一種高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，特別涉及一種高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，包括以下步驟：將蛹蟲草進(jìn)行活化培養(yǎng)，制得孢子懸液；將孢子懸液接種于本發(fā)明提供的半合成改良沙氏培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到種子液；將種子液接種于本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到蛹蟲草培養(yǎng)物；對蛹蟲草培養(yǎng)物進(jìn)行類胡蘿卜素的提取。本發(fā)明提供的高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，將孢子懸液接種于本發(fā)明提供的半合成改良沙氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液，將種子液接種于本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間較短，將得到的蛹蟲草培養(yǎng)物提取類胡蘿卜素，提取次數(shù)少，且提取得率穩(wěn)定，得到的類胡蘿卜素的產(chǎn)量高。
【專利說明】一種高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，具體而言，涉及一種高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法。【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們生活水平的提高，人們對身體健康的重視度也在不斷提高。天然來源食用色素以及保健品以安全無毒、有效提高身體機(jī)能等性質(zhì)也越來越受到人們的喜愛和重視。天然類胡蘿卜素(carotenoid)是一種天然來源食用色素，由八個(gè)異戊二烯組成的萜類化合物，顏色涵蓋黃色到暗紅色。國內(nèi)外研究表明，幾乎所有類胡蘿卜素均有增強(qiáng)免疫力、消除體內(nèi)自由基、抗心血管疾病和抗腫瘤等功能，β_類胡蘿卜素和α-類胡蘿卜素分別為維生素A和D的前體等。類胡蘿卜素作為食品添加劑和營養(yǎng)增補(bǔ)劑，已經(jīng)得到美國FDA、歐洲共同體、世界衛(wèi)生組織等組織的認(rèn)可。
[0003]類胡蘿卜素可由植物、藻類、光合細(xì)菌、某些非光合細(xì)菌以及真菌合成。目前市面上所使用的天然類胡蘿卜素主要由植物提取得到，但其受到環(huán)境和時(shí)間的限制。由于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素不受環(huán)境條件限制、提取工藝簡單、有利于工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)，逐漸受到國內(nèi)外普遍重視。
[0004]蛹蟲草(cordycepes militaris)又稱北蟲草、北冬蟲夏草,是真菌寄生于鱗翅目等昆蟲的蟲體上形成的蟲菌復(fù)合體，是一種具有滋補(bǔ)作用的重要和營養(yǎng)品。蛹蟲草具有抗腫瘤、抗炎等多種藥力功效，它已經(jīng)在東亞地區(qū)被廣泛作為滋補(bǔ)品及藥用菌使用，我國衛(wèi)生部于2009年3月16日正式將其列為新資源食品。采用蛹蟲草生產(chǎn)類胡蘿卜素的研究較少，其中，已有的采用蛹蟲草進(jìn)行液體靜置發(fā)酵，收集發(fā)酵液液面上的菌絲用乙醇進(jìn)行提取，存在發(fā)酵時(shí)間長、菌絲體得率和類胡蘿卜素提取率偏低等缺點(diǎn)；已有的將蛹蟲草進(jìn)行固體培養(yǎng)，收集培養(yǎng)后所得蛹蟲草子實(shí)體、菌絲體或培養(yǎng)基殘?jiān)?，破壁后用丙酮、甲醇和乙醇中至少一種有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，存在培養(yǎng)時(shí)間長耗能大、提取次數(shù)多造成成本上升以及類胡蘿卜素的提取率不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供蛹蟲草種子培養(yǎng)基、蛹蟲草生長培養(yǎng)基以及一種高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，以解決上述的問題。
[0006]在本發(fā)明的實(shí)施例中提供了一種半合成改良沙氏培養(yǎng)基，按重量份計(jì)，包括以下成分:麥芽糖3-8份、葡萄糖15-25份、蛋白胨5-15份、酵母膏3_8份、大米粉30-60份、水800-1200 份。
[0007]進(jìn)一步地，所述半合成改良沙氏培養(yǎng)基還包括質(zhì)量百分比為1.5-3%的瓊脂粉。
[0008]本發(fā)明實(shí)施例中還提供了一種發(fā)酵培養(yǎng)基，按重量份計(jì)，包括以下成分:大米粉25-35份、玉米粉或苦蕎粉40-50份、亮氨酸0.3-0.5份、磷酸二氫鉀0.05-0.2份、氯化鉀
0.01-0.1 份、硫酸鎂 0.01-0.1 份、硫酸亞鐵 0.001-0.003 份、水 80-120 份。
[0009] 一種高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，包括以下步驟:[0010](a)將蛹蟲草進(jìn)行活化培養(yǎng)，制得孢子懸液；
[0011](b)將所述孢子懸液接種于權(quán)利要求1所述的半合成改良沙氏培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到種子液；
[0012](c)將所述種子液接種于權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到蛹蟲草培養(yǎng)物；
[0013](d)對所述蛹蟲草培養(yǎng)物進(jìn)行類胡蘿卜素的提取。
[0014]優(yōu)選地,在所述步驟(b)中，所述孢子懸液的濃度為1-5X 108cfu/ml,所述孢子懸液以體積百分?jǐn)?shù)為5-10%進(jìn)行接種。
[0015]優(yōu)選地，在所述步驟(b)中，所述培養(yǎng)為:培養(yǎng)溫度20-30°C，轉(zhuǎn)速200-250rpm/min,避光培養(yǎng)。
[0016]優(yōu)選地，在所述步驟(b)中，培養(yǎng)60_80h，得到所述種子液。
[0017]優(yōu)選地，在所述步驟(C)中，所述種子液以體積百分?jǐn)?shù)為8-10%進(jìn)行接種。
[0018]優(yōu)選地，在所述步驟(C)中，所述培養(yǎng)為25 ±3 °C避光培養(yǎng)3-5天；然后23 ±3 °C光照培養(yǎng)6-8天，光照強(qiáng)度為250-300Lux，每天光照12_14h，每2天搖瓶I次。
[0019]優(yōu)選地,所述步驟(d)具體為:
[0020]將所述蛹蟲草培養(yǎng)物烘干，每克烘干的蛹蟲草培養(yǎng)物加入0.8-1.2mol/L鹽酸8-12ml室溫浸泡40-60min，沸水浴3_5min后置于冰上冷卻，3500-5000rpm/min離心
5-15min，棄上清，沉淀用蒸餾水洗滌1_2次，離心；
[0021]將離心后的沉淀加入18-22ml丙酮,室溫下以80-100rpm/min振蕩4_6h得到類胡
蘿卜素浸提液；
[0022]將所述類胡蘿卜素浸提液3500-5000rpm/min離心10_20min，收集上清液，將所述上清液于35-45°C真空濃縮除去丙酮，得到類胡蘿卜素。
[0023]本發(fā)明實(shí)施例提供的高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，將孢子懸液接種于本發(fā)明提供的半合成改良沙氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液，將種子液接種于本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間較短，將得到的蛹蟲草培養(yǎng)物提取類胡蘿卜素，提取次數(shù)少，且提取得率穩(wěn)定，得到的類胡蘿卜素的產(chǎn)量高。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面通過具體的實(shí)施例子對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0025]本發(fā)明實(shí)施例提供的半合成改良沙氏培養(yǎng)基，按重量份計(jì)，包括以下成分:麥芽糖3-8份、葡萄糖15-25份、蛋白胨5-15份、酵母膏3_8份、大米粉30-60份、水800-1200份。
[0026]進(jìn)一步地，按重量份計(jì)，所述半合成改良沙氏培養(yǎng)基包括以下成分:麥芽糖4-6份，葡萄糖18-22份，蛋白胨8-12份，酵母膏4-6份，大米粉40-50份，水900-1100份。
[0027]其中，上述的大米粉粒度為優(yōu)選地,大米粉粒度為2-3_。
[0028]得到的半合成改良沙氏培養(yǎng)基營養(yǎng)全面，培養(yǎng)基成分濃度及配比合適；將蛹蟲草的孢子懸液接種至本培養(yǎng)基，用蛹蟲草菌體生長快速，孢子數(shù)擴(kuò)增快，得到的種子液菌體含量聞，且菌體的生長旺盛。
[0029]進(jìn)一步地，所述半合成改良沙氏培養(yǎng)基還包括質(zhì)量百分比為1.5-3%的瓊脂粉。加入質(zhì)量百分比為1.5-3%的瓊脂粉，經(jīng)高溫高壓滅菌后，得到固態(tài)的半合成改良沙氏培養(yǎng)基。
[0030]本發(fā)明實(shí)施例中還提供了一種發(fā)酵培養(yǎng)基，按重量份計(jì)，包括以下成分:大米粉25-35份、玉米粉或苦蕎粉40-50份、亮氨酸0.3-0.5份、磷酸二氫鉀0.05-0.2份、氯化鉀
0.01-0.1 份、硫酸鎂 0.01-0.1 份、硫酸亞鐵 0.001-0.003 份、水 80-120 份。
[0031]進(jìn)一步地，按重量份計(jì)，包括以下成分:大米粉28-32份、玉米粉或苦蕎粉43-47份、亮氨酸0.3-0.5份、磷酸二氫鉀0.05-0.1份、氯化鉀0.03-0.08份、硫酸鎂0.03-0.08份、硫酸亞鐵0.001-0.002份、水90-110份。
[0032]其中，上述的大米粉、玉米粉以及苦蕎粉的粒度均為l_4mm，優(yōu)選地，所述大米粉、玉米粉以及苦蕎粉的粒度均為2-3mm。
[0033]得到的發(fā)酵培養(yǎng)基呈半固態(tài)，其營養(yǎng)全面，培養(yǎng)基成分濃度及配比合適；將蛹蟲草的種子液接種至本培養(yǎng)基，菌體生長旺盛，節(jié)約菌體的發(fā)酵周期。
[0034]其中，分別將半合成改良沙氏培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基各自含有的成分稱取后混合，均采用高溫高壓滅菌，具體為121°C，滅菌20-30min，滅菌后冷卻至室溫，得到可直接用于培養(yǎng)菌株的培養(yǎng)基，滅菌后各物質(zhì)成分分布均一。
[0035]一種高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0036](a)將蛹蟲草進(jìn)行活化培養(yǎng)，制得孢子懸液；
[0037](b)將所述孢子懸液接種于權(quán)利要求1所述的半合成改良沙氏培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到種子液；
[0038](c)將所述種子液接種于權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到蛹蟲草培養(yǎng)物；
[0039](d)對所述蛹蟲草培養(yǎng)物進(jìn)行類胡蘿卜素的提取。
[0040]蛹蟲草購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CICC14013。采用本發(fā)明提供的半合成改良沙氏培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行蛹蟲草的培養(yǎng)，培養(yǎng)方法簡單，培養(yǎng)周期短，成本低，得到的蛹蟲草類胡蘿卜素含量高，且得到的蛹蟲草培養(yǎng)物無其他雜質(zhì)，防止了其他物質(zhì)對提取物的污染。
[0041]在所述步驟(a)中，蛹蟲草活化培養(yǎng)采用沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基，沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基成分為:麥芽糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、瓊脂20g、葡萄糖20g、水1000ml，將沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基成分稱取后于121°C，滅菌20-30min，冷卻即得沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基。將蛹蟲草菌株接種于沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基上活化，培養(yǎng)溫度25±2°C，避光培養(yǎng)7天。將沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基上用含有體積百分?jǐn)?shù)為0.04-0.06%的吐溫80的無菌水洗下菌體，混合得到孢子懸液。
[0042] 優(yōu)選地,在所述步驟(b)中，所述孢子懸液的濃度為1-5X 108cfu/ml，所述孢子懸液以體積百分?jǐn)?shù)為5-10%進(jìn)行接種。孢子懸液制成濃度為1-5X 108cfu/ml，以5-10%的體積百分比進(jìn)行接種，生長速度快，節(jié)約培養(yǎng)時(shí)間。
[0043]優(yōu)選地，在所述步驟(b)中，所述培養(yǎng)為:培養(yǎng)溫度20_30°C，轉(zhuǎn)速200-250rpm/min,避光培養(yǎng)。經(jīng)驗(yàn)證,培養(yǎng)溫度為20-30°C,蛹蟲草在半合成改良沙氏培養(yǎng)基中生長快速；轉(zhuǎn)速200-250rpm/min,在不損害蛹蟲草孢子的情況下,增加溶氧量，同時(shí)可以將半合成改良沙氏培養(yǎng)基混合均勻，利于孢子和菌絲體生長。
[0044]優(yōu)選地，在所述步驟(b)中，培養(yǎng)60_80h，得到所述種子液。得到的種子液菌體含量聞，且生長旺盛。
[0045]優(yōu)選地，在所述步驟(C)中，所述種子液以體積百分?jǐn)?shù)為8-10%進(jìn)行接種。以8-10%的體積百分?jǐn)?shù)進(jìn)行接種，得到的發(fā)酵液中含有足夠多的蛹蟲草菌體，其生長速度快，節(jié)約培養(yǎng)時(shí)間。
[0046]優(yōu)選地，在所述步驟(C)中，所述培養(yǎng)為25 ±3 °C避光培養(yǎng)3-5天；然后23 ±3 °C光照培養(yǎng)6-8天，光照強(qiáng)度為250-300LUX，每天光照12_14h，每2天搖瓶I次，這樣培養(yǎng)得到的類胡蘿卜素含量更高。
[0047]優(yōu)選地,所述步驟(d)具體為:
[0048]將所述蛹蟲草培養(yǎng)物烘干，每克烘干的蛹蟲草培養(yǎng)物加入0.8-1.2mol/L鹽酸8-12ml室溫浸泡40-60min，沸水浴3_5min后置于冰上冷卻，3500-5000rpm/min離心
5-15min，棄上清，沉淀用蒸餾水洗滌1_2次，離心；
[0049]將離心后的沉淀加入18-22ml丙酮,室溫下以80-100rpm/min振蕩4_6h得到類胡
蘿卜素浸提液；
[0050]將所述類胡蘿卜素浸提液3500-5000rpm/min離心10_20min，收集上清液，將所述上清液于35-45°C真空濃縮除去丙酮，得到類胡蘿卜素。將所述蛹蟲草培養(yǎng)物烘干采用55-65°C烘至含水量為5-7%。采用本方法提取類胡蘿卜素，提取方法簡單；采用丙酮提取一次，即可將蛹蟲草培養(yǎng)物中含有的幾乎全部類胡蘿卜素提取，得到的類胡蘿卜素的提取得率高，且提取得率穩(wěn)定。
[0051]本發(fā)明實(shí)施例提供的高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，將孢子懸液接種于本發(fā)明提供的半合成改良沙氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液，將種子液接種于本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間較短，將得到的蛹蟲草培養(yǎng)物提取類胡蘿卜素，提取次數(shù)少，且提取得率穩(wěn)定，得到的類胡蘿卜素的產(chǎn)量高。
[0052]實(shí)施例1
[0053]按重量份計(jì)，稱取以下成分:麥芽糖3份、葡萄糖15份、蛋白胨5份、酵母膏3份、大米粉30份、水800份；然后121°C，滅菌20min，滅菌后冷卻至室溫，得到半合成改良沙氏培養(yǎng)基，其中，大米粉粒度為
[0054]按重量份計(jì)，稱取以下成分:大米粉25份、玉米粉40份、亮氨酸0.3份、磷酸二氫鉀0.05份、氯化鉀0.01份、硫酸鎂0.01份、硫酸亞鐵0.001份、水80份；然后121°C，滅菌20min，滅菌后冷卻至室溫，得到發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，大米粉和玉米粉的粒度均為l-2mm ；
[0055]高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0056](a)將蛹蟲草接種在沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2°C，避光培養(yǎng)7天；將沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基上用含有體積百分?jǐn)?shù)為0.04%的吐溫80的無菌水洗下菌體，混合得到孢子懸液；其中，沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基成分為:麥芽糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、瓊脂20g、葡萄糖20g、水1000ml，將沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基成分稱取后于121°C，滅菌20min，冷卻即得沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基；
[0057](b)將孢子 懸液制成濃度為IX 108cfu/ml，然后以體積百分?jǐn)?shù)為7%接種至權(quán)利要求I所述的半合成改良沙氏培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)溫度20°C、轉(zhuǎn)速250rpm/min進(jìn)行避光培養(yǎng)，培養(yǎng)60h，得到種子液；
[0058](c)將種子液以體積百分?jǐn)?shù)為8%接種于權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25±3°C避光培養(yǎng)3天；然后23±3°C光照培養(yǎng)6天，光照強(qiáng)度為250Lux，每天光照12h，每2天搖瓶I次，得到蛹蟲草培養(yǎng)物；
[0059](d)將蛹蟲草培養(yǎng)物于55°C烘干至含水量為7%，每克烘干的蛹蟲草培養(yǎng)物加入0.8mol/L鹽酸12ml室溫浸泡40min,沸水浴3min后置于冰上冷卻，3500rpm/min離心15min,棄上清,沉淀用蒸懼水洗漆I次,離心；
[0060]將離心后的沉淀加入18ml丙酮，室溫下以80rpm/min振蕩6h得到類胡蘿卜素浸提液；
[0061]將類胡蘿卜素浸 提液3500rpm/min離心20min，收集上清液，將上清液于35°C真空濃縮除去丙酮，得到呈鮮亮橙黃色的類胡蘿卜素，每克烘干的蛹蟲草培養(yǎng)物得到類胡蘿卜素 1500 μ go
[0062]實(shí)施例2
[0063]按重量份計(jì)，稱取以下成分:麥芽糖4份、葡萄糖18份、蛋白胨8份、酵母膏4份、大米粉40份、水900份；然后121°C，滅菌25min，滅菌后冷卻至室溫，得到半合成改良沙氏培養(yǎng)基，其中，大米粉粒度為2mm ；
[0064]按重量份計(jì)，稱取以下成分:大米粉28份、苦蕎粉43份、亮氨酸0.4份、磷酸二氫鉀0.1份、氯化鉀0.03份、硫酸鎂0.03份、硫酸亞鐵0.002份、水90份；然后121°C，滅菌25min，滅菌后冷卻至室溫，得到發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，大米粉和苦蕎粉的粒度均為2mm ；
[0065]高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0066](a)將蛹蟲草接種在沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2°C，避光培養(yǎng)7天；將沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基上用含有體積百分?jǐn)?shù)為0.05%的吐溫80的無菌水洗下菌體，混合得到孢子懸液；其中，沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基成分為:麥芽糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、瓊脂20g、葡萄糖20g、水1000ml，將沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基成分稱取后于121°C，滅菌25min，冷卻即得沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基；
[0067](b)將孢子懸液制成濃度為2 X 108cfu/ml，然后以體積百分?jǐn)?shù)為5%接種至權(quán)利要求I所述的半合成改良沙氏培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)溫度25°C、轉(zhuǎn)速230rpm/min進(jìn)行避光培養(yǎng)，培養(yǎng)70h，得到種子液；
[0068](c)將種子液以體積百分?jǐn)?shù)為9%接種于權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25±3°C避光培養(yǎng)5天；然后23±3°C光照培養(yǎng)8天，光照強(qiáng)度為270Lux，每天光照14h，每2天搖瓶I次，得到蛹蟲草培養(yǎng)物；
[0069](d)將蛹蟲草培養(yǎng)物于60°C烘干至含水量為6%，每克烘干的蛹蟲草培養(yǎng)物加入lmol/L鹽酸IOml室溫浸泡50min,沸水浴4min后置于冰上冷卻，4000rpm/min離心10min,棄上清，沉淀用蒸餾水洗滌2次，離心；
[0070]將離心后的沉淀加入20ml丙酮，室溫下以90rpm/min振蕩4h得到類胡蘿卜素浸提液；
[0071]將類胡蘿卜素浸提液4000rpm/min離心15min，收集上清液，將上清液于40°C真空濃縮除去丙酮，得到呈鮮亮橙黃色的類胡蘿卜素，每克烘干的蛹蟲草培養(yǎng)物得到類胡蘿卜素 2000 μ go
[0072]實(shí)施例3
[0073]按重量份計(jì)，稱取以下成分:麥芽糖6份、葡萄糖22份、蛋白胨12份、酵母膏6份、大米粉50份、水1100份；然后121 °C，滅菌30min，滅菌后冷卻至室溫，得到半合成改良沙氏培養(yǎng)基，其中，大米粉粒度為3mm ；
[0074]按重量份計(jì)，稱取以下成分:大米粉32份、玉米粉47份、亮氨酸0.5份、磷酸二氫鉀0.2份、氯化鉀0.08份、硫酸鎂0.08份、硫酸亞鐵0.003份、水110份；然后121°C，滅菌30min，滅菌后冷卻至室溫，得到發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，大米粉和玉米粉的粒度均為3mm ；
[0075]高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0076](a)將蛹蟲草接種在沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2°C，避光培養(yǎng)7天；將沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基上用含有體積百分?jǐn)?shù)為0.06%的吐溫80的無菌水洗下菌體，混合得到孢子懸液；其中，沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基成分為:麥芽糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、瓊脂20g、葡萄糖20g、水1000ml，將沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基成分稱取后于121°C，滅菌30min，冷卻即得沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基；
[0077](b)將孢子懸液制成濃度為4X 108cfu/ml，然后以體積百分?jǐn)?shù)為10%接種至權(quán)利要求I所述的半合成改良沙氏培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)溫度30°C、轉(zhuǎn)速200rpm/min進(jìn)行避光培養(yǎng)，培養(yǎng)60h，得到種子液；
[0078](c)將種子液以體積百分?jǐn)?shù)為10%接種于權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25±3°C避光培養(yǎng)5天；然后23±3°C光照培養(yǎng)8天，光照強(qiáng)度為300Lux，每天光照12h，每2天搖瓶I次，得到蛹蟲草培養(yǎng)物；
[0079](d)將蛹蟲草培養(yǎng)物于65°C烘干至含水量為5%，每克烘干的蛹蟲草培養(yǎng)物加入
1.2mol/L鹽酸12ml室溫浸泡60min,沸水浴5min后置于冰上冷卻，5000rpm/min離心5min,棄上清，沉淀用蒸餾水洗滌2次，離心；
[0080]將離心后的沉淀加入22ml丙酮，室溫下以100rpm/min振蕩4h得到類胡蘿卜素浸提液；
[0081]將所述類胡蘿卜素浸提液5000rpm/min離心10min,收集上清液,將所述上清液于45°C真空濃縮除去丙酮，得到呈鮮亮橙黃色的類胡蘿卜素，每克烘干的蛹蟲草培養(yǎng)物得到類胡蘿卜素1800 μ go
[0082]實(shí)施例4
[0083]按重量份計(jì)，稱取以下成分:麥芽糖8份、葡萄糖25份、蛋白胨15份、酵母膏8份、大米粉60份、水1200份；然后121 °C，滅菌30min，滅菌后冷卻至室溫，得到半合成改良沙氏培養(yǎng)基，其中，大米粉粒度為4mm ；
[0084]按重量份計(jì)，稱取以下成分:大米粉35份、苦蕎粉50份、亮氨酸0.5份、磷酸二氫鉀0.2份、氯化鉀0.1份、硫酸鎂0.1份、硫酸亞鐵0.003份、水120份；然后121°C，滅菌30min，滅菌后冷卻至室溫，得到發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，大米粉和苦蕎粉的粒度均為4_ ；
[0085]高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0086] (a)將蛹蟲草接種在沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2°C，避光培養(yǎng)7天；將沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基上用含有體積百分?jǐn)?shù)為0.06%的吐溫80的無菌水洗下菌體，混合得到孢子懸液；其中，沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基成分為:麥芽糖5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、瓊脂20g、葡萄糖20g、水1000ml，將沙氏瓊脂改良培養(yǎng)基成分稱取后于121°C，滅菌30min，冷卻即得沙氏瓊脂改良固體培養(yǎng)基；
[0087](b)將孢子懸液制成濃度為5X 108cfu/ml,然后以體積百分?jǐn)?shù)為10%接種至權(quán)利要求I所述的半合成改良沙氏培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)溫度30°c、轉(zhuǎn)速250rpm/min進(jìn)行避光培養(yǎng)，培養(yǎng)80h，得到種子液；
[0088](c)將種子液以體積百分?jǐn)?shù)為10%接種于權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25±3°C避光培養(yǎng)3天；然后23±3°C光照培養(yǎng)6天，光照強(qiáng)度為300LUX，每天光照12h，每2天搖瓶I次，得到蛹蟲草培養(yǎng)物；
[0089](d)將蛹蟲草培養(yǎng)物于60°C烘干至含水量為6%，每克烘干的蛹蟲草培養(yǎng)物加入1.0mol/L鹽酸IOml室溫浸泡60min,沸水浴5min后置于冰上冷卻，4500rpm/min離心15min，棄上清，沉淀用蒸餾水洗滌2次，離心；
[0090]將離心后的沉淀加入22ml丙酮，室溫下以100rpm/min振蕩6h得到類胡蘿卜素浸提液；
[0091]將所述類胡蘿卜素浸提液4500rpm/min離心20min，收集上清液，將所述上清液于40°C真空濃縮除去丙酮，得到呈鮮亮橙黃色的類胡蘿卜素，每克烘干的蛹蟲草培養(yǎng)物得到類胡蘿卜素1900 μ go
[0092]本發(fā)明實(shí)施例提供的高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，將孢子懸液接種于本發(fā)明提供的半合成改良沙氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液，將種子液接種于本發(fā)明提供的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間較短，將得到的蛹蟲草培養(yǎng)物提取類胡蘿卜素，提取I次，得到的蛹蟲草類胡蘿卜素呈鮮亮橙黃色，每克干蛹蟲草培養(yǎng)物得到類胡蘿卜素1500-2000 μ g，提取得率高，且提取得率穩(wěn)定。
[0093] 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種半合成改良沙氏培養(yǎng)基,其特征在于,按重量份計(jì),包括以下成分:麥芽糖3-8份、葡萄糖15-25份、蛋白胨5-15份、酵母膏3-8份、大米粉30-60份、水800-1200份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的半合成改良沙氏培養(yǎng)基，其特征在于，還包括質(zhì)量百分比為1.5-3%的瓊脂粉。
3.一種發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，按重量份計(jì)，包括以下成分:大米粉25-35份、玉米粉或苦蕎粉40-50份、亮氨酸0.3-0.5份、磷酸二氫鉀0.05-0.2份、氯化鉀0.01-0.1份、硫酸鎂 0.01-0.1 份、硫酸亞鐵 0.001-0.003 份、水 80-120 份。
4.一種高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: (a)將蛹蟲草進(jìn)行活化培養(yǎng)，制得孢子懸液； (b)將所述孢子懸液接種于權(quán)利要求1所述的半合成改良沙氏培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到種子液； (c)將所述種子液接種于權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到蛹蟲草培養(yǎng)物； (d)對所述蛹蟲草培養(yǎng)物進(jìn)行類胡蘿卜素的提取。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，其特征在于，在所述步驟(b)中，所述孢子懸液的濃度為l-5X108cfu/ml，所述孢子懸液以體積百分?jǐn)?shù)為5-10%進(jìn)行接種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，其特征在于，在所述步驟(b)中，所述培養(yǎng)為:培養(yǎng)溫度20-30°C，轉(zhuǎn)速200-250rpm/min，避光培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，其特征在于，在所述步驟(b)中，培養(yǎng)60-80h，得到所述種子液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，其特征在于，在所述步驟(c)中，所述種子液以體積百分?jǐn)?shù)為8-10%進(jìn)行接種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，其特征在于，在所述步驟(c)中，所述培養(yǎng)為25±3°C避光培養(yǎng)3-5天；然后23±3°C光照培養(yǎng)6_8天，光照強(qiáng)度為250-300Lux，每天光照12-14h，每2天搖瓶I次。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-9任一項(xiàng)所述的高產(chǎn)類胡蘿卜素蛹蟲草培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(d)具體為: 將所述蛹蟲草培養(yǎng)物烘干，每克烘干的蛹蟲草培養(yǎng)物加入0.8-1.2mol/L鹽酸8_12ml室溫浸泡40-60min，沸水浴3_5min后置于冰上冷卻，3500-5000rpm/min離心5_15min，棄上清，沉淀用蒸餾水洗滌1-2次，離心； 將離心后的沉淀加入18-22ml丙酮,室溫下以80-100rpm/min振蕩4_6h得到類胡蘿卜素浸提液； 將所述類胡蘿卜素浸提液3500-5000rpm/min離心10-20min，收集上清液，將所述上清液于35-45°C真空濃縮除去丙酮，得到類胡蘿卜素。
【文檔編號】C12R1/645GK104004815SQ201410234836
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】周禮紅, 丁旭 申請人:周禮紅