一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，該方法包括，在能夠生成檸檬酸的條件下，將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，其中，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1-1.7重量%時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抑制劑，所述抑制劑的添加量使得黑曲霉的含量能夠增加，但增加量不超過0.2重量%/小時。通過采用本發(fā)明的技術方案進行檸檬酸發(fā)酵，有效的抑制了發(fā)酵菌種的過快生長，并使發(fā)酵菌體和營養(yǎng)物質(zhì)都向更有利于產(chǎn)檸檬酸的趨勢發(fā)展，從而提高了發(fā)酵水平。同時，發(fā)酵菌種的菌球小而緊密，菌絲較短，使得在保證發(fā)酵所需的溶氧量的前提下有效地降低了攪拌功率，從而易于操作并降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種發(fā)酵制備軒檬酸的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
【背景技術】
[0002]檸檬酸是目前可以用微生物代謝生產(chǎn)的重要有機酸，其用途非常廣泛，主要用于食品工業(yè)，其次是醫(yī)藥、紡織、建筑等工業(yè)部門；在各種重要器材的清洗、除銹和日用化工等方面也有重要用途。
[0003]目前檸檬酸發(fā)酵行業(yè)采取的發(fā)酵技術通常為一次投料一次放料的間歇式液體深層二級發(fā)酵技術。其發(fā)酵過程為:將淀粉質(zhì)原料酶解制備發(fā)酵培養(yǎng)基，然后將黑曲霉菌種接種到發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸，發(fā)酵停止后發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)板框分離出菌體殘渣和發(fā)酵清液，發(fā)酵清液進入后續(xù)工序提取檸檬酸，菌體殘渣進入飼料烘干工序。
[0004]但采用現(xiàn)有技術生產(chǎn)檸檬酸，檸檬酸的產(chǎn)量和發(fā)酵轉(zhuǎn)化率均較低，并且發(fā)酵過程中對培養(yǎng)基的攪拌功率較大，因此，發(fā)酵成本較高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了克服采用現(xiàn)有技術生產(chǎn)檸檬酸中，檸檬酸的產(chǎn)量和發(fā)酵轉(zhuǎn)化率均較低，并且發(fā)酵成本高的缺陷，提供一種檸檬酸的產(chǎn)量和發(fā)酵轉(zhuǎn)化率均較高，且發(fā)酵成本低的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
[0006]本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用現(xiàn)有技術生產(chǎn)檸檬酸，檸檬酸的產(chǎn)量和發(fā)酵轉(zhuǎn)化率均較低的原因在于:由于在配制用于檸檬酸發(fā)酵的培養(yǎng)基時，一般都是一次性將發(fā)酵所需的營養(yǎng)物質(zhì)全部加入到發(fā)酵罐中，但這樣致使在發(fā)酵過程中，由于發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)過剩，導致發(fā)酵菌種生長過快。一方面，發(fā)酵菌種生長過快，會偏向于將絕大部分營養(yǎng)物質(zhì)和時間用于自身的生長上，使得用于合成檸檬酸的營養(yǎng)物質(zhì)和時間大大減少，造成了營養(yǎng)物質(zhì)的浪費，并且其合成檸檬酸的效率會大大下降。另一方面，由于發(fā)酵菌種生長過快，導致其菌球過大且蓬松，菌絲過長，使得在發(fā)酵過程中保證溶氧量的情況下會增加攪拌功率，從而造成了能源的浪費，增加了發(fā)酵成本。
[0007]本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在檸檬酸發(fā)酵過程中，在發(fā)酵菌種對數(shù)生長的早期通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抑制劑，使得發(fā)酵菌種的生長以及產(chǎn)檸檬酸處于相協(xié)調(diào)的狀態(tài)，因此，能夠在一定程度上抑制發(fā)酵菌種的過快生長，使其維持在正常的生長水平上，使其用于自身生長的營養(yǎng)物質(zhì)大大減少，在保證了發(fā)酵菌體向更有利于產(chǎn)檸檬酸的趨勢發(fā)展的同時，也增加了用于產(chǎn)檸檬酸的營養(yǎng)物質(zhì)，從而提高了檸檬酸的發(fā)酵水平。另外，發(fā)酵菌體的狀態(tài)相對于現(xiàn)有技術的發(fā)酵菌體的狀態(tài)，菌球小而緊密，菌絲較短，使得在保證發(fā)酵所需的溶氧量的前提下有效地降低了攪拌功率，從而易于操作并降低了生產(chǎn)成本。
[0008]基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，該方法包括，在能夠生成檸檬酸的條件下，將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，其中，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1-1.7重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抑制劑，所述抑制劑的添加量使得黑曲霉的含量能夠增加，但增加量不超過0.2重量％/小時。
[0009]優(yōu)選地，所述抑制劑的添加量使得黑曲霉的含量的增加量為0.02-0.08重量％/小時。
[0010]優(yōu)選地，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1.2-1.5重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述抑制劑。
[0011]優(yōu)選地，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1.6-2.5重量％時停止向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述抑制劑。
[0012]通過采用本發(fā)明的技術方案進行檸檬酸發(fā)酵，在發(fā)酵過程中添加抑制劑，有效的抑制了發(fā)酵菌種的過快生長，并使其維持在正常的生長水平上，無論從菌體本身還是營養(yǎng)物質(zhì)上都向更有利于產(chǎn)檸檬酸的趨勢發(fā)展，從而提高了發(fā)酵水平。同時，在適當?shù)臅r機加入抑制劑，還能夠使得發(fā)酵菌種的菌球小而緊密，菌絲較短，使得在保證發(fā)酵所需的溶氧量的前提下有效地降低了攪拌功率，從而易于操作并降低了生產(chǎn)成本。
[0013]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為實施例1在添加抑制劑的情況下，發(fā)酵24小時的菌體形態(tài)的顯微鏡圖片，放大倍數(shù)為150倍。
[0015]圖2為對比例I在不添加抑制劑的情況下，發(fā)酵24小時的菌體形態(tài)的顯微鏡圖片，放大倍數(shù)為150倍。
【具體實施方式】
[0016]以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0017]—方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，該方法包括，在能夠生成朽1檬酸的條件下，將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，其中，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1-1.7重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抑制劑，所述抑制劑的添加量使得黑曲霉的含量能夠增加，但增加量不超過每小時0.2重量％。
[0018]根據(jù)本發(fā)明，檸檬酸發(fā)酵過程中，在黑曲霉生長的對數(shù)期，其主要進行自身的生長。而由于目前檸檬酸發(fā)酵行業(yè)，為了節(jié)省操作步驟，采取的發(fā)酵技術通常為一次投料，因此，發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)相對于黑曲霉生長所需的營養(yǎng)是過剩的。在這種情況下，黑曲霉的主要活動會偏向于將大部分營養(yǎng)物質(zhì)用于有利于其自身生長的基礎代謝上，因此，產(chǎn)檸檬酸的代謝會受到抑制；同時，由于其自身生長消耗了過多的營養(yǎng)，也導致了營養(yǎng)物質(zhì)的浪費。并且，其過快的生長導致其菌球過大且疏松、菌絲過長，使得在保證溶氧量的前提下攪拌功率劇增，從而造成了成本的浪費。因此，本發(fā)明中，通過在黑曲霉生長的對數(shù)期向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的抑制劑，以抑制黑曲霉的過快生長，使其維持在正常的生長水平上，以能夠在自身的生長代謝和產(chǎn)檸檬酸的代謝中達到平衡，從而發(fā)揮其產(chǎn)檸檬酸的最佳水平。
[0019]通常情況下，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1-1.7重量％時，黑曲霉正處于其生長的對數(shù)期早期，在此時間段內(nèi)開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抑制劑，能夠有效的抑制黑曲霉的過快生長，使其趨于正常的生長水平。同時，本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，過早加入抑制劑會使得發(fā)酵菌體還來不及正常的生長就受到抑制，從而不能正常的生產(chǎn)檸檬酸。過晚加入抑制劑會使的抑制劑對發(fā)酵菌體無法起到抑制的作用，從而不能實現(xiàn)本發(fā)明的目的。因此，本發(fā)明中，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1-1.7重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抑制劑。
[0020]優(yōu)選地，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1.2-1.5重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抑制劑能夠更好地實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的發(fā)明人的實踐經(jīng)驗，在正常的檸檬酸發(fā)酵過程中，當將黑曲霉菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中后的12-18小時，發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量一般可達到1-1.7重量％。因此，在本發(fā)明的一種可替代的實施方式中，為了節(jié)省操作步驟，還可以在當將黑曲霉菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中后的12-18小時時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抑制劑。
[0022]本發(fā)明的發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，在保證黑曲霉能夠生長，且其含量的增加量不超過每小時0.2重量％的情況下，黑曲霉菌體能夠在自身的生長代謝和產(chǎn)檸檬酸的代謝中達到很好的平衡。
[0023]根據(jù)本發(fā)明，盡管當黑曲霉的含量的增加量在如上所述范圍內(nèi)時，即可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。但優(yōu)選地，當黑曲霉的含量的增加量為0.02-0.08重量％/小時，更優(yōu)選為
0.04-0.08重量％/小時時，黑曲霉菌體能夠在自身的生長代謝和產(chǎn)檸檬酸的代謝中達到更好的平衡，從而可以更進一步實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0024]需要注意的是，本發(fā)明中的術語“增加量”是指單位時間內(nèi)黑曲霉?jié)窬w增加的重
量百分含量。
`[0025]根據(jù)本發(fā)明，對所述發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體含量進行測定的方法為本領域技術人員所公知。例如，每隔一段時間對發(fā)酵培養(yǎng)基進行取樣，并離心(3000-5000rpm離心10-15分鐘)收集菌體沉淀，然后對所述菌體沉淀進行稱重得到黑曲霉?jié)窬w的含量。
[0026]本發(fā)明中，對發(fā)酵培養(yǎng)基進行取樣的時間間隔沒有特別的限定，可以根據(jù)黑曲霉的實際生長狀況進行調(diào)整，例如，當黑曲霉的含量增加較慢時，其間隔時間可以適當延長，例如，可以為2-3小時；當增加較快時，其間隔時間可以適當縮短，例如，可以為1-2小時。
[0027]本發(fā)明中，對抑制劑的種類沒有特別的限制，只要能夠抑制黑曲霉菌體的生長并不影響黑曲霉的產(chǎn)酸以及后續(xù)檸檬酸的分離即可。優(yōu)選地，所述抑制劑為抗生素和/或表面活性劑。
[0028]本領域技術人員公知，表面活性劑的分子結構具有兩親性:一端為親水基團，另一端為憎水基團。因此，表面活性劑通常用作乳化劑。尤其是在培養(yǎng)基的配制中，常添加表面活性劑以使不易溶于水的物質(zhì)能夠在水中較好的溶解，以達到促溶的作用。在有些研究中，例如，表面活性劑對白腐真菌降解多環(huán)芳烴的影響(陳靜等，環(huán)境科學，2006年I月，第27卷第I期)中，表面活性劑還可以促進菌體的生理活動。而本發(fā)明的發(fā)明人卻意外的發(fā)現(xiàn)，在檸檬酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加表面活性劑卻可以起到抑制黑曲霉菌體過快生長作用，且不會影響黑曲霉的產(chǎn)酸以及后續(xù)檸檬酸的分離。
[0029]優(yōu)選地，所述抗生素選自青霉素；所述表面活性劑選自吐溫-60和/或吐溫-20。
[0030]根據(jù)本發(fā)明，所述抑制劑的添加狀態(tài)可以以固體狀態(tài)添加，也可以以其水溶液的狀態(tài)添加，優(yōu)選情況下，以其水溶液的狀態(tài)添加到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中。同時，一方面為了不使當所述抑制劑的水溶液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中時引起發(fā)酵培養(yǎng)基中局部抑制劑濃度過高而對菌體造成殺傷作用；另一方面，為了不使所述抑制劑的水溶液由于濃度過低而加入的量過多，從而對發(fā)酵培養(yǎng)基造成稀釋，優(yōu)選情況下，當所述抑制劑為抗生素時，其濃度為1.5-2.0U/ml發(fā)酵液，當所述抑制劑為表面活性劑時，其濃度為0.5-1.0g/Ι發(fā)酵液。
[0031]根據(jù)本發(fā)明，對所述抑制劑的添加方式以及添加量沒有特別的限制，只要保證添加后能夠?qū)⒑谇沟暮康脑黾恿靠刂圃诒景l(fā)明的范圍內(nèi)即可。例如，可以向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)添加所述抑制劑。當以連續(xù)添加的方式添加抑制劑時，通常以抑制劑的水溶液的狀態(tài)添加，并優(yōu)選使所述抑制劑的水溶液的濃度在上述優(yōu)選范圍內(nèi)，其流速的控制可以根據(jù)菌體含量，以及通過對發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體含量的檢測得到的數(shù)據(jù)進行調(diào)整，以使黑曲霉的含量的增加量不超過0.2重量％/小時，并優(yōu)選控制在0.02-0.08重量％/小時，更優(yōu)選控制在0.04-0.08重量％/小時之間。通常情況下，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準，所述抑制劑的流速為0.4-0.6L/h。
[0032]或者，還可以分多次向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述抑制劑。當以分多次添加的方式加入抑制劑時，所述抑制劑的加入狀態(tài)可以以固體的狀態(tài)加入，也可以以其水溶液的狀態(tài)加入，但通常以其水溶液的狀態(tài)加入，并優(yōu)選使所述抑制劑水溶液的濃度在上述優(yōu)選范圍內(nèi)，每次的添加量和相鄰兩次添加的間隔時間可以根據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌體含量，以及通過對發(fā)酵培養(yǎng)基的菌體含量每隔一段時間進行檢測得到的數(shù)據(jù)進行調(diào)整(例如，添加一次后，每隔1-2小時對發(fā)酵培養(yǎng)基的菌體含量進行檢測，當菌體含量的增加量剛剛不超過0.2重量％/小時，優(yōu)選不超過0.08重量％/小時時，再次進行添加)，以使黑曲霉的含量的增加量不超過0.2重量％/小時，并優(yōu)選控制在0.02-0.08重量％/小時，更優(yōu)選控制在0.04-0.08重量％/小時之間。通常情況下，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準，其每次的添加量為0.4-0.5g/L，相鄰兩次添加的時間間隔優(yōu)選為1-2小時。
[0033]本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由于以連續(xù)性的方法向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抑制劑，可使發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體的含量的增加量始終控制在本發(fā)明的最優(yōu)范圍內(nèi)。因此，優(yōu)選情況下，采用連續(xù)添加的方式向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述抑制劑。
[0034]本發(fā)明中，盡管可以一直添加所述抑制劑直到發(fā)酵的終點，但通常當發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體的含量達到1.6-2.5重量％ (大致相應于將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中后的28-40小時)，優(yōu)選達到1.7-2重量％ (大致相應于將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中后的30-35小時)時，黑曲霉正處于生長的穩(wěn)定期，發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體的含量變化不大，因此，為了節(jié)省成本及操作時間，并降低抑制劑對發(fā)酵培養(yǎng)基的影響，優(yōu)選地，當發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體的含量達到1.6-2.5重量％，優(yōu)選達到1.7-2重量％時停止向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述抑制劑。
[0035]根據(jù)本發(fā)明，還可以根據(jù)發(fā)酵過程中黑曲霉菌體的形態(tài)的變化判斷開始加入抑制劑的時間以及添加量。黑曲霉菌體形態(tài)的變化的判斷標準具體可以為:獲得上述控制點的黑曲霉形態(tài)的顯微鏡圖片，并將不同控制點的黑曲霉形態(tài)的顯微鏡圖片做成比對卡，并以此作為參考。
[0036]根據(jù)本發(fā)明，對發(fā)酵培養(yǎng)基的成分沒有特別的要求，只要可以用于檸檬酸發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基即可。優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物，氮源含量為0.06-0.14重量％，磷源含量為0.005-0.07重量％，無機鹽含量0.1-2.6重量％，水含量為77-86重量％ ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總糖含量為10-20重量％。一般地，淀粉質(zhì)原料酶解得到液化液，液化液經(jīng)過分離得到淀粉質(zhì)原料酶解殘渣和淀粉質(zhì)原料酶解液化清液，通常可以將淀粉質(zhì)原料酶解液化清液用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基，也可以將淀粉質(zhì)原料酶解液化清液與淀粉質(zhì)原料酶解殘渣混合后用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基，還可以將淀粉質(zhì)原料酶解液化清液與液化液混合后用于制備發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明所述淀粉質(zhì)原料酶解產(chǎn)物優(yōu)選由液化液和淀粉質(zhì)原料酶解液化清液與水混合或不與水混合得到，且進一步優(yōu)選以所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總重量為100重量份為基準，所述淀粉質(zhì)原料酶解液化清液的用量為75-85重量份，所述液化液的用量為15-20重量份，水的用量為0-5重量份。
[0037]其中，所述總糖的含量是指以利用菲林試劑法測定的葡萄糖計的糖含量。
[0038]根據(jù)本發(fā)明，所述淀粉質(zhì)原料酶解液化清液可以通過多種方法制備得到，例如，可以通過如下方法制備得到:將淀粉質(zhì)原料粉碎，將粉碎后的產(chǎn)物進行酶解，得到酶解產(chǎn)物，將酶解產(chǎn)物固液分離，得到淀粉質(zhì)原料酶解液化清液和淀粉質(zhì)原料酶解殘渣，所述固液分離的條件使淀粉質(zhì)原料酶解殘渣的固含量為5-60重量％，更優(yōu)選為30-50重量％。
[0039]根據(jù)本發(fā)明，所述淀粉質(zhì)原料可以為本領公知的各種可以用于酶解、發(fā)酵制備檸檬酸的含有淀粉的原料，例如，可以選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或幾種，優(yōu)選情況下，所述淀粉質(zhì)原料為玉米。
[0040]所述酶解步驟可以通過本領域常用的方法完成，比如向粉碎產(chǎn)物中添加產(chǎn)酶微生物和/或酶，在產(chǎn)酶微生物的生長溫度和/或酶有活力的溫度下保溫完成。所述產(chǎn)酶微生物為能夠分泌淀粉酶的產(chǎn)酶微生物。所述酶包括淀粉酶。
[0041]由于微生物生長會產(chǎn)生副產(chǎn)物，因此優(yōu)選直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考慮，優(yōu)選以每克粉碎后的粉碎產(chǎn)物的干重計，所述淀粉酶的用量為15-50個酶活力單位。
[0042]本發(fā)明所述酶的酶活力單位的定義為:在pH值為6.0、溫度為70°C的條件下，1分鐘將I毫克淀粉轉(zhuǎn)化為還原糖所需的酶量為一個酶活力單位。
[0043]所述酶解的溫度可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選為80-120°C，更優(yōu)選為90-105°C。所述酶解的時間理論上越長越好，考慮到設備利用率，優(yōu)選所述酶解的時間為90-150分鐘，更優(yōu)選為100-120分鐘。所述酶解的pH值可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選為5.0-7.0，更優(yōu)選PH值為5.6-6.0。
[0044]淀粉酶是指能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，其具體選擇為本領域技術人員所公知，例如，所述淀粉酶一般包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和異淀粉酶。
[0045]根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用α -淀粉酶和/或異淀粉酶。
[0046]根據(jù)本發(fā)明，所述黑曲霉的接種量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，以每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準，黑曲霉的接種量為1 X 104-2.5 X 10(5)個孢子，更優(yōu)選3X1O(4)-1.5X10(5)個孢子。
[0047]所述孢子數(shù)可以通過本領域公知的方法測定，例如，通過血球計數(shù)板計數(shù)。
[0048]本發(fā)明發(fā)酵所使用的黑曲霉可以為商購的黑曲霉固體制劑或黑曲霉菌種，例如，黑曲霉Co827 (上海工業(yè)微生物研究所)和黑曲霉TOl (天津工業(yè)微生物所)。
[0049]所述黑曲霉可以采用常規(guī)的方法接種，例如，在被接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中之前，將所述黑曲霉經(jīng)過種子培養(yǎng)處理，之后將得到的種子液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中。黑曲霉種子培養(yǎng)的程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑曲霉的生長進行觀察，當pH在2.0-2.5、酸度0.8-2.0%、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時停止培養(yǎng)。
[0050]優(yōu)選情況下，所述種子培養(yǎng)處理的方法包括:將黑曲霉接種在黑曲霉培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，所述黑曲霉培養(yǎng)液中含有10-17重量％的玉米粉，接種后黑曲霉培養(yǎng)液中黑曲霉的濃度為3X 105-4X 105個孢子/毫升。
[0051]根據(jù)本發(fā)明，所述黑曲霉培養(yǎng)液的制備方法沒有特別的限制，只要得到的培養(yǎng)液能夠適用于黑曲霉的培養(yǎng)即可。
[0052]根據(jù)本發(fā)明，所述黑曲霉種子的培養(yǎng)條件可以在很大范圍內(nèi)改變，例如所述培養(yǎng)的條件可以包括:培養(yǎng)的溫度可以為30-42°C，pH值可以為1-7，通氣量可以為0.1-1.0體積:(體積.分鐘)，壓力可以為0-0.1Mpa，培養(yǎng)的時間可以為18-35小時，攪拌速度為700-800rpm ;優(yōu)選的情況下，培養(yǎng)的溫度為32_40°C，pH值為2_6，通氣量為0.1-0.8 (體積:體積.分鐘)，壓力為0-0.08Mpa，培養(yǎng)的時間為20-30小時。
[0053]根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵的條件除向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抑制劑以使黑曲霉的含量的增加量控制在本發(fā)明的范圍內(nèi)之外沒有特別的限制，可以為本領域常規(guī)的發(fā)酵條件，例如，所述發(fā)酵的條件可以包括:溫度為33-40°C，優(yōu)選為34-38°C ;通氣量為0.1-1體積:(體積.分鐘)，優(yōu)選為0.3-1.0體積:(體積.分鐘)；攪拌速度為800-900rpm ;時間為50-65小時，優(yōu)選為55-62小時。
[0054]術語“通氣量”一般以通氣比來表示，通常以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示(V / (ν.π?η))，例如通氣比為1:0.1-1，簡稱通氣量為0.1-1體積:(體積.分鐘)。
[0055]所述培養(yǎng)的設備為本領域技術人員所公知，例如，可以使用發(fā)酵罐進行培養(yǎng)。
[0056]按照本發(fā)明的方法`制備得到的發(fā)酵產(chǎn)物檸檬酸可以用常規(guī)的方法，根據(jù)不同工業(yè)產(chǎn)品的要求分離并精制，比如中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝。
[0057]以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術構思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0058]另外需要說明的是，在上述【具體實施方式】中所描述的各個具體技術特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合。為了避免不必要的重復，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。
[0059]此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應當視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
[0060]下面根據(jù)制備例、實施例和對比例詳細說明本發(fā)明提供的檸檬酸的發(fā)酵方法。
[0061]其中，發(fā)酵酸度和發(fā)酵轉(zhuǎn)化率通過如下方法計算。
[0062]青霉素購買華北制藥股份有限公司。吐溫-60、吐溫-20購買佛山市科的氣體化工有限公司。
[0063]發(fā)酵酸度:根據(jù)GB1987-2007標準檢測發(fā)酵后發(fā)酵培養(yǎng)基的濃度(簡稱酸度)。
[0064]發(fā)酵轉(zhuǎn)化率:通過上述發(fā)酵酸度計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率(％)=發(fā)酵培養(yǎng)基的濃度(簡稱酸度)X發(fā)酵培養(yǎng)基的體積/總糖的重量X 100%，其中，總糖的重量包括種子罐用糖重量和發(fā)酵罐用糖重量。所述總糖的濃度是指以利用菲林試劑法測定的葡萄糖計的糖濃度。[0065]黑曲霉菌體含量的測定:取50ml發(fā)酵液，以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心lOmin，去掉上清后測定黑曲霉?jié)窬w沉淀的重量，并計算黑曲霉?jié)窬w的含量。
[0066]制備例I
[0067]發(fā)酵用發(fā)酵培養(yǎng)基的制備
[0068]I)原料的粉碎:將收獲的玉米在熱水槽浸潤，直至玉米的含水量為15重量％，然后通過粉碎機(江蘇牧羊集團有限公司，968-3型)進行粉碎，得到淀粉質(zhì)原料粉碎產(chǎn)物(粉碎顆粒中50重量％的顆粒直徑小于0.1cm)；
[0069]2)調(diào)漿:將50°C的水與I)中得到的淀粉質(zhì)原料粉碎產(chǎn)物混合進行調(diào)漿得到淀粉漿液，所述淀粉質(zhì)原料粉碎產(chǎn)物與水的重量比為1:3，淀粉漿液的pH值為5.5 ；
[0070]3)酶解:將步驟2)得到的淀粉漿液與淀粉酶(諾維信公司，α _淀粉酶，本發(fā)明實施例中均為此淀粉酶)的總重量的1/2的酶(添加淀粉酶的總重量以15U/g玉米粉粉碎產(chǎn)物)混合，在95°C、pH為5.5的條件下進行一次噴射液化5分鐘，然后在125°C進行二次噴射液化，之后閃蒸降溫至95°C，再添加另外總重量的1/2的淀粉酶進行酶解直至酶解產(chǎn)物的DE值達到18重量％，得到酶解產(chǎn)物，也即玉米液化液；
[0071]4)過濾:將3)得到的80重量％的酶解產(chǎn)物通過用液壓式板框壓濾機進行壓濾，分離出玉米液化清液和玉米酶解殘渣；
[0072]5)配制發(fā)酵培養(yǎng)基:將上述玉米`液化清液和玉米液化液以80:15的體積比混合后加入到發(fā)酵罐中，高溫高壓滅菌后得到發(fā)酵培養(yǎng)基。所述發(fā)酵培養(yǎng)基中總糖的含量為15.5重量％，氮源含量為0.1重量％，磷源含量為0.035重量％，無機鹽的含量為2.1重量％，水的含量為81.0重量％。其中，所述總糖含量為以葡萄糖計的糖含量。
[0073]制備例2
[0074]發(fā)酵菌種種子液的制備
[0075]將制備例I的步驟3)中的部分玉米液化液加水稀釋至總糖的含量為11重量％，將培養(yǎng)液投入種子罐，加熱到121 °C消毒，維持20分鐘后快速降溫至36°C，接入黑曲霉菌種(黑曲霉T01，天津工業(yè)微生物所，本發(fā)明實施例中均為此黑曲霉菌種，接種量為:每毫升培養(yǎng)液為基準，接種1\105個孢子)，溫度為371:，通氣量為0.4￥ / ν.π?η，通入的空氣壓力為0.05-0.06Mpa，攪拌速度為750rpm，并在此階段內(nèi)維持此罐壓的條件下進行菌種培養(yǎng)；通過取樣顯微鏡鏡檢、酸度測定和PH測定對黑曲霉的生長進行觀察，24小時之后，當pH在2.0、酸度1.0g/L、菌球大小均勻、菌絲粗壯伸出時，停止培養(yǎng)。其中，所述總糖含量為以葡萄糖計的糖含量。
[0076]實施例1
[0077]本實施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
[0078]將制備例2中培養(yǎng)的黑曲霉種子液加入到制備例I的發(fā)酵培養(yǎng)基中開始發(fā)酵，其中，以每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基計，黑曲霉的接種量為3.0X IO4個孢子，發(fā)酵條件包括溫度為370C，培養(yǎng)的壓力為0.04Mpa,通氣量為0.8體積:(體積?分鐘)，攪拌速度為850rpm。發(fā)酵過程中不斷取樣測定培養(yǎng)基中的菌體含量。
[0079]當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1.4重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)添加濃度為0.6g/L發(fā)酵液的吐溫-60溶液。其中，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基計，所述吐溫-60溶液添加的流速為0.4L/h，維持發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體的增加量在0.05-0.07重量％/小時之間(整個過程每隔3小時檢測一次發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌體含量，以保證菌體的增加量在0.05-0.07重量％/小時之間，同時，鏡檢菌體的形態(tài))。當菌體含量達到1.9重量％時停止向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述抑制劑。發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。
[0080]根據(jù)GB1987-2007標準檢測所得檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)，計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率。結果如表1所示，圖1為發(fā)酵24小時的菌體形態(tài)的顯微鏡圖片，放大倍數(shù)為150倍。
[0081]實施例2
[0082]本實施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
[0083]將制備例2中培養(yǎng)的黑曲霉種子液加入到制備例I的發(fā)酵培養(yǎng)基中開始發(fā)酵，其中，以每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基計，黑曲霉的接種量為3.0X IO4個孢子，發(fā)酵條件包括溫度為370C，培養(yǎng)的壓力為0.04Mpa,通氣量為0.8體積:(體積?分鐘)，攪拌速度為800rpm。發(fā)酵過程中不斷取樣測定培養(yǎng)基中的菌體含量。
[0084]當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1.2重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)添加濃度為1.5U/ml發(fā)酵液的青霉素溶液。其中，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基計，所述青霉素溶液添加的流速為0.5L/h，維持發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體的增加量在0.06-0.08重量％/小時之間(整個過程每隔3小時檢測一次發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌體含量，以保證菌體的增加量在0.06-0.08重量％/小時之間，同時，鏡檢菌體的形態(tài))。當菌體含量達到1.7重量％時停止向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述抑制劑。發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。
[0085]根據(jù)GB1987-2007標準檢測所得檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)，計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率。結果如表1所不。
[0086]實施例3
[0087]本實施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
[0088]將制備例2中培養(yǎng)的黑曲霉種子液加入到制備例I的發(fā)酵培養(yǎng)基中開始發(fā)酵，其中，以每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基計，黑曲霉的接種量為3.0X IO4個孢子，發(fā)酵條件包括溫度為370C，培養(yǎng)的壓力為0.04Mpa,通氣量為0.8體積:(體積?分鐘)，攪拌速度為900rpm。發(fā)酵過程中不斷取樣測定培養(yǎng)基中的菌體含量。
[0089]當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1.5重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)添加濃度為0.5g/L的吐溫-20溶液。其中，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基計，所述吐溫-20溶液添加的流速為0.4L/h，維持發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體的增加量在0.04-0.07重量％/小時之間(整個過程每隔3小時檢測一次發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌體含量，以保證菌體的增加量在0.04-0.07重量％/小時之間，同時，鏡檢菌體的形態(tài))。當菌體含量達到2.0重量％時停止向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述抑制劑。發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。
[0090]根據(jù)GB1987-2007標準檢測所得檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)，計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率。結果如表1所不。
[0091]實施例4
[0092]本實施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
[0093]按照實施例1的方法進行檸檬酸的制備，其中，不同的是，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1.7重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)添加所述吐溫-60溶液。發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。
[0094]根據(jù)GB1987-2007標準檢測所得檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)，計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率。結果如表1所不。[0095]實施例5
[0096]本實施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
[0097]按照實施例1的方法進行檸檬酸的制備，其中，不同的是，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到I重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)添加所述吐溫-60溶液。發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。
[0098]根據(jù)GB1987-2007標準檢測所得檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)，計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率。結果如表1所不。
[0099]實施例6
[0100]本實施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
[0101]按照實施例1的方法進行檸檬酸的制備，其中，不同的是，所述抑制劑一直添加到發(fā)酵的終點。發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。
[0102]根據(jù)GB1987-2007標準檢測所得檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)，計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率。結果如表1所不。
[0103]實施例7
[0104]本實施例用于說明本發(fā)明提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
[0105]按照實施例1的方法進行檸檬酸的制備，其中，不同的是，向發(fā)酵培養(yǎng)基中分2次添加所述吐溫-60溶液，相鄰兩次添加所述抑制劑的時間間隔為1.5小時。其中，以每升發(fā)酵培養(yǎng)基計，每次添加的吐溫-60量為0.5g/L，并每隔I小時對發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌體含量進行檢測，根據(jù)檢測數(shù)據(jù)調(diào)整添加量，以保證使得黑曲霉菌的含量能夠增加，且增加量不超過
0.2重量％/小時。
[0106]發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。
[0107]根據(jù)GB1987-2007標準檢測所得檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)，計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率。結果如表1所不。
[0108]對比例I
[0109]本對比例用于說明現(xiàn)有技術提供的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
[0110]按照實施例1的方法進行檸檬酸的制備，其中，不同的是，不向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加濃度抑制劑。發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。
[0111]根據(jù)GB1987-2007標準檢測所得檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)，計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率。結果如表1所示。圖2為發(fā)酵24小時的菌體形態(tài)的顯微鏡圖片，放大倍數(shù)為150倍。
[0112]對比例2[0113]本對比例用于說明加入抑制劑的時機不在本發(fā)明范圍內(nèi)的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
[0114]按照實施例1的方法進行檸檬酸的制備，其中，不同的是，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到0.5重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)添加所述吐溫-60溶液。發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。
[0115]根據(jù)GB1987-2007標準檢測所得檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)，計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率。結果如表1所不。
[0116]對比例3
[0117]本對比例用于說明加入抑制劑的時機不在本發(fā)明范圍內(nèi)的發(fā)酵制備檸檬酸的方法。
[0118]按照實施例1的方法進行檸檬酸的制備，其中，不同的是，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到2.5重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)添加所述吐溫-60溶液。發(fā)酵至60小時，對發(fā)酵產(chǎn)物進行固液分離得到檸檬酸溶液，并通過中和、酸解、脫色、濃縮、結晶、包裝等過程精制得到的檸檬酸溶液。
[0119]根據(jù)GB1987-2007標準檢測所得檸檬酸溶液的濃度(簡稱酸度)，計算檸檬酸的轉(zhuǎn)化率。結果如表1所不。
[0120]表1
[0121]
【權利要求】
1.一種發(fā)酵制備檸檬酸的方法，該方法包括，在能夠生成檸檬酸的條件下，將黑曲霉接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，其特征在于，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1-1.7重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加抑制劑，所述抑制劑的添加量使得黑曲霉的含量能夠增加，但增加量不超過0.2重量％/小時。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述抑制劑的添加量使得黑曲霉的含量的增加量為0.02-0.08重量%/小時。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1.2-1.5重量％時開始向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述抑制劑。
4.根據(jù)權利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，所述抑制劑為抗生素和/或表面活性劑。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其中，所述抗生素為青霉素；所述表面活性劑為吐溫-60和/或吐溫-20。
6.根據(jù)權利要求1-3中任意一項所述的方法，其中，向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述抑制劑的方法包括:向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)添加所述抑制劑；或者，向所述發(fā)酵培養(yǎng)基中分多次添加所述抑制 劑，相鄰兩次添加所述抑制劑的時間間隔為1-2小時。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1.6-2.5重量％時停止向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述抑制劑。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中，當發(fā)酵培養(yǎng)基中黑曲霉的含量達到1.7-2重量％時停止向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述抑制劑。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述發(fā)酵的條件包括:溫度為33-40°C，通氣量為0.1-1體積:(體積.分鐘)，時間為50-65小時。
10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，以每毫升發(fā)酵培養(yǎng)基為基準，黑曲霉的接種量為 1Χ104-2.5 X IO5 個孢子。
11.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源含量為0.06-0.14重量％，磷源含量為0.005-0.07重量％，無機鹽含量0.1-2.6重量％，水含量為77-86重量％ ；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的總糖含量為10-20重量％。
【文檔編號】C12P7/48GK103497977SQ201310460264
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權日:2013年9月30日
【發(fā)明者】羅虎, 熊結青, 盧宗梅, 王梅, 吳曉艷 申請人:中糧生物化學（安徽）股份有限公司