseudomonas) (Riietschi等,Eur.J.Biochem.,205，459-466，1992，W096/38567)、植物，如擬南芥(W096/38567, Genebank AF047834)、胡蘿卜(W096/38567, Genebank87257)、燕麥(Avena sativa)(W002/046387)、小麥(W002/046387)、寬葉臂形草(Brachiaria platyphylla) (W002/046387)、蔡藜草(Cenchrusechinatus) (W002/046387)、硬直黑麥草(Lolium rigidum) (W002/046387)、葦葉羊茅(Festuca arundinacea) (W002/046387)、狗尾草(Setaria faberi) (W002/046387)、牛筋草(Eleusineindica) (W002/046387)、高梁(W002/046387)、球抱子菌屬(Coccicoides)(Genebank COITRP)、日本 黃連(Coptis japonica)(TO06/132270)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) (ES2275365)或哺乳動物，如小鼠或豬的 HPPD。
[0023]對HPro的抑制導(dǎo)致光合作用的解偶聯(lián)，缺乏輔助捕光色素(accessorylight-harvesting pigments),以及最重要地，由于缺少正常情況下由類胡蘿卜素提供的光保護導(dǎo)致的UV照射和活性氧類別對葉綠體的破壞(褪色)(Norris等(1995)，PlantCell7:2139-2149)。光合活躍的組織的褪色導(dǎo)致生長抑制和植物死亡。
[0024]已經(jīng)證明抑制HPro并且特異性結(jié)合酶以抑制HPP轉(zhuǎn)化成尿黑酸的一些分子是非常有效的選擇性除草劑。目前，大多數(shù)市售HPro抑制劑型除草劑屬于這三個化學(xué)家族之
[0025]I)三酮類，例如橫草酮(sulcotrione)、甲基橫草酮(mesotrione);環(huán)橫酮(tembotrione) ；tefuryltrione ；bicyclopyrone ;雙環(huán)石黃草酮(benzobicyclon)
[0026]2)異嗔唑類，例如異氟草(isoxaflutole)，或?qū)?yīng)的二酮腈類化合物。在植
物中，異唑類，如異嗔氟草被快速轉(zhuǎn)化成二酮腈類化合物，其顯示HPPD抑制劑性質(zhì)；和
[0027]3)pyrazolinones,例如，苯吡唑 草酮(topramezone)、橫酸草吡唑(pyrasulfotole)和節(jié)草唑(pyrazoxyfen)。[0028]這些抑制HPro的除草劑可在展現(xiàn)出代謝耐受性的作物植物，如玉米(Zeamays)(它們在其中被迅速降解)中使用以抵抗草(grass)和/或闊葉雜草(Schulz等，1993;Mitchell 等，2001;Garcia 等，2000;Pallett 等，2001)。為拓展這些抑制 HPPD的除草劑的范圍，已經(jīng)進行了若干努力，以賦予植物，特別是沒有代謝耐受性或代謝耐受性較差的植物在農(nóng)藝學(xué)田間條件下可接受的耐受性水平。
[0029]在該上下文中，已經(jīng)首次證明轉(zhuǎn)化的敏感植物中僅天然HPro酶的過表達就為轉(zhuǎn)化的植物提供對HPro抑制劑的有效耐受性(W096/38567)。
[0030]另一種策略是突變HPro，以獲得下述靶酶，其保留其催化HPP轉(zhuǎn)化為尿黑酸的性質(zhì)，同時對HPro抑制劑不如突變前的天然HPro敏感。
[0031]該策略已經(jīng)通過利用編碼在其C末端部分的一個或多個位置上突變的HPro酶的基因轉(zhuǎn)化植物而成功應(yīng)用于產(chǎn)生對HPro抑制劑耐受的植物(W099/24585)。在可以賦予對HPro抑制劑耐受性的HPro酶的c末端部分的有用突變中，顯示某些突變提供對某些二酮腈類除草劑的增加的耐受性，例如突變Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Ile和Gly336Trp (突變氨基酸的位置參照假單胞菌屬HPH)而被指出)。
[0032]更近來，在專利申請W02009/144079中已經(jīng)顯示，HPPD的位置336處的某些特定氨基酸取代在體外提供對某些HPro抑制劑型除草劑的耐受性。
[0033]US2010/0197503還指出了來自燕麥的HPTO活性位點內(nèi)或附近的不同位置上的許多突變，并檢查了某些HPro抑制劑，如磺草酮對一些這些突變的HPro酶的抑制。
[0034]盡管開發(fā)針對上文所述的一些HPro抑制劑型除草劑顯示出耐受性的植物獲得了這些成功，但仍期望開發(fā)和/或改良特定植物，如棉花對較多的、較新的或?qū)θ舾刹煌腍Pro抑制劑的耐受性，特別是對屬于三酮類(例如磺草酮、甲基磺草酮、環(huán)磺酮、莊無忌、bicyclopyrone和雙環(huán)磺草酮)、pyrazolinones (例如，苯批唑草酮、磺酰草批唑和pyrazoxifen)和異唑類(例如異氟草)或?qū)?yīng)的二酮腈類化合物的類別的HPF1D抑制劑的耐受性。如本文在不同實施方案、實施例和權(quán)利要求中描述后解決了該問題。
[0035]如下文所述在本發(fā)明不同的詳細實施方案以及權(quán)利要求中解決了這些及其他問題。
[0036]發(fā)明概述
[0037]在一個實施方案中，本發(fā)明涉及在預(yù)定位點修飾植物細胞的基因組的方法，其包括以下步驟:
[0038]在所述預(yù)定位點附近或在所述預(yù)定位點上誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂，所述雙鏈斷裂由向所述細胞中引入識別所述預(yù)定位點附近或所述預(yù)定位點上的識別序列的雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)(DSBI)酶來誘導(dǎo)；
[0039]選擇植物細胞,其中已經(jīng)修復(fù)了所述雙鏈DNA斷裂,導(dǎo)致在所述預(yù)選位點處對基因組的修飾，其中所述修飾選自
[0040]1.至少一個核苷酸的替換；
[0041]i1.至少一個核苷酸的缺失；
[0042]ii1.至少一個核苷酸的插入；或
[0043]iv.1.-1i1.的任何組合；
[0044] 其特征在于所述預(yù)定位點和/或識別位點緊靠原種事件。[0045]在特定實施方案中，事件是GHB119。
[0046]在另一個實施方案中，識別序列包含在SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4中。
[0047]所述識別序列可以包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。
[0048]本發(fā)明還提供在預(yù)定位點修飾植物細胞的基因組的方法，其包括以下步驟:
[0049]在所述預(yù)定位點附近或在所述預(yù)定位點上誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂，所述雙鏈斷裂由向所述細胞中引入識別所述預(yù)定位點附近或所述預(yù)定位點上的識別序列的雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)(DSBI)酶來誘導(dǎo)；
[0050]選擇植物細胞,其中已經(jīng)修復(fù)了所述雙鏈DNA斷裂,導(dǎo)致在所述預(yù)選位點處對基因組的修飾，其中所述修飾選自
[0051]至少一個核苷酸的替換；
[0052]至少一個核苷酸的缺失；
[0053]至少一個核苷酸的插入；或
[0054]1.-1i1.的任何組合；
[0055]其特征在于所述識別位點包含SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2的核苷酸序列。
[0056]可以通過向所述細胞中遞送包含編碼(一起)所述內(nèi)切核酸酶的一個或多個嵌合基因的核酸分子來向所述細胞中引入DSBI酶。所述DSBI酶可以是單鏈大范圍核酸酶或一對大范圍核酸酶，其識別或一致識別所述預(yù)定位點并誘導(dǎo)所述雙鏈斷裂。
[0057]在特定實施方案中，所述大范圍核酸酶或大范圍核酸酶對來自1-Crel，并且其中以下氨基酸存在于大范圍核酸酶單元I中:
[0058]a.位置32處的S ;
[0059]b.位置33處的Y ;
[0060]c.位置38處的Q ;
[0061]d.位置80處的Q ;
[0062]e.位置40處的S ;
[0063]f.位置42處的T ;
[0064]g.位置77處的R ;
[0065]h.位置68處的Y ;
[0066]1.位置70處的Q ;
[0067]j.位置75處的H ;
[0068]k.位置44處的T ;
[0069]1.位置24處的I ;
[0070]m.位置26處的Q ;
[0071]η.位置28處的K;
[0072]ο.位置30處的N。
[0073]并且其中以下氨基酸存在于大范圍核酸酶單元2中:
[0074]p.位置70處的S ;
[0075]q.位置44處的Q ;
[0076]r.位置24處的K ; [0077]s.位置26處的A ;[0078]t.位置28處的K ;
[0079]u.位置30處的N ;
[0080]V.位置32處的S ;
[0081]w.位置33處的Y;
[0082]X.位置38處的Q ;
[0083]y.位置80處的Q ;
[0084]Z.位置40處的S ；
[0085]aa.位置 42 處的 T ;
[0086]bb.位置 77 處的 Q ;
[0087]CC.位置 68 處的 Y。
[0088]所述大范圍核酸酶或大范圍核酸酶對可以包含SEQ ID N0.6從氨基酸位置11-165和位置204-360的氨基酸序列。
[0089]所述大范圍核酸酶或大范圍核酸酶對還可以由包含或一起包含SEQ ID N05的從核苷酸位置3120-3584和位置3698-4169的核苷酸序列的一條或多條核苷酸序列編碼。
[0090]在一個實施方案中，在步驟b之前，向所述細胞中遞送修復(fù)DNA分子，所述修復(fù)DNA分子用作修復(fù)所述雙鏈DNA斷裂的模板。
[0091]所述修復(fù)DNA可以包含至少一個側(cè)翼區(qū)，其包含與所述預(yù)定位點上游或下游DNA區(qū)具有充分同源性的核苷酸序列，以允許與所述上游或下游DNA區(qū)重組?；蛘?，所述修復(fù)DNA可以包含位于所述修復(fù)DNA相反端的兩個側(cè)翼區(qū)，所述側(cè)翼區(qū)之一包含與所述預(yù)定位點的上游DNA區(qū)具有充分同源性的核苷酸序列，另一個側(cè)翼區(qū)包含與所述預(yù)定位點的下游序列具有充分同源性的核苷酸序列，以允許所述側(cè)翼核苷酸序列與所述上游和下游DNA區(qū)進行重組。
[0092]在其他實施方案中，所述修復(fù)DNA包含可選擇標(biāo)志物基因和/或植物可表達的目的基因。所述植物可表達的目的基因可以選自除草劑耐受基因、昆蟲抗性基因、疾病抗性基因、非生物脅迫抗性基因、參與油類生物合成、碳水化合物生物合成的酶、參與纖維素強度或纖維素長度的酶、參與次生代謝物生物合成的酶。
[0093]在仍另一實施方案中，將在預(yù)定位置上基因組被修飾的植物細胞進一步再生成植物，其在所述預(yù)定位置上也含有所述修飾。然后所述植物可以與另一植物進行雜交，產(chǎn)生也含有基因組修飾的后代。
[0094]本發(fā)明還涉及通過上文所述的方法獲得的在基因組的預(yù)定位點上包含修飾的植物細胞。本發(fā)明還包括:植物、植物部分、種子或其繁殖材料，在基因組的預(yù)定位點上包含修飾，通過本發(fā)明的方法獲得或基本上由本發(fā)明的植物細胞組成。
[0095]還提供培養(yǎng)本發(fā)明的植物，即在基因組的預(yù)定位點上包含修飾的植物的方法，其包括向所述植物或其中生長所述植物的基質(zhì)應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)的步驟，以及包括用于產(chǎn)生在基因組的預(yù)定位點上包含修飾的植物的方法，其包括使基本上由本發(fā)明的植物細胞組成的植物或本發(fā)明的植物(包含預(yù)期基因組修飾的植物細胞和植物)與另一植物或其本身雜交并任選地收獲種子的方法。
[0096]在一個實施方案中，本發(fā)明還提供包含嵌合基因的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子，所述嵌合基因包含[0097](a)編碼具有ΗΡΗ)活性的蛋白質(zhì)的核酸序列，其中所述蛋白質(zhì)在對應(yīng)于SEQ IDNO: 19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白質(zhì)向所述植物提供對至少IX田間劑量的至少一種HPH)抑制劑的耐受性，所述核酸序列有效連接
[0098](b)植物可表達的啟動子和任選地
[0099](C)翻譯終止和多腺苷酸化區(qū)。
[0100]具有HPH)活性的蛋白質(zhì)可以與SEQ ID NO: 21的氨基酸序列具有至少95%的序列同一性?？梢詢?yōu)化編碼具有HPro活性的蛋白質(zhì)的核酸序列用于在棉花中表達。所述蛋白質(zhì)可以包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或可以由包含SEQ ID NO:21的從nt949_nt2025的核苷酸序列的核酸編碼。
[0101]所述棉花植物細胞、植物部分、植物或種子具有對至少1.5X田間劑量的所述至少一種HPro抑制劑，或至少2X田間劑量的所述至少一種HPro抑制劑，或至少4X田間劑量的所述至少一種HPro抑制劑的耐受性。
[0102]所述至少一種HPro抑制劑可以選自甲基磺草酮、異氟草、苯吡唑草酮、pyrasulfutole 和環(huán)橫酮。
[0103]本發(fā)明的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子可以對至少兩種HPro抑制劑，優(yōu)選至少三種HPro抑制劑，更優(yōu)選至少四種HPro抑制劑，如至少5種或至少6種HPro抑制劑耐受。
[0104]本發(fā)明的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子的嵌合基因可以包含SEQ IDNO: 20從位置88-位置2714的核酸序列。
[0105]本發(fā)明的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子還可以包含至少一個其他嵌合基因，其包含編碼這樣的酶的核酸序列，所`述酶向植物提供對非HPro抑制劑的除草劑的耐受性或提供對至少一種昆蟲或真菌種的耐受性。
[0106]在另一實施方案中，本發(fā)明提供用于獲得對至少IX田間劑量的至少一種HPro抑制劑耐受的棉花植物或植物細胞的方法，其包括
[0107]-引入嵌合基因，其包含:
[0108](a)編碼具有HPro活性的蛋白質(zhì)的核酸序列，其中所述蛋白質(zhì)在對應(yīng)于SEQ IDNO: 19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白質(zhì)向所述植物提供對至少IX田間劑量的至少一種HPH)抑制劑的耐受性，所述核酸序列有效連接
[0109](b)植物可表達的啟動子和任選地
[0110](C)翻譯終止和多腺苷酸化區(qū)。
[0111]還提供用于控制棉花植物附近或植物田地中雜草的方法，其包括
[0112]-向棉花植物附近或棉花植物田地應(yīng)用至少IX田間劑量的至少一種HPro抑制劑。
[0113]在本發(fā)明的方法中，所述至少一種HPro抑制劑可以選自甲基磺草酮、異氟草、苯批唑草酮、pyrasulfutole和環(huán)磺酮。以至少1.5X、至少2X或至少4X的田間劑量應(yīng)用所述至少一種HPH)抑制劑。
[0114]在本發(fā)明方法的特定實施方案中，所述至少一種HPro抑制劑是異
[0115]氟草和甲基磺草酮，其中所述異氟草在出苗前應(yīng)用，而所述甲基磺草酮在出苗后應(yīng)用。
[0116]附圖簡述[0117]圖1:識別位點以及與不同的大范圍核酸酶單體單元C0T5和C0T6的氨基酸的相互作用的圖示。
[0118]圖2:單鏈C0T-5/6大范圍核酸酶的氨基酸序列，其包含SV40核定位信號(氨基酸1-10)、C0T-5亞基(氨基酸11-165)、接頭序列(氨基酸166-203)和C0T-6亞基(氨基酸 204-360)。
[0119]圖3:通過至少一側(cè)同源重組靶向插入的圖表概述。剪刀表示DSBI酶(C0T-5/6)的識別位點，方箭頭(block arrow)代表啟動子，小的矩形代表終止子，而大的矩形代表基因，小箭頭代表PCR引物，雙頭箭代表DNA印跡片段，垂直方箭頭代表限制酶切位點，虛線代表側(cè)翼DNA序列，其中同源區(qū)由連譜號表示。修復(fù)DNA載體pCV211包含2mEPSPS基因和HPro-336W，其側(cè)翼為與GHB119原種事件3’側(cè)翼序列中的C0T-5/6識別位點周圍區(qū)域具有同源性的側(cè)翼區(qū)。C0T-5/6誘導(dǎo)的雙鏈DNA斷裂后，pCV211載體的1561bp和2072bp側(cè)翼區(qū)與GHB119的3’側(cè)翼序列的對應(yīng)區(qū)域之間同源重組，PCV211載體的2mEPSPS基因和HPPD-336W基因被插入到靶位點上。可以使用引物對IB617xIB572和IB616xIB572通過PCR并利用針對EPSPS、HPH)或Cry2Ae的探針在Dralll/StuI消化的基因組DNA上通過DNA印跡鑒定Ilkb基因組帶來鑒定正確疊加的事件。
[0120]本發(fā)明不同實施方案的描述
[0121]本發(fā)明基于這樣的觀察，即可以獲得在功能上重新設(shè)計的大范圍核酸酶，其特異性識別并切割核苷酸序列(SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2 -圖1)，所述核苷酸序列緊靠現(xiàn)有事件存在，即棉花事件GHB119(描述于2008/151780，保藏號ATCC PTA-8398)，其包含Cry2AE基因和bar基因(分別賦予鱗翅目抗性和草銨膦(glufosinate)耐受性)。使用該特異的大范圍核酸酶，可以將包含EPSPS基因和HPH)基因(分別賦予對草甘膦(glyphosate)和HPH)抑制型除草劑的耐受性)的額外DNA片段插入到現(xiàn)有GHBl 19事件的少數(shù)kb內(nèi)，由此產(chǎn)生應(yīng)該作為單個遺傳單位遺傳的四倍基因疊加。
[0122]因此產(chǎn)生了棉花植物，其包含編碼具有HPro活性的蛋白質(zhì)的嵌合DNA分子，其中對應(yīng)于突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescer^HPH)蛋白質(zhì)位置336的位置上的甘氨酸(Gly或G)的保守氨基酸已經(jīng)被色氨酸(Trp或W)所替換。
[0123]此外驚奇地發(fā)現(xiàn)，植物，特別是棉花植物顯示對至少IX田間劑量的若干HPro抑制劑型除草劑，如甲基磺草酮、異氟草、環(huán)磺酮、pyrasulfutole和苯吡唑草酮或如本文列出的任何其他可應(yīng)用HPH)抑制劑的耐受性，所述植物包含導(dǎo)致這樣的蛋白質(zhì)表達的嵌合基因，所述蛋白質(zhì)具有HPro活性，在對應(yīng)于熒光假單胞菌的蛋白質(zhì)氨基酸序列的位置336的位置上的保守天然氨基酸殘基Gly突變?yōu)門rp，無論是四倍疊加(即靶定的)或是通過隨機轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的。令人驚奇的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，表達具有HPH)活性，在對應(yīng)于熒光假單胞菌的蛋白質(zhì)氨基酸序列的位置336的位置上的保守天然氨基酸殘基Gly突變?yōu)門rp的蛋白質(zhì)的植物，特別是棉花植物顯示對至少IX田間劑量的若干HPH)抑制劑的耐受性。
[0124]能夠緊靠現(xiàn)有原種事件引入基因組修飾具有若干優(yōu)勢。首先，修飾將與較早事件共分離，由此避免組合單一事件賦予的某些性狀通常需要的復(fù)雜育種方案。其次，修飾將在有利的基因組環(huán)境中發(fā)生，用于表達起因于修飾的想要的性狀，因為也假定現(xiàn)有的原種事件由于其特定基因組定位而顯示正確的 、適當(dāng)?shù)暮头€(wěn)定的空間和時間表型表達，如下文詳細說明。[0125]因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及在預(yù)定位點修飾植物細胞的基因組的方法，其包括以下步驟:
[0126]在所述預(yù)定位點附近或在所述預(yù)定位點上誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂，所述雙鏈斷裂由向所述細胞中引入識別所述預(yù)定位點附近或所述預(yù)定位點上的識別序列的雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)(DSBI)酶來誘導(dǎo)；
[0127]選擇植物細胞，其中已經(jīng)修復(fù)了所述雙鏈DNA斷裂，導(dǎo)致在所述預(yù)選位點處對基因組的修飾，其中所述修飾選自
[0128]1.至少一個核苷酸的替換；
[0129]i1.至少一個核苷酸的缺失；
[0130]ii1.至少一個核苷酸的插入；或
[0131]iv.1.-1i1.的任何組合；
[0132]其特征在于所述預(yù)定位點和/或所述識別序列緊靠現(xiàn)有的原種事件。
[0133]如本文所用，“雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)的稀有切割內(nèi)切核酸酶”是能夠在特定核苷酸序列(其稱為“識別位點”)上誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂的酶。稀有切割內(nèi)切核酸酶在如下意義上是稀有切割的，即由于其長的識別序列(通常約14-40nt)，它們甚至在更大的植物基因組中具有非常低的切割頻率，例如，每個基因組它們僅切割10次、僅5次、僅4次、僅3次、僅2次、或僅I次。歸巢內(nèi)切核酸酶由此類稀有切割內(nèi)切核酸酶的家族組成，有時候也稱為大范圍核酸酶。它們由內(nèi)含子編碼，不依賴于基因或間插序列，并且呈現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，將其區(qū)別于一般來自細菌限制性修飾的類型II系統(tǒng)的更經(jīng)典的限制酶。它們的識別位點具有一般的不對稱性，其與大多數(shù)限制酶識別位點的特征性二重對稱性不同。已經(jīng)顯示由內(nèi)含子編碼的若干歸巢內(nèi)切核酸酶或內(nèi)含肽促進其各自遺傳元件歸巢到等位的無內(nèi)含子或無內(nèi)含肽位點中。通過在無內(nèi)含子或無內(nèi)含肽等位基因中產(chǎn)生位點特異性的雙鏈斷裂，這些核酸酶產(chǎn)生重組基因端，其參與基因轉(zhuǎn)換過程，該過程復(fù)制編碼序列并導(dǎo)致DNA水平上插入內(nèi)含子或間插序列。
[0134]—種良好表征的標(biāo)記的尋祀內(nèi)切核酸酶是1-Scel。1-SceI是一種位點特異性內(nèi)切核酸酶，是造成釀酒酵母中位于線粒體中內(nèi)含子移動的原因。該酶是由21S rRNA基因可任選的內(nèi)含子Sc LSU.1編碼的并且在產(chǎn)生具有3’ OH突出端的4bp交錯切口的內(nèi)含子插入位點引發(fā)雙鏈DNA斷裂。1-SceI內(nèi)切核酸酶的識別位點擴大到18bp的非對稱序列(Colleaux (科萊阿克斯)等人1988Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(《美國國家科學(xué)院院刊》85:6022-6026)。1-SceI的氨基酸序列以及線粒體1-SceI基因的通用密碼等效物已經(jīng)由例如TO96/14408提供。W096/14408進一步披露了多個1-SceI蛋白突變體，這些突變體仍然是功能性的。
[0135]PCT申請PCT/EP04/013122(并入本文作為參考)提供1-SceI的合成的核苷酸序列變體，其已經(jīng)被優(yōu)化用于在植物中表達。
[0136]其他稀有切割DSB誘導(dǎo)酶及其各自識別位點的列表提供在W003/004659的表1中(第17-20頁)(并入本文作為參考)。這些包括1-Sce 1、1-Chu 1、1-Dmo 1、1-Cre 1、1-Csm 1、P1-Fli 1、Pt-Mtu 1、1-Ceu 1、Ι-SceI1、1-Sce II1、HO、P1-Civ 1、P1-Ctr 1、P1-Aae I,P1-BSU 1、P1-Dha1、P1-Dra 1、P1-Mav 1、P1-Mch 1、P1-Mfu 1、P1-Mfl 1、P1-Mga
1、P1-Mgo1、P1-Min 1、P1-Mka 1、P1-Mle 1、P1-Mma 1、P1-Msh 1、P1-Msm 1、P1-Mth 1、P1-Mtu I,P1-Mxe I,P1-Npu I,P1-Pfu I,P1-Rma 1、PI_Spb1、PI_Ssp I,P1-Fac I,P1-Mja1、P1-Pho 1、P1-Tag 1、P1-Thy 1、P1-Tko I 或 P1-Tsp I。
[0137]此外，用于設(shè)計識別基本上任何所選靶核苷酸序列的定制稀有切割內(nèi)切核酸酶的方法是可用的。簡言之，可以使用設(shè)計用于識別特異性核苷酸序列的鋅指結(jié)構(gòu)域和來自天然限制酶，如FokI的非特異性DNA切割結(jié)構(gòu)域之間的雜合體來制備嵌合的限制酶。這些酶一般被稱為鋅指內(nèi)切核酸酶(ZFEs)。此類方法已經(jīng)描述于例如W003/080809、W094/18313 或 W095/09233 和 Isalan 等，2001，Nature Biotechnologyl9, 656-660;Liu 等1997，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94, 5525-5530)中。通過從變體文庫中進行選擇來產(chǎn)生定制的大范圍核酸酶的另一方式描述于W02004/067736中。還可以通過如W02007/047859中描述的合理設(shè)計獲得具有改變的序列特異性和DNA結(jié)合親和力的定制大范圍核酸酶。定制設(shè)計的稀有切割內(nèi)切核酸酶的另一實例包括所謂的TALE核酸酶，其基于來自細菌屬黃單胞菌屬(Xanthomonas)的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子(TALEs)，其與例如FOKI的催化結(jié)構(gòu)域融合。這些TALEs的DNA結(jié)合特異性定義為串聯(lián)排列的34/35氨基酸重復(fù)單元的重復(fù)可變雙殘基(RVDs)，其可以被修飾，以識別特異的靶序列(Christian等，2010，Geneticsl86:757 - 761、W011/072246、W010/079430 和 W011/146121。此類定制設(shè)計的內(nèi)切核酸酶還被稱為非天然存在的內(nèi)切核酸酶。
[0138]因為重新設(shè)計的大范圍核酸酶來自天然存在的內(nèi)切核酸酶，因此可用的潛在識別位點不是完全隨機的，而是看起來與作為重新設(shè)計的大范圍核酸酶基礎(chǔ)的天然存在的內(nèi)切核酸酶最初識別的核苷酸序列具有一定程度的相似性。Gao等(2010，The Plant Journal,第1-11頁)還說明了，修飾1-CreI的DNA結(jié)合特征的基于結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)設(shè)計方法是基于對1-Cre1-DNA共晶體結(jié)構(gòu)的視覺觀察，其導(dǎo)致對大量氨基酸取代的預(yù)測，所述氨基酸取代改變其識別位點的特定位置上的1-CreI堿基偏好性。通過實驗評價單個氨基酸取代，并且向可以“混合和匹配”的突變數(shù)據(jù)庫中添加賦予堿基偏好想要的改變的那些氨基酸取代，以產(chǎn)生識別高度不同的DNA位點的1-CreI的衍生物。理論上，使用目前突變數(shù)據(jù)庫可以獲得的組合多樣性足以在隨機DNA序列中大約每1000bp靶向改造的內(nèi)切核酸酶。
[0139]如本文所用，“事件”定義為(人造)遺傳基因座，由于遺傳改造，其在特定基因組位置上攜帶包含至少一個拷貝的目的基因或多個目的基因的外源DNA或轉(zhuǎn)基因。事件的典型等位狀態(tài)是存在或缺失外源DNA。`事件的表型特征在于轉(zhuǎn)基因的表達。在遺傳水平上，事件是植物遺傳組成的一部分。在分子水平上，事件的特征在于轉(zhuǎn)基因的限制性圖譜(例如通過Southern印跡確定)、轉(zhuǎn)基因的上游和/或下游側(cè)翼序列(反映了基因組位置)、分子標(biāo)志物的位置和/或轉(zhuǎn)基因的分子構(gòu)型。一般地，利用包含至少一個目的基因的轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化植物導(dǎo)致包含多個單獨事件(其每一個是獨特的)的轉(zhuǎn)化體群體。事件的特征在于外源DNA和至少一個側(cè)翼序列。
[0140]如本文所用，原種事件為基于轉(zhuǎn)基因的表達和穩(wěn)定性及其賦予的性狀，以及其與包含它的植物的最佳農(nóng)藝學(xué)特性的相容性從一組事件選擇的事件，其通過用同一轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化而獲得。因此原種事件選擇的標(biāo)準(zhǔn)為一種或多種，優(yōu)選兩種或多種，有利地為所有下列的標(biāo)準(zhǔn):
[0141]a)外源DNA的存在不損害植物的其他所期望的特性，如與農(nóng)藝學(xué)性能或商業(yè)價值相關(guān)的那些特性(例如不引起對疾病的增加的易感性，不引起產(chǎn)量下降，或不引起增加的倒伏等)；
[0142]b)事件的特征在于充分定義的穩(wěn)定遺傳的分子構(gòu)型，且為其可開發(fā)用于鑒定對照的適當(dāng)工具；
[0143]c)在事件的雜合(或半合子)和純合狀態(tài)下，目的基因在一系列的環(huán)境條件下以商業(yè)可接受水平顯示正確、適當(dāng)且穩(wěn)定的空間和時間表型表達，在所述環(huán)境條件中攜帶所述事件的植物可能處于正常的農(nóng)藝學(xué)用途。
[0144]還優(yōu)選外源DNA與植物基因組的位置有關(guān)，其中所述位置允許易于漸滲想要的商業(yè)遺傳背景。
[0145]事件作為原種事件的狀態(tài)通過將原種事件漸滲不同的相關(guān)遺傳背景并且觀察對例如上述a)、b)和c)中的一個、兩個或所有標(biāo)準(zhǔn)的符合而證實。
[0146]因此“原種事件”指包含外源DNA的遺傳基因座，其滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。植物、植物材料或后代如種子可在其基因組中包含一個或多個原種事件。
[0147]—旦已對外源DNA的一個或兩個側(cè)翼序列進行了測序，可用分子生物學(xué)技術(shù)開發(fā)特異性識別樣品核酸(DNA或RNA)中這種(這些)序列的引物和探針。例如可開發(fā)PCR方法來鑒定生物樣品(如植物、植物材料或包含植物材料的產(chǎn)品的樣品)中的原種事件。此類PCR基于至少兩條特異“引物”，一條識別原種事件5’或3’側(cè)翼序列中的序列，而另一條識別位于外源DNA中的序列。所述引物優(yōu)選具有15-35個核苷酸的序列，其在優(yōu)化的PCR條件下分別“特異性識別”原種事件5’或3’側(cè)翼序列中的序列和原種事件的外源DNA中的序列，以便從包含原種事件的核酸樣 品中擴增出特異片段(“整合片段”或區(qū)別性擴增子)。這意味著在優(yōu)化的PCR條件下植物基因組或外源DNA中只有靶向整合片段而沒有其他序列被擴增。
[0148]可根據(jù)本發(fā)明方法使用的含有原種轉(zhuǎn)化事件或轉(zhuǎn)化事件組合的轉(zhuǎn)基因植物包括例如在多個國家或地區(qū)調(diào)控管理機構(gòu)的數(shù)據(jù)庫中列出的那些，并包括事件1143-14A(棉花，昆蟲控制，未保藏，描述于W02006/128569);事件1143_51B(棉花，昆蟲控制，未保藏，描述于W02006/128570);事件1445 (棉花，除草劑耐受性，未保藏，描述于 US2002120964 或 W02002/034946);事件 17053(稻，除草劑耐受性，保藏為 PTA-9843,描述于W02010/117737);事件17314 (稻，除草劑耐受性，保藏為PTA-9844，描述于W02010/117735);事件281-24-236 (棉花，昆蟲控制-除草劑耐受性，保藏為PTA-6233，描述于W02005/103266或US2005216969);事件3006-210-23 (棉花，昆蟲控制-除草劑耐受性，保藏為PTA-6233，描述于US2007143876或W02005/103266);事件3272 (玉米，質(zhì)量性狀，保藏為 PTA-9972,描述于 W02006098952 或 US2006230473);事件 40416(玉米，昆蟲控制-除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-11508,描述于W02011/075593);事件43A47 (玉米，昆蟲控制-除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-11509,描述于W02011/075595);事件5307(玉米，昆蟲控制，保藏為ATCC PTA-9561,描述于W02010/077816);事件ASR-368 (糠穗草，除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-4816,描述于US2006162007或W02004053062);事件B16 (玉米，除草劑耐受性，未保藏，描述于US2003126634);事件BPS-CV127-9 (大豆，除草劑耐受性，保藏為NCMB N0.41603,描述于W02010/080829);事件CE43-67B (棉花，昆蟲控制，保藏為 DSM ACC2724,描述于 US2009217423 或 W02006/128573);事件 CE44-69D (棉花，昆蟲控制，未保藏，描述于US20100024077);事件CE44-69D (棉花，昆蟲控制，未保藏，描述于W02006/128571);事件CE46-02A (棉花，昆蟲控制，未保藏，描述于W02006/128572);事件C0T102(棉花，昆蟲控制，未保藏，描述于US2006130175或W02004039986);事件C0T202 (棉花，昆蟲控制，未保藏，描述于US2007067868或W02005054479);事件C0T203 (棉花，昆蟲控制，未保藏，描述于W02005/054480);事件DAS40278 (玉米，除草劑耐受性，保藏為 ATCC PTA-10244,描述于 W02011/022469);事件 DAS-59122-7 (玉米，昆蟲控制-除草劑耐受性，保藏為ATCC PTAl 1384,描述于US2006070139);事件DAS-59132 (玉米，昆蟲控制-除草劑耐受性，未保藏，描述于W02009/100188);事件DAS68416 (大豆，除草劑耐受性，保藏為 ATCC PTA-10442,描述于 W02011/066384 或 W02011/066360);事件DP-098140-6(玉米，除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-8296,描述于US2009137395或W02008/112019);事件DP-305423-1 (大豆，質(zhì)量性狀，未保藏，描述于US2008312082或W02008/054747);事件DP-32138-1 (玉米，雜交系統(tǒng)，保藏為ATCC PTA-9158，描述于US20090210970 或 W02009/103049);事件 DP-356043-5 (大豆，除草劑耐受性，保藏為 ATCCPTA-8287,描述于 US20100184079 或 W02008/002872);事件 EE-1 (茄子，昆蟲控制，未保藏，描述于W02007/091277);事件FI117 (玉米，除草劑耐受性，保藏為ATCC209031，描述于US2006059581 或 W01998/044140);事件 GA21 (玉米，除草劑耐受性，保藏為 ATCC209033,描述于US2005086719或W01998/044140);事件GG25 (玉米，除草劑耐受性，保藏為ATCC209032,描述于 US2005188434 或 W01998/044140);事件 GHBl 19 (棉花，昆蟲控制-除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-8398,描述于W02008/151780);事件GHB614 (棉花，除草劑耐受性，保藏為 ATCC PTA-6878,描述于 US2010050282 或 W02007/017186);事件 GJll (玉米，除草劑耐受性，保藏為ATCC209030，描述于US2005188434或W01998/044140);事件GMRZ13(甜菜，病毒抗性，保藏為NCMB-41601，描述于W02010/076212);事件H7_l(甜菜，除草劑耐受性，保藏為 NCMB41158 或 NCMB41159，描述于 US2004172669 或 W02004/074492);事件JOPLIN1 (小麥，疾病耐受性，未保藏，描述于US2008064032);事件LL27 (大豆，除草劑耐受性，保藏為 NCIMB41658,描述于 W02006/108674 或 US2008320616);事件 LL55 (大豆，除草劑耐受性，保藏為NCIMB41660,描述于W02006/108675或US2008196127);事件LLcotton25(棉花，除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-3343,描述于W02003013224或US2003097687);事件LLRICE06 (稻，除草劑耐受性，保藏為ATCC-23352,描述于US6468747或W02000/026345);事件LLRICE601 (稻，除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-2600,描述于US20082289060或W02000/026356);事件LY038 (玉米，質(zhì)量性狀，保藏為ATCCPTA-5623,描述于 US2007028322 或 W02005061720);事件 MIR162 (玉米，昆蟲控制，保藏為 PTA-8166,描述于 US2009300784 或 W02007/142840);事件 MIR604(玉米，昆蟲控制，未保藏，描述于US2008167456或W02005103301);事件MON15985 (棉花，昆蟲控制，保藏為 ATCC PTA-2516,描述于 US2004-250317 或 W02002/100163);事件 M0N810(玉米，昆蟲控制，未保藏，描述于US2002102582);事件MON863(玉米，昆蟲控制，保藏為ATCCPTA-2605,描述于 W02004/011601 或 US2006095986);事件 MON87427 (玉米，授粉控制，保藏為ATCC PTA-7899,描述于W02011/062904);事件M0N87460 (玉米，脅迫耐受性，保藏為 ATCCPTA-8910 ,描述于 W02009/111263 或 US20110138504);事件 M0N87701 (大豆，昆蟲控制，保藏為ATCC PTA-8194,描述于US2009130071或W02009/064652);事件M0N87705 (大豆，質(zhì)量性狀-除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-9241,描述于US20100080887或TO2010/037016);事件M0N87708 (大豆，除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA9670,描述于W02011/034704);事件MON87754(大豆，質(zhì)量性狀，保藏為ATCCPTA-9385，描述于TO2010/024976);事件MON87769(大豆，質(zhì)量性狀，保藏為ATCC PTA-8911,描述于US20110067141或W02009/102873);事件M0N88017 (玉米，昆蟲控制-除草劑耐受性，保藏為 ATCC PTA-5582,描述于 US2008028482 或 W02005/059103);事件 MON88913 (棉花，除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-4854,描述于W02004/072235或US2006059590);事件M0N89034 (玉米，昆蟲控制，保藏為ATCC PTA-7455,描述于W02007/140256或US2008260932);事件MON89788 (大豆，除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-6708,描述于US2006282915或W02006/130436);事件MSll (油菜，授粉控制-除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-850或PTA-2485,描述于W02001/031042);事件MS8 (油菜，授粉控制_除草劑耐受性，保藏為 ATCC PTA-730,描述于 W02001/041558 或 US2003188347);事件 NK603 (玉米，除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-2478,描述于US2007-292854);事件PE-7 (稻，昆蟲控制，未保藏，描述于W02008/114282);事件RF3 (油菜，授粉控制-除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-730,描述于 W02001/041558 或 US2003188347);事件 RT73 (油菜，除草劑耐受性，未保藏，描述于W02002/036831或US2008070260);事件T227-1 (甜菜，除草劑耐受性，未保藏，描述于W02002/44407或US2009265817);事件T25 (玉米，除草劑耐受性，未保藏，描述于US2001029014或W02001/051654);事件T304-40 (棉花，昆蟲控制-除草劑耐受性，保藏為 ATCC PTA-8171,描述于 US2010077501 或 W02008/122406);事件 T342-142 (棉花，昆蟲控制，未保藏，描述于W02006/128568);事件TC1507 (玉米，昆蟲控制-除草劑耐受性，未保藏，描述于US2005039226或W02004/099447);事件VIP1034 (玉米，昆蟲控制-除草劑耐受性，保藏為ATCC PTA-3925.，描述于W02003/052073)，事件32316 (玉米，昆蟲控制-除草劑耐受性，保藏為PTA-11507，描述于W02011/084632)和事件4114(玉米，昆蟲控制-除草劑耐受性，保藏為PTA -11506，描述于W02011/084621)。
[0149]
【權(quán)利要求】
1.用于在預(yù)定位點修飾植物細胞的基因組的方法，其包括以下步驟: a.在所述預(yù)定位點附近或在所述預(yù)定位點上誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂，所述雙鏈斷裂由向所述細胞中引入識別所述預(yù)定位點附近或所述預(yù)定位點上的識別序列的雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)(DSBI)酶來誘導(dǎo)； b.選擇植物細胞，其中已經(jīng)修復(fù)了所述雙鏈DNA斷裂，導(dǎo)致基因組中在所述預(yù)選位點處的修飾，其中所述修飾選自 1.至少一個核苷酸的替換； i1.至少一個核苷酸的缺失； ii1.至少一個核苷酸的插入；或 iv.1.-1i1.的任一組合； 其特征在于所述預(yù)定位點緊靠現(xiàn)有的原種事件。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述事件是GHB119。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述識別序列包含在SEQID NO:3或SEQ ID N0:4中。
4.權(quán)利要求1-3任何一項的方法，其中所述識別序列包含SEQIDN0:1或SEQ ID NO: 2的核苷酸序列。
5.用于在預(yù)定位點修飾植物細胞的基因組的方法，其包括以下步驟: a.在所述預(yù)定位點附近或在所述預(yù)定位點上誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂，所述雙鏈斷裂由向所述細胞中引入識別所述預(yù)定位點附近或所述預(yù)定位點上的識別序列的雙鏈DNA斷裂誘導(dǎo)(DSBI)酶來誘導(dǎo)； b.選擇植物細胞，其中已經(jīng)修復(fù)了所述雙鏈DNA斷裂，導(dǎo)致基因組中在所述預(yù)選位點處的修飾，其中所述修飾選自 1.至少一個核苷酸的替換； i1.至少一個核苷酸的缺失； ii1.至少一個核苷酸的插入；或 iv.1.-1i1.的任一組合； 其特征在于所述識別位點包含SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求1-5任何一項的方法，其中通過向所述細胞中遞送包含編碼所述內(nèi)切核酸酶的一個或多個嵌合基因的核酸分子向所述細胞中引入所述DSBI酶。
7.權(quán)利要求1-6任何一項的方法，其中所述DSBI酶是單鏈大范圍核酸酶或一對大范圍核酸酶，其識別或一致識別所述預(yù)定位點并誘導(dǎo)所述雙鏈斷裂。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述大范圍核酸酶或大范圍核酸酶對來自1-Crel，并且其中以下氨基酸存在于大范圍核酸酶單元I中: a.位置32處的S; b.位置33處的Y; c.位置38處的Q; d.位置80處的Q； e.位置40處的S； f.位置42處的T; g.位置77處的R;h.位置68處的Y;i.位置70處的Q; j.位置75處的H; k.位置44處的T ； .位置24處的I; m.位置26處的Q ； η.位置28處的K; ο.位置30處的N， 并且其中以下氨基酸存在于大范圍核酸酶單元2中: P.位置70處的S ; q.位置44處的Q ; r.位置24處的K ； s.位置26處的A ； t.位置28處的K; u.位置30處的N ； V.位置32處的S ; w.位置33處的Y; X.位置38處的Q ; y.位置80處的Q ； Z.位置40處的S ； aa.位置42處的T ; bb.位置77處的Q ; cc.位置68處的Y。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述大范圍核酸酶或大范圍核酸酶對包含SEQID N0.6從氨基酸位置11-165和位置204-360的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求7-9任一項的方法,其中所述大范圍核酸酶或大范圍核酸酶對由包含或一起包含SEQ ID N05從核苷酸位置3120-3584和位置3698-4169的核苷酸序列的一條或多條核苷酸序列編碼。
11.權(quán)利要求1-10任一項的方法，其中在步驟b.之前，向所述細胞中遞送修復(fù)DNA分子，所述修復(fù)DNA分子用作修復(fù)所述雙鏈DNA斷裂的模板。
12.權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中所述修復(fù)DNA包含至少一個側(cè)翼區(qū)，其包含與所述預(yù)定位點上游或下游DNA區(qū)具有充分同源性的核苷酸序列，以允許與所述上游或下游DNA區(qū)重組。
13.權(quán)利要求1-12任一項的方法，其中所述修復(fù)DNA包含位于所述修復(fù)DNA相反端的兩個側(cè)翼區(qū)，所述側(cè)翼區(qū)之一包含與所述預(yù)定位點的上游DNA區(qū)具有充分同源性的核苷酸序列，另一個側(cè)翼區(qū)包含與所述預(yù)定位點的下游序列具有充分同源性的核苷酸序列，以允許所述側(cè)翼核苷酸序列與所述 上游和下游DNA區(qū)之間重組。
14.權(quán)利要求1-13任一項的方法，其中所述修復(fù)DNA包含可選擇的標(biāo)志物基因。
15.權(quán)利要求1-14任一項的方法，其中所述修復(fù)DNA包含植物可表達的目的基因。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述植物可表達的目的基因選自除草劑耐受基因、昆蟲抗性基因、疾病抗性基因、非生物脅迫抗性基因、參與油類生物合成、碳水化合物生物合成的酶、參與纖維素強度或纖維素長度的酶、參與次生代謝物生物合成的酶。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述植物可表達的目的基因編碼具有HPro活性的蛋白質(zhì)。
18.權(quán)利要求16或17的方法，其中所述植物可表達的目的基因編碼具有HPH)活性的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)在對應(yīng)于SEQ ID NO: 19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白質(zhì)向所述植物提供對至少IX田間劑量的至少一種HPH)抑制劑的耐受性。
19.權(quán)利要求1-18任一項的方法，其中所述植物細胞進一步再生成植物。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述植物進一步與另一植物雜交。
21.包含嵌合基因的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子，所述嵌合基因包含 (a)編碼具有HPPD活性的蛋白質(zhì)的核酸序列，其中所述蛋白質(zhì)在對應(yīng)于SEQID NO: 19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白質(zhì)向所述植物提供對至少IX田間劑量的至少一種HPH)抑制劑的耐受性，所述核酸序列有效連接 (b)植物可表達的啟動子和任選地 (c)翻譯終止和多腺苷酸化區(qū)。
22.權(quán)利要求21的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子，其中所述蛋白質(zhì)與SEQIDNO:21的氨基酸序 列具有至少95%的序列同一性。
23.權(quán)利要求21或22的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子，其中優(yōu)化編碼具有HPPD活性的蛋白質(zhì)的所述核酸序列用于在棉花中表達。
24.權(quán)利要求21-23任一項的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子，其中所述蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列或由包含SEQ ID NO: 20從nt949_nt2025的核苷酸序列的核酸編碼。
25.權(quán)利要求21-24任一項的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子，其對至少1.5X田間劑量的所述至少一種HPro抑制劑具有耐受性。
26.權(quán)利要求21-25任一項的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子，其對至少2X田間劑量的所述至少一種HPH)抑制劑具有耐受性。
27.權(quán)利要求21-26任一項的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子，其對至少4X田間劑量的所述至少一種HPro抑制劑具有耐受性。
28.權(quán)利要求21-27任一項的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子，其中所述至少一種HPF1D抑制劑選自甲基磺草酮、異氟草、苯批唑草酮、pyrasulfutole和環(huán)磺酮。
29.權(quán)利要求28的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子，其對至少兩種HPH)抑制劑，優(yōu)選至少三種HPro抑制劑，更優(yōu)選至少四種HPro抑制劑，如至少5種或至少6種HPro抑制劑耐受。
30.權(quán)利要求21-29任一項的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子，其中所述嵌合基因包含SEQ ID NO: 20從位置88-位置2714的核酸序列。
31.權(quán)利要求21-30任一項的棉花植物細胞、植物部分、植物或種子，其包含至少一種其他嵌合基因，所述嵌合基因包含編碼這樣的酶的核酸序列，所述酶向植物提供對非HPro抑制劑的除草劑的耐受性或提供對至少一種昆蟲或真菌物種的耐受性。
32.用于獲得對至少IX田間劑量的至少一種HPro抑制劑耐受的棉花植物或植物細胞的方法，其包括 -引入嵌合基因，其包含: (a)編碼具有HPH)活性的蛋白質(zhì)的核酸序列，其中所述蛋白質(zhì)在對應(yīng)于SEQID NO: 19的位置336的位置上具有色氨酸，其中所述蛋白質(zhì)向所述植物提供對至少IX田間劑量的至少一種HPH)抑制劑的耐受性，所述核酸序列有效連接 (b)植物可表達的啟動子和任選地 (c)翻譯終止和多腺苷酸化區(qū)。
33.用于控制棉花植物附近或植物田地中雜草的方法，其包括 -向棉花植物附近或棉花植物田地應(yīng)用至少IX田間劑量的至少一種HPro抑制劑。
34.權(quán)利要求32或33的方法，其中所述至少一種HPH)抑制劑選自甲基磺草酮、異氟草、苯批唑草酮、pyrasulfutole和環(huán)橫酮。
35.權(quán)利要求32-34任一項的方法，其中以至少1.5X、至少2X或至少4X的田間劑量應(yīng)用所述至少一種HPro抑制劑。
36.權(quán)利要求32-35任一項的方法，其中所述至少一種HPH)抑制劑是異氟草和甲基磺草酮，其中所述異氟草在出苗前應(yīng)用，而所述甲基磺草酮在出苗后應(yīng)用。
37.植物細胞，其在基因組預(yù)定位點上包含通過權(quán)利要求1-18任一項的方法獲得的修飾。
38.植物、植物部分、種子或其繁殖材料，其在基因組的預(yù)定位點上包含通過權(quán)利要求19的方法獲得的修飾或基本上由權(quán)利要求37的植物細胞組成。
39.培養(yǎng)權(quán)利要求38的植物的方法，其包括向所述植物或培養(yǎng)所述植物的基質(zhì)中應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)的步驟。
40.用于產(chǎn)生在基因組的預(yù)定位點上包含修飾的植物的方法，其包括使基本上由權(quán)利要求37的植物細胞組成的植物或權(quán)利要求38的植物與另一植物或其自身雜交并任選地收獲種子的步驟。
41.DSBI酶在原種事件附近修飾植物細胞的基因組的用途。
42.編碼具有HPH)活性的蛋白質(zhì)的核酸序列產(chǎn)生棉花植物或其植物細胞、植物部分或種子的用途，其中所述蛋白質(zhì)在對應(yīng)于SEQ ID NO: 19的位置336的位置上具有色氨酸，所述棉花植物對至少IX田間劑量的至少一種HPPD抑制劑耐受。
【文檔編號】C12N9/00GK103890181SQ201280049574
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月22日
【發(fā)明者】K·達倫, J·迪特根, S·簡森斯, F·莫伊勒韋特, K·韋特林斯, H·莫澤, T·維爾德, R·海因, U·比克爾斯, L·特落林德爾, G·亨寧格爾 申請人:拜爾作物科學(xué)公司, 拜爾作物科學(xué)股份公司, 拜耳作物科學(xué)有限公司