合理設計的細胞培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及合理設計的細胞培養(yǎng)基。該細胞培養(yǎng)基包含以下必需氨基酸：15.2mM?ARG、5.5mM?HIS、13.2mM?ILE、20.0mM?LEU、16.5mM?LYS、6.3mM?MET、12.5mM?PRO、15.7mM?THR、3.2mM?TRP、15.4mM?Val。使用本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基可以實現(xiàn)多肽的大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】合理設計的細胞培養(yǎng)基
[0001] 本申請為申請日2007年11月07日，申請?zhí)?00780041158. 1，名稱為"合理設計 的細胞培養(yǎng)基"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 相關申請奪叉參考案
[0003] 本申請案主張優(yōu)先于在2006年11月8號提出申請的美國臨時專利申請案第 60/858, 289號的權益，所述案件的內(nèi)容全部以引用的方式納入本文中。

【技術領域】
[0004] 本發(fā)明涉及合理地設計用于細胞培養(yǎng)物（例如，應用于多肽生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)物） 的細胞培養(yǎng)基的方法；用所揭示方法設計的細胞培養(yǎng)基；使用所述培養(yǎng)基產(chǎn)生大量相關多 肽（例如，抗體）的方法；使用本文所揭示方法和培養(yǎng)基產(chǎn)生的多肽；及含有所述多肽的醫(yī) 藥組合物。本發(fā)明特別可用于大規(guī)模細胞培養(yǎng)物。本文所揭示方法和組合物特別可用于在 分批、補料分批和灌注動物細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生大量多肽。

【背景技術】
[0005] 大部分生物技術產(chǎn)品（無論是在市場上有售或者只是在研發(fā)中）是蛋白治療劑； 因此，人們需要在細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生這些多肽。而且，經(jīng)常需要動物細胞（與（例如）細菌 細胞形成對照）的細胞機器產(chǎn)生許多形式的多肽治療劑（例如，糖基化蛋白或雜交瘤產(chǎn)生 的單克隆抗體（MAb))。因此，人們越來越需要優(yōu)化這些多肽在細胞培養(yǎng)物中且特別是在動 物細胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)生。
[0006] 與細菌細胞培養(yǎng)物相比，動物細胞培養(yǎng)物具有更低的生產(chǎn)速率且通常會產(chǎn)生更低 的產(chǎn)率。因此，大量研究集中在可優(yōu)化多肽產(chǎn)量的動物細胞培養(yǎng)條件上，即，支持高細胞密 度和高效價的條件。舉例來說，已確定將細胞培養(yǎng)基的葡萄糖濃度維持在低濃度下且在生 產(chǎn)階段中于約400至600m0sm摩爾滲透壓濃度下培養(yǎng)細胞會增加動物細胞培養(yǎng)物的重組蛋 白產(chǎn)量，其中在所有階段的培養(yǎng)也應在選定谷酰胺濃度（優(yōu)選地，介于約〇. 2至約2mM之 間）下進行。還確定了在補料分批過程中對動物細胞培養(yǎng)物限量補加葡萄糖可控制乳酸產(chǎn) 生而無需以恒定速率補加葡萄糖。此外，已知改良在大規(guī)模細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中的全部氨基 酸累積濃度、個別氨基酸濃度、及個別氨基酸彼此間（例如，谷酰胺與天冬酰胺）和個別氨 基酸與全部氨基酸間（例如，谷酰胺與全部氨基酸）的比率能夠在實質(zhì)上改善大規(guī)模多肽 生產(chǎn)。
[0007] 傳統(tǒng)上，對動物細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基研究集中在3種技術上：1)向起始培養(yǎng)基中 補加培養(yǎng)基組份及增加培養(yǎng)物補加頻率；2)對不同的培養(yǎng)基強度和不同的組份濃度應用 多因數(shù)設計；及3)分析條件（使用過的）培養(yǎng)基的氨基酸、維生素、及其它組份，并添加低 含量或耗盡的那些組份。這些方法通常使用細胞密度、存活率和效價響應作為優(yōu)化指標。
[0008] 然而，上述方法只是根據(jù)最后結果（即，細胞密度、存活率和效價）間接地檢測細 胞的營養(yǎng)素需求而非檢測并提供優(yōu)化蛋白生產(chǎn)的實際細胞營養(yǎng)素需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明涉及合理地設計用于（例如）應用于多肽生產(chǎn)的大規(guī)模細胞培養(yǎng)物的細 胞培養(yǎng)基（例如，大規(guī)模細胞培養(yǎng)基）的方法；用所揭示方法設計的細胞培養(yǎng)基（例如，大 規(guī)模細胞培養(yǎng)基）；使用所述培養(yǎng)基產(chǎn)生大量相關多肽（例如，抗體）的方法；使用本文所 揭示方法和培養(yǎng)基產(chǎn)生的多肽；及含有所述多肽的醫(yī)藥組合物。這些方法和組合物可用于 培養(yǎng)（例如，分批、補料分批和灌注培養(yǎng)）細胞。這些方法和組合物特別可用于大規(guī)模培養(yǎng) (例如，分批、補料分批及灌注培養(yǎng)）動物細胞，例如，哺乳動物細胞。
[0010] 本發(fā)明的合理設計的培養(yǎng)基含有用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸、用于細 胞維持的計算濃度的氨基酸、及納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸。
[0011] 在一個實施例中，本發(fā)明提供一種在細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生多肽的方法，所述方法 包含提供細胞培養(yǎng)物，所述細胞培養(yǎng)物包含細胞（包含編碼相關多肽的核酸）及期望細 胞培養(yǎng)基（包含用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸、用于細胞維持的計算濃度的氨 基酸、及納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸）；并將所述細胞培養(yǎng)物維持在可使所述相 關多肽表達的條件下。在一個本發(fā)明實施例中，所述期望細胞培養(yǎng)基包含依據(jù)等式A = [(M*X) + (N*P) + (Y*M*X) ] *F計算的經(jīng)基線調(diào)整氨基酸濃度A，其中X是每單位細胞群細胞群 所用氨基酸濃度，P是針對每單位多肽效價納入相關多肽中的氨基酸濃度，Μ是所述細胞培 養(yǎng)物的期望峰值細胞密度的乘數(shù)，Ν是相關多肽的期望濃度的乘數(shù)，Υ是細胞維持因數(shù)；且F 是基線因數(shù)。
[0012] 在另一實施例中，本發(fā)明提供一種在細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包 含提供細胞培養(yǎng)物，所述細胞培養(yǎng)物包含細胞，所述細胞包含編碼相關多肽的核酸；及起始 細胞培養(yǎng)基，其中所述起始細胞培養(yǎng)基的體積是期望細胞培養(yǎng)基體積的約60-99% ;對所述 細胞培養(yǎng)物提供補加細胞培養(yǎng)基，其中所述補加細胞培養(yǎng)基的體積是期望細胞培養(yǎng)基體積 的約1-40%，且其中所得期望細胞培養(yǎng)基包含用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基酸、用 于細胞維持的計算濃度的氨基酸、及納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸；并將所述細胞 培養(yǎng)物維持在可使所述相關多肽表達的條件下。在一個本發(fā)明實施例中，所得期望細胞培 養(yǎng)基具有依據(jù)等式A = [ (M*X) + (N*P) + (Y*M*X) ] *F計算的經(jīng)基線調(diào)整氨基酸濃度Α，其中 X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，P是針對每單位多肽效價納入相關多肽中的氨 基酸濃度，Μ是所述細胞培養(yǎng)物的期望峰值細胞密度的乘數(shù)，N是相關多肽的期望濃度的乘 數(shù)，Υ是細胞維持因數(shù)；且F是基線因數(shù)；并將所述細胞培養(yǎng)物維持在可使所述相關多肽表 達的條件下。在另一本發(fā)明實施例中，所述起始細胞培養(yǎng)基包含依據(jù)等式B= [A-(Z*V)]/ (IV)計算的濃度B的氨基酸，其中Z是補加細胞培養(yǎng)基的氨基酸濃度，且V是作為所述期望 細胞培養(yǎng)基體積一部分的補加培養(yǎng)基體積。在本文所揭示方法的另一實施例中，Y為〇至 約1. 5。在本文所揭示方法的又一實施例中，F(xiàn)為約1至約1. 5。在本文所揭示方法的再一 實施例中，Y為0至約1. 5且F為約1至約1. 5。
[0013] 在本文所揭示方法的一個實施例中，所述期望細胞培養(yǎng)基包含大于或等于約3mM 的酪氨酸。在本文所揭示方法的另一些實施例中，所述期望細胞培養(yǎng)基包含：介于約7mM與 約30mM之間的亮氨酸；介于約7mM與約30mM之間的賴氨酸；介于約7mM與約30mM之間的 蘇氨酸；介于約7mM與約30mM之間的脯氨酸；及/或介于約7mM與約30mM之間的纈氨酸。 在本文所揭示方法的再一實施例中，亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、脯氨酸和纈氨酸在期望細胞 培養(yǎng)基中的組合濃度是介于約35mM與約150mM之間。在又一實施例中，亮氨酸、賴氨酸、蘇 氨酸和纈氨酸在期望細胞培養(yǎng)基中的組合濃度是全部必需氨基酸在所述期望細胞培養(yǎng)基 中濃度的介于約60%與約80%之間。
[0014] 在本文所揭示方法的一個實施例中，必需氨基酸在期望細胞培養(yǎng)基中的組合濃度 是全部必需氨基酸在所述期望細胞培養(yǎng)基中濃度的介于約30%與約50%之間。在本文所 揭示方法的另一實施例中，氨基酸在所述期望細胞培養(yǎng)基中的濃度是介于約120mM與約 350mM之間。在本文所揭示方法的再一實施例中，將脯氨酸在細胞培養(yǎng)物中的濃度維持在大 于約ImM。在本文所揭示方法的又一實施例中，將脯氨酸在細胞培養(yǎng)物中的濃度維持在大于 約2mM。在生產(chǎn)多肽方法的一些實施例中，所述細胞培養(yǎng)物是大規(guī)模細胞培養(yǎng)物。在其它實 施例中，所述細胞是動物細胞。
[0015] 本發(fā)明的又一方面提供依據(jù)本文所揭示方法產(chǎn)生的多肽。本發(fā)明的另一方面提供 一種醫(yī)藥組合物，其包含依據(jù)本文所揭示方法產(chǎn)生的多肽及醫(yī)藥上可接受的載劑。
[0016] 本發(fā)明的又一方面提供一種細胞培養(yǎng)的方法，所述方法包含：提供細胞培養(yǎng)物，所 述細胞培養(yǎng)物包含：細胞及期望細胞培養(yǎng)基，所述期望細胞培養(yǎng)基包含用于細胞群細胞群 的計算濃度的氨基酸及用于細胞維持的計算濃度的氨基酸；并將所述細胞培養(yǎng)物維持在所 述細胞可于所述細胞培養(yǎng)物中生長和復制的條件下。在一個本發(fā)明實施例中，所述期望細 胞培養(yǎng)基包含依據(jù)等式A' =[(M*X) + (Y*M*X)]*F計算的經(jīng)基線調(diào)整氨基酸濃度A'，其中 X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，Μ是所述細胞培養(yǎng)物的期望峰值細胞密度的乘 數(shù)，Υ是細胞維持因數(shù)；且F是基線因數(shù)。在所述細胞培養(yǎng)方法的一些實施例中，所述細胞 培養(yǎng)物是大規(guī)模細胞培養(yǎng)物。在其它實施例中，所述細胞是動物細胞。
[0017] 本發(fā)明的又一方面提供細胞培養(yǎng)基，其包含介于約120mM與約350mM之間的氨基 酸總濃度。本發(fā)明的另一方面提供一種用于生產(chǎn)相關多肽的細胞培養(yǎng)基，其包含介于約 120mM與約350mM之間的氨基酸總濃度。
[0018] 本發(fā)明的另一方面提供一種用于生產(chǎn)相關多肽的細胞培養(yǎng)基，其包含用于細胞群 細胞群的計算濃度的氨基酸、用于細胞維持的計算濃度的氨基酸、及納入相關多肽中的計 算濃度的氨基酸。在一個本發(fā)明實施例中，用于生產(chǎn)相關多肽的細胞培養(yǎng)基包含依據(jù)等式 A = [ (M*X) + (N*P) + (Y*M*X) ] *F計算的經(jīng)基線調(diào)整的氨基酸濃度A，其中X是每單位細胞群 細胞群所用氨基酸濃度，P是針對每單位多肽效價納入相關多肽中的氨基酸濃度，Μ是所述 細胞培養(yǎng)物的期望峰值細胞密度的乘數(shù)，Ν是相關多肽的期望濃度的乘數(shù)，Υ是細胞維持因 數(shù)；且F是基線因數(shù)。
[0019] 本發(fā)明的再一方面提供一種細胞培養(yǎng)基，其包含依據(jù)等式Α'= [(M*X) + (Y*M*X) ] *F計算的經(jīng)基線調(diào)整氨基酸濃度Α'，其中X是每單位細胞群細胞群所用 氨基酸濃度，Μ是所述細胞培養(yǎng)物的期望峰值細胞密度的乘數(shù)，Y是細胞維持因數(shù)，且F是基 線因數(shù)。在一些實施例中，所述細胞培養(yǎng)基是大規(guī)模細胞培養(yǎng)基。在其它實施例中，所述細 胞培養(yǎng)基是動物細胞培養(yǎng)基。
[0020] 本發(fā)明的再一方面提供一種確定在可于細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生相關多肽的細胞培養(yǎng) 基中所用優(yōu)化氨基酸濃度的方法，所述方法包含：確定所述細胞在細胞培養(yǎng)物中于目標細 胞密度下形成細胞群細胞群所需氨基酸濃度；確定在細胞培養(yǎng)物中于目標多肽效價下產(chǎn)生 相關多肽所需氨基酸濃度；確定所述細胞在細胞培養(yǎng)物中的細胞維持所需氨基酸濃度；并 加合所述各濃度以提供在細胞培養(yǎng)物中可產(chǎn)生相關多肽的細胞培養(yǎng)基中所用優(yōu)化氨基酸 濃度。
[0021] 本發(fā)明的又一方面提供確定在可于細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生相關多肽的細胞培養(yǎng)基中 所用氨基酸的優(yōu)化氨基酸濃度A的方法，所述方法包含：確定所述細胞于設定細胞密度下 形成細胞群細胞群所需氨基酸濃度X ;確定于設定多肽效價下產(chǎn)生相關多肽所需氨基酸濃 度P ;及依據(jù)等式A = [ (M*X) + (N*P) + (M*Y*X) ] *F確定優(yōu)化氨基酸濃度A，其中Μ是所述細 胞培養(yǎng)物的期望目標細胞密度的乘數(shù)，Ν是相關多肽的期望目標濃度的乘數(shù)，Υ是細胞維持 因數(shù)；且F是基線因數(shù)。在確定優(yōu)化氨基酸濃度的方法的一些實施例中，所述細胞培養(yǎng)物是 大規(guī)模細胞培養(yǎng)物。在其它實施例中，所述細胞是動物細胞。
[0022] 從下述【具體實施方式】和上述權利要求書可明了本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1描繪經(jīng)改造可表達抗-IL-22的CH0細胞的細胞密度（Υ軸；"細胞密度（106個 細胞/mL)"）隨時間（X軸；"天數(shù)"）的變化。在實例2的合理設計的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。
[0024] 圖2描繪經(jīng)改造可表達抗-IL-22的CH0細胞的抗-IL-22抗體效價（Y軸；"效價 (g/L)"）隨時間（X軸；"天數(shù)"）的變化。在實例2的合理設計的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。
[0025] 圖3描繪經(jīng)改造可表達抗-IL-22的CH0細胞的細胞密度（Y軸；"細胞密度（106個 細胞/mL)"）隨時間（X軸；"天數(shù)"）的變化。在實例3的合理設計的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。
[0026] 圖4描繪經(jīng)改造可表達抗-IL-22的CH0細胞的抗-IL-22抗體效價（Y軸；"效價 (g/L)"）隨時間（X軸；"天數(shù)"）的變化.在實例3的合理設計的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。
[0027] 圖5描繪經(jīng)改造可表達抗-IL-22的CH0細胞的抗-IL-22抗體效價（Y軸；"效價 (g/L)"）隨時間（X軸；"天數(shù)"）的變化。在"傳統(tǒng)培養(yǎng)基"（一種基于傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)物要求 的培養(yǎng)基，參見，例如，美國公開專利申請案第2006/0121568號）、使用本文方法制備的"合 理設計的培養(yǎng)基"、或含有額外添加至"傳統(tǒng)培養(yǎng)基"中的3. 7mM脯氨酸的"傳統(tǒng)培養(yǎng)基+脯 氨酸"中培養(yǎng)細胞（參見實例4)。
[0028] 圖6描繪經(jīng)改造可表達抗-IL-22的CH0細胞的細胞密度（Y軸；"細胞密度（106 個細胞/mL)"隨時間（X軸；"天數(shù)"）的變化。在"傳統(tǒng)培養(yǎng)基"、"合理設計的培養(yǎng)基"、或 "傳統(tǒng)培養(yǎng)基+脯氨酸"中培養(yǎng)細胞（參見實例4)。
[0029] 圖7描繪經(jīng)改造可表達抗-IL-22的CH0細胞的細胞存活率（Y軸；"存活率[% ] "） 隨時間（X軸；"天數(shù)"）的變化。在"傳統(tǒng)培養(yǎng)基"、"合理設計的培養(yǎng)基"、或"傳統(tǒng)培養(yǎng)基+ 脯氨酸"中培養(yǎng)細胞（參見實例4)。
[0030] 圖8描繪細胞經(jīng)改造可表達抗-IL-22的CH0細胞的指定氨基酸（（圖8A)脯氨 酸；（圖8B)蘇氨酸；（圖8C)纈氨酸；（圖8D)色氨酸；或（圖8E)酪氨酸）濃度（Y軸； "[μΜ]""）隨時間（X軸；"天數(shù)"）的變化。在"傳統(tǒng)培養(yǎng)基"、"合理設計的培養(yǎng)基"、或"傳 統(tǒng)培養(yǎng)基+脯氨酸"中培養(yǎng)細胞（參見實例4)。
[0031] 圖9描繪經(jīng)改造可表達抗-IL-22的CH0細胞的細胞密度（Υ軸；"細胞密度（106 個細胞/mL)"）隨時間（X軸；"天數(shù)"）的變化。在"合理設計的培養(yǎng)基"或"不涉及維持因 數(shù)和基線因數(shù)的合理設計的培養(yǎng)基"中培養(yǎng)細胞。所述圖是5個獨立同樣試驗（η = 5)的 代表圖（參見實例6)。
[0032] 圖10描繪經(jīng)改造可表達抗-IL-22的CH0細胞的細胞存活率（Y軸："存活率 (%)"）隨時間（X軸；"天數(shù)"）的變化。在"合理設計的培養(yǎng)基"或"不涉及維持因數(shù)和基 線因數(shù)的合理設計的培養(yǎng)基"中培養(yǎng)細胞。所述圖是5個獨立同樣試驗（η = 5)的代表圖 (參見實例6)。
[0033] 圖11描繪經(jīng)改造可表達抗-IL-22的CH0細胞的抗體效價（Υ軸；"效價（g/L) "） 隨時間（X軸；"天數(shù)"）的變化。在"合理設計的培養(yǎng)基"或"不涉及維持因數(shù)和基線因數(shù)的 合理設計的培養(yǎng)基"中培養(yǎng)細胞。所述圖是5個獨立同樣試驗（η = 5)的代表圖（參見實 例6)。

【具體實施方式】
[0034] 如本文所用術語"分批培養(yǎng)"是指一種培養(yǎng)細胞的方法，其中在所述培養(yǎng)過程開始 時提供最終會用于培養(yǎng)所述細胞的所有組份，包含所述培養(yǎng)基以及細胞本身。通常在某個 時刻停止分批培養(yǎng)并收獲及（視需要）純化所述培養(yǎng)基中的細胞及/或組份。
[0035] 如本文所用術語"補料分批培養(yǎng)"是指一種培養(yǎng)細胞的方法，其中在所述培養(yǎng)過程 開始后的某個時刻對所述培養(yǎng)物提供額外的組份。所提供組份通常包含在所述培養(yǎng)過程中 耗盡了的細胞營養(yǎng)補劑。通常在某個時刻停止補料分批培養(yǎng)并收獲及（視需要）純化所述 培養(yǎng)基中的細胞及/或組份。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，所述細胞培養(yǎng)是動物細胞培養(yǎng)（例 如，哺乳動物細胞培養(yǎng)），其為分批培養(yǎng)或補料分批培養(yǎng)。
[0036] 如本文所用術語"灌注培養(yǎng)"是指一種培養(yǎng)細胞的方法，其中在所述培養(yǎng)過程開始 后以連續(xù)方式或半連續(xù)方式對所述培養(yǎng)物提供額外組份。所提供組份通常包含在所述培養(yǎng) 過程中耗盡了的細胞營養(yǎng)補劑。所述培養(yǎng)基中的細胞及/或組份部分通常以連續(xù)或半連續(xù) 方式收獲并視需要經(jīng)純化。
[0037] 如本文所用術語"生物反應器"是指供原核細胞或真核細胞培養(yǎng)物（例如，動物細 胞培養(yǎng)物，例如，哺乳動物細胞培養(yǎng)物）生長所用任何容器。所述生物反應器可具有任一 大小，只要其可用于培養(yǎng)細胞，例如，哺乳動物細胞。通常，所述生物反應器可為至少30ml 且可為 1 升、10 升、100 升、250 升、500 升、1000 升、2500 升、5000 升、8000 升、10, 000 升、 12, 0000升或更大、或任一中間體積。在培養(yǎng)期間通常需控制所述生物反應器的內(nèi)部條件， 包括但不限于pH和溫度。所述生物反應器可由任何適用于在本發(fā)明培養(yǎng)條件下容納懸浮 于培養(yǎng)基中的哺乳動物細胞培養(yǎng)物的材料制成。如本文所用術語"生產(chǎn)型生物反應器"是 指在相關多肽或蛋白生產(chǎn)中所用最終生物反應器。大規(guī)模細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)型生物反應器的 體積一般大于約l〇〇ml，通常為至少約10升，且可為500升、1000升、2500升、5000升、8000 升、10, 000升、12, 0000升或更大、或任一中間體積。一名普通技術人員可認識到且能夠選 擇用于實踐本發(fā)明的適宜生物反應器。
[0038] 如本文所用術語"細胞密度"、"細胞濃度"或類似詞組是指存于給定體積培養(yǎng)基中 的細胞數(shù)目、重量、質(zhì)量等。"峰值細胞密度"或類似詞組是指在給定體積培養(yǎng)基中可達到的 最大細胞數(shù)目，且"期望峰值細胞密度"或類似詞組是指實踐人員期望在給定細胞體積中獲 得（例如，目標）的最大細胞數(shù)目。那些所屬領域的技術人員會明了所述目標值的變動，例 如，一名所屬領域的技術人員可以期望細胞群細胞群這一術語來表達目標值，且所述目標 值可以一個或多個適當?shù)亩攘繂挝唬ɡ纾谕逯导毎杭毎簡挝唬┯嫛?br> [0039] 如本文所用術語"細胞存活率"是指細胞在培養(yǎng)物中于一組給定培養(yǎng)條件或?qū)嶒?變動條件下生存的能力。所述如本文所用術語也指在特殊時間時活著的細胞占此時存于培 養(yǎng)物中細胞（活著的及死亡的）總數(shù)目的比例。
[0040] 如本文所用術語"培養(yǎng)物"和"細胞培養(yǎng)物"是指在適合細胞群體生存及/或生長 的條件下懸浮于細胞培養(yǎng)基中的細胞群體。如本文所用這些術語可指包含所述細胞群體 (例如，動物細胞培養(yǎng)物）與其中懸浮有所述群體的培養(yǎng)基的組合。
[0041] 如本文所用術語"整合活細胞密度"或"IVC"是指活細胞在培養(yǎng)過程中的平均密度 乘以培養(yǎng)進行的時間。假如所產(chǎn)生多肽量及/或蛋白量與在培養(yǎng)過程中所存在活細胞數(shù)目 成比例，則整合活細胞密度是評定在培養(yǎng)過程中所產(chǎn)生多肽量及/或蛋白量的有用工具。
[0042] 如本文所用術語"培養(yǎng)基（medium) "、"細胞培養(yǎng)基（cell culture medium) "、和 "培養(yǎng)基（culture medium)"是指含有為正在生長中動物（例如，哺乳動物）細胞提供養(yǎng)分 的營養(yǎng)素的溶液。通常，這些溶液提供所述細胞最小生長及/或生存所需要的必需和非必 需氨基酸、維生素、能量來源、脂質(zhì)及微量元素。所述溶液還可含有促進生長及/或生存（高 于最小速率）的組份，包括激素和生長因子。將所述溶液以優(yōu)選方式調(diào)配到最適合細胞生 存和增殖的pH和鹽濃度。在一個實施例中，所述培養(yǎng)基是確定成份培養(yǎng)基。確定成份培養(yǎng) 基是其中所有組份具有已知化學結構的培養(yǎng)基。在另一本發(fā)明實施例中，所述培養(yǎng)基可含 有源自所屬領域已知的任何來源或方法的氨基酸，包括但不限于源自單一氨基酸添加物或 源自蛋白胨或蛋白水解產(chǎn)物（包含動物或植物來源）添加物的氨基酸。
[0043] 如本文所用術語"接種"是指對生物反應器或另一容器提供細胞培養(yǎng)物的過程。所 述細胞可能先前已在另一生物反應器或容器中繁殖。另一選擇，所述細胞在將其提供給生 物反應器或容器之前（例如，即將提供給生物反應器或容器之前）經(jīng)冷凍和解凍。所述術 語是指許多細胞，包含單一細胞。
[0044] 如本文所用術語"效價"是指借助動物細胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的相關多肽的總量除以給 定培養(yǎng)基體積量；因此"效價"是指濃度。效價通常以毫克多肽/毫升培養(yǎng)基為單位表達。
[0045] 如本文所用術語"抗體"包括包含至少一個（且通常兩個）VH域或其部分及/或 至少一個（且通常兩個）VL域或其部分的蛋白。在某些實施例中，所述抗體是兩個免疫球 蛋白重鏈與兩個免疫球蛋白輕鏈的四聚體，其中所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈通過（例如） 二硫鍵相互連接。所述抗體或其一部分可從任何來源獲得，包括但不限于嚙齒類動物、靈長 類動物（例如，人類及非人類靈長類動物）、駱駝科動物等，或其可以重組方式產(chǎn)生，例如， 嵌合、人源化及/或活體外產(chǎn)生的，例如，通過那些所屬領域的技術人員熟知的方法獲得。
[0046] 涵蓋于術語"抗體的抗原-結合片段"中的結合片段的實例包括但不限于（i)Fab 片段，其是由VL、VH、CL及CH1域構成的單價片段；（ii)F(ab' )2片段，其是包含2個在鉸 鏈區(qū)中由二硫橋鍵連接的Fab片段的二價片段；（iii)由VH及CH1域構成的Fd片段；（iv) 由單臂抗體的VL和VH域構成的Fv片段；（v) dAb片段，其由VH域構成；（vi)駱駝科動物或 胳馬它科動物源化重鏈可變域（VHH) ;(vii)單鏈Fv(scFv ;參見下文）；(viii)雙重特異性抗 體；及（ix) -個或多個與Fc區(qū)融合的免疫球蛋白分子片段。此外，盡管Fv片段的兩個域 VL和VH通過不同基因編碼，但所述域可使用重組方法借助合成連接子來連接，所述合成連 接子能夠使其作為其中VL和VH區(qū)配對形成單價分子的蛋白單鏈（稱作單鏈Fv( SCFv))制 備；參見（例如）伯德（Bird)等人，（1988)科學（Science) 242 :423-26 ;休斯頓（Huston) 等人（1988)美國國家科學研究院學報（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.) 85 :5879-83)。所述 單鏈抗體還欲涵蓋于術語"抗體的抗原結合部分"中。可借助那些所屬【技術領域】人員已知 的習用技術獲得這些片段且以與完整抗體相同的方式評價有用的片段。
[0047] "抗原-結合片段"可視需要進一步包括可增強（例如）穩(wěn)定性、效應細胞功能或 補體結合中的一者或多者的部分。舉例來說，所述抗原結合片段可進一步包括聚乙二醇部 分、白蛋白、或重鏈及/或輕鏈恒定區(qū)。
[0048] 應理解，除"雙特異性"或"雙功能性"抗體外，抗體應理解為其各結合位點均為 相同的。"雙特異性抗體"或"雙功能性抗體"是一種具有2個不同重鏈/輕鏈配對及2個 不同結合位點的人工雜交抗體。雙特異性抗體可借助各種方法（包括融合雜交瘤或鏈接 Fab'片段）來產(chǎn)生。參見，例如，Songsivilai及拉赫曼（Lachmann)(1990)臨床與實驗 免疫學（Clin. Exp. Immunol.) 79 :315-21 ;克斯特尼（Kostelny)等人（1992)免疫學雜志 (J. Immunol.) 148 :1547-53。
[0049] 詞組"蛋白"或"蛋白產(chǎn)物"是指一種或多種氨基酸鏈。如本文所用術語"蛋白"與 "多肽"同義且如所屬領域通常所理解，是指通過順序肽鍵鏈接的至少一種氨基酸鏈。在某 些實施例中，"相關蛋白"或"相關多肽"是通過已轉化到宿主細胞中的外源核酸分子編碼的 蛋白。在某些實施例中，其中"相關蛋白"由用于轉化宿主細胞的外源DNA編碼，所述外源 DNA的核酸序列決定了氨基酸的序列。在某些實施例中，"相關蛋白"是一種通過宿主細胞 內(nèi)源性核酸分子編碼的蛋白。在某些實施例中，可通過用外源核酸分子轉染宿主細胞來改 變此相關內(nèi)源性蛋白的表達，所述外源核酸分子可（例如）含有一個或多個調(diào)控序列及/ 或編碼可增強相關蛋白表達的蛋白。本發(fā)明的方法和組合物可用于生產(chǎn)任何相關蛋白，包 括但不限于具有醫(yī)藥特性、診斷特性、農(nóng)用特性及/或可用于商業(yè)、實驗及/或其它應用中 各種其它特性的任一種特性的蛋白。另外，相關蛋白可為蛋白治療劑。即，蛋白治療劑是一 種對其在體內(nèi)的一個作用區(qū)域或?qū)ζ渫ㄟ^中間體遠程作用的一個身體區(qū)域具有生物效用 的蛋白。蛋白治療劑的實例更詳細地陳述于下文中。在某些實施例中，使用本發(fā)明方法及/ 或組合物產(chǎn)生的蛋白可經(jīng)加工及/或改良。舉例來說，可依據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的蛋白可經(jīng)糖基 化。
[0050] 本發(fā)明可用于培養(yǎng)細胞以有利地生產(chǎn)任何治療性蛋白，例如，醫(yī)藥上或商業(yè)上相 關酶、受體、抗體（例如，單克隆及/或多克隆抗體）、Fc融合蛋白、細胞因子、激素、調(diào)控因 子、生長因子、凝結/凝血因子、抗原結合因子等。一名普通技術人員應可認識到能夠依據(jù) 本發(fā)明生產(chǎn)的其它蛋白且應能夠使用本文所揭示方法來生產(chǎn)所述蛋白。
[0051] 重組宿主細胞的表達構建體和產(chǎn)生
[0052] 本發(fā)明使用重組宿主細胞，例如，原核或真核宿主細胞，S卩，經(jīng)含有編碼相關多肽 的核酸的表達構建體轉染的細胞。詞組"動物細胞"涵蓋無脊椎動物細胞、非哺乳動物脊 椎動物（例如，鳥類、爬行動物和兩棲動物）細胞、及哺乳動物細胞。無脊椎動物細胞的 非限制性實例包括下列昆蟲細胞：草地粘蟲（Spodopterafrugiperda)(毛蟲）、埃及伊蚊 (Aedes aegypti)(蚊蟲）、白紋伊蚊（Aedes albopictus)(蚊蟲）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster)(果蠅）、及家蠶（Bombyx mori)(桑蠶 / 蠶蛾）。
[0053] 許多哺乳動物細胞系是用于相關多肽重組表達的適宜宿主細胞。哺乳動物宿主細 胞系包括（例如）C0S、PER. C6、TM4、VER0076、MDCK、BRL-3A、W138、!fep G2、MMT、MRC5、FS4、 CH0、293T、A431、3T3、CV-1、C3H10T1/2、C〇1〇205、293、HeLa、L 細胞、BHK、HL-60、FRhL-2、 U937、HaK、Jurkat 細胞、1^^2、8&?3、320400?-1、？(：12、]\111、鼠科動物骨髓瘤（例如，5?2/0 及NSO)及C2C12細胞、以及經(jīng)轉化靈長類動物細胞系、雜交瘤、正常二倍體細胞、及源白原 代組織及原代細胞（primary explant)活體外培養(yǎng)的細胞株。能夠表達相關多肽的任何真 核細胞可用于所揭示培養(yǎng)基設計方法。許多細胞系可白商業(yè)來源獲得，例如，美國典型培養(yǎng) 物保藏中心（American Type Culture Collection) (ATCC)。在一個本發(fā)明實施例中，所述 細胞培養(yǎng)（例如，大規(guī)模細胞培養(yǎng)）采用雜交瘤細胞?？贵w產(chǎn)生雜交瘤細胞的構建為業(yè)內(nèi) 所熟知。在一個本發(fā)明實施例中，所述細胞培養(yǎng)（例如，大規(guī)模細胞培養(yǎng)）采用CH0細胞。
[0054] 另一選擇，可能在低級真核生物（例如，酵母菌）或在原核生物（例如，細菌）中 以重組方式產(chǎn)生相關多肽。適宜酵母菌株包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、 裂殖酵母菌（Schizosaccharomyces pombe)、克魯維酵母菌株（Kluyveromyces strains)、 念珠菌屬（Candida)、或能夠表達相關多肽的任何酵母菌株。適宜細菌株包括大腸桿菌 (Escherichia coli)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)、或能夠表達相關多肽的任何細菌株。在細菌中表達可形成納入所述重組蛋 白中的包涵體。因此，可能需要重組蛋白再折疊以產(chǎn)生活性或更具活性材料。若干從細菌 包涵體獲得經(jīng)恰當?shù)卣郫B的異源性蛋白的方法為所屬領域所知。這些方法通常涉及使所 述蛋白白所述包涵體溶解，隨后使用離液劑使所述蛋白完全變性。當在所述蛋白的基本氨 基酸序列中存在半胱氨酸殘基時，經(jīng)常必需在可恰當?shù)匦纬啥蜴I（氧化還原系統(tǒng)）的 環(huán)境中完成所述再折疊。再折疊的通用方法揭示于科諾（Kohno) (1990)酶學方法（Meth. Enzymol.) 185 :187-95,歐洲專利 EP 0433225 和美國專利第 5, 399, 677 號中。
[0055] 本發(fā)明使用由至少一種編碼相關多肽的聚核苷酸構成的構建體，其呈質(zhì)粒、載體、 及轉錄或表達盒形式。載體能夠引導以可操作方式與其鏈接的基因表達。所述載體在本文 中稱作"重組表達載體"或"表達載體"?？偟膩碚f，在重組DNA技術中可用表達載體經(jīng)常呈 質(zhì)粒形式。在本說明書中，"質(zhì)粒"和"載體"可互換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。然 而，本發(fā)明意欲包括具有等效功能的其它形式的表達載體，包括但不限于病毒載體（例如， 復制缺陷型反轉錄病毒、經(jīng)改造甲病毒（alphaviruses)、腺病毒及腺伴隨病毒）。
[0056] 適用于在動物細胞中蛋白表達的構建體為所屬領域所熟知。舉例來說，聚核苷酸 可以可操作方式鏈接到表達控制序列，例如，那些存于揭示于（例如）考夫曼（Kaufman) 等人（1991)核酸研究（Nuc. Acids Res.) 19 :4485-90中的pMT2或pED表達載體中的表 達控制序列。其它適宜表達控制序列可發(fā)現(xiàn)于所屬領域已知的載體中且包括但不限于： HaloTag? pHT2、pACT、pBIND、pCAT?3、pCI、phRG、phRL(普洛麥格公司（Promega)， 麥迪遜（Madison)，WI) ;pcDNA3. 1、pcDNA3. 1-E、pcDNA4/HisMAX、pcDNA4/HisMAX-E、 pcDNA3. 1/Hygro、pcDNA3. 1/Zeo、pZeoSV2、pRc/CMV2、pBudCE4pRc/RSV(英杰生命技術 公司（Invitrogen),卡爾斯巴德（Carlsbad), CA) ;pCMV_3Tag 載體、ρΓΜ V-Sn'i|il ⑧載 體、pCMV-Tag 載體、pSG5 載體（吉泰公司（Stratagene),拉由拉市（La Jolla)，CA); pDNR-Dual、pDNR-CMV(克隆泰公司（Clonetech)，帕洛阿爾托（Palo Alto)，CA);及 pSMEDA(惠氏公司（Wyeth)，麥迪遜，WI)。表達重組蛋白的通用方法也為人們所知且例示于 (例如）考夫曼（1990)酶學方法（Meth. Enzymol.) 185 :537-66 中。
[0057] 如本文所定義"以可操作方式鏈接"意指以酶促方式或以化學方式連接以在擬表 達聚核苷酸與表達控制序列之間以可通過轉染宿主細胞表達編碼蛋白的方式形成共價鍵。
[0058] 本發(fā)明的重組表達構建體可攜帶額外序列，例如，調(diào)控序列（例如，可調(diào)控載體復 制（例如，編碼相關多肽（或肽）的核酸序列的復制、轉錄起點）或所述編碼多肽表達的序 列）、標簽序列（例如，組氨酸）、及可選擇標記基因。術語"調(diào)控序列"意欲包括啟動子、增強 子及任何其它可控制轉錄、復制或轉譯的表達控制元件（例如，聚腺苷酸化信號、轉錄剪接 位點）。所述調(diào)控序列闡述于（例如）戈德爾（Goeddel)，基因表達技術（Gene Expression Technology):酶學方法（Methods in Enzymology)，學術出版社（Academic Press)，圣地亞 哥（San Diego)，CA(1990)中。那些所屬領域的技術人員應會意識到包括調(diào)控序列選擇在 內(nèi)的表達載體設計將取決于各種因素，包括宿主細胞的選擇和期望蛋白表達程度。供蛋白 在哺乳動物宿主細胞中表達的優(yōu)選調(diào)控序列包括針對高程度蛋白表達的病毒元件，例如， 源自FF-la啟動子和BGH poly A、巨細胞病毒（CMV)的啟動子及/或增強子（例如，CMV 啟動子/增強子）、源自猿病毒40(SV40)的啟動子及/或增強子（例如，SV40啟動子/增 強子）、源自腺病毒的啟動子及/或增強子（例如，腺病毒主要晚期啟動子（AdMLP))及源 自多瘤病毒的啟動子及/或增強子。病毒調(diào)控元件及其序列闡述于（例如）美國專利第 5, 168, 062號、第4, 510, 245號及第4, 968, 615號中，所有所述案件的全文均以引用的方式 納入本文中。
[0059] 可選擇或構建含有適當調(diào)控序列的適宜載體，所述調(diào)控序列包括啟動子序列、終 止子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因及其它序列，視情況而定。在所揭示方 法中還可使用通過使用具有誘導型啟動子序列的載體（例如，四環(huán)素誘導型載體，例如， pTet-〇n? 和 pTet-〇ff?(克隆泰（Clontech)，帕洛阿爾托（Palo Alto), CA))所實現(xiàn)的誘 導型蛋白表達。關于表達載體的其它詳情，參見，例如，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∕olecular Cloning :a Laboratory Manual)(第2版）薩姆布魯克（Sambrook)等人編寫，冷泉港實 驗室出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港（Cold Spring Harbor)， NY(1989)。關于核酸操控（例如，在制備核酸構建體、誘變、測序、將DNA導入細胞中、基因 表達、及蛋白分析中）的許多已知技術和方案還詳細地闡述于最新分子生物學實驗方法匯 編（Current Protocols in Molecular Biology)(第 2版）奧蘇貝爾（Ausubel)等人編寫， 約翰威利父子出版社（Wiley&Sons)，阿拉梅達（Alameda)，CA(1992)中。
[0060] 插入表達構建體以產(chǎn)生相關多肽的聚核苷酸可編碼任何能夠在細胞培養(yǎng)物中所 用宿主細胞中表達的多肽。因此，所述聚核苷酸可編碼全長基因產(chǎn)物、部分全長基因、肽、或 融合蛋白。所述聚核苷酸可由基因組DNA或CDNA構成且可源自任何動物。聚核苷酸可通 過所屬領域熟知的方法（例如，PCR或RT-PCR)從細胞或生物體分離或可通過已知習用化 學合成方法來生產(chǎn)。所述以化學方式合成的聚核苷酸可與天然聚核苷酸擁有若干同樣的生 物特性且因此可用作天然聚核苷酸的替代物。
[0061] 多肽還可通過在一種或多種昆蟲細胞表達載體（例如，桿狀病毒載體）中以可操 作方式鏈接所述編碼相關多肽的聚核苷酸與適宜控制序列并采用昆蟲細胞表達系統(tǒng)來以 重組方式產(chǎn)生。用于桿狀病毒/Sf9表達系統(tǒng)的材料和方法可以試劑盒形式自市場上購得 (例如，MAXBAC?試劑盒，英杰生命技術公司，卡爾斯巴德，CA)。
[0062] 可通過所屬領域熟知的許多方法來實現(xiàn)所述表達構建體對宿主細胞（例如，動物 細胞）的轉染。細胞可經(jīng)瞬時轉染或經(jīng)穩(wěn)定轉染。存在可用于將分子（特別是核酸）遞 送到宿主細胞（例如，動物細胞）中的若干不同的公認方法。隨細胞類型、期望轉染（即， 瞬時或穩(wěn)定）、及具體實驗要求（例如，不同細胞系或原發(fā)細胞的轉染、轉染分子類型（基 因組DNA、DNA、寡核苷酸）、或所選表達構建體）而定，各轉移方法具有那些所屬領域的 技術人員已知的優(yōu)點和缺點。常用轉染方法包括（例如）磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體介導的轉 染、DEAE葡聚糖介導的轉染、基因槍、電穿孔、納米粒子遞送、聚胺、附加體、及聚乙烯亞胺。 另外，許多轉染試劑盒和試劑可從諸如下述等公司購得：英杰生命技術公司（VOYAGER?， L1POFECT丨N? )、EMD 生命科學公司（EMD Biosciences)，圣地亞哥，CA(GENEJUICE?)、 起安捷（Qiagen)，杰曼鎮(zhèn)（Germantown), MD(SUPERFECT?)、奧比杰（Orbigen)，圣地亞哥， CA(SAPPHIRE?)，且許多其它轉染試劑盒和試劑為那些所屬領域的技術人員所知。轉染方 案還可發(fā)現(xiàn)于分子生物學的基本方法（Basic Methods in Molecular Biology)(第2版） Davis等人編寫，阿普頓朗格出版社（Appleton and Lange)，CT (1994)中。
[0063] 本發(fā)明使用細胞培養(yǎng)物（例如，大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)物）來產(chǎn)生大量相關 多肽。大規(guī)模瞬時轉染方法揭示于大規(guī)模哺乳動物細胞培養(yǎng)物技術（Large-scale Mammalian Cell Culture Technology)(生物技術和生物工藝系列（Biotechnology and Bioprocessing Series)), Lubiniecki 編寫，馬塞爾·德克爾出版社（Marcel Dekker), NY (1990) ;Kunaparaju 等人（2005)生物技術生物工程（Biotechnol.Bioeng. )91 :670-77 ; 米爾瑞拉（Maiorella)等人（1988)生物 / 技術（Bio/Technology)6 :1406-10 ;巴爾迪 (Baldi)等人，上述；蘭?范（Lan Pham)等人，上述；邁斯納（Meissner)等人，上述；杜羅 切（Durocher)等人，上述）。一般來說，哺乳動物細胞培養(yǎng)物的大規(guī)模瞬時基因表達可采用 若干類型常用轉染模式中的任一種（例如，聚乙烯亞胺、電場脈沖、CALFECTI0N?或磷酸鈣 沉淀）以在期望規(guī)?；蝮w積（例如，大于10升）下達成高轉染效率（德魯慈（Derouazi) 等人，上述；羅斯（Rols)等人（1992)歐洲生物化學雜志（Eur. J. Biochem.) 206 (1): 115-21 ;伍木和伯納德（Wurm and Bernard) (1999)生物技術新見（Curr. Opin. Biotechnol.) 10 (2) : 156-59 ;斯萊格和克里斯坦森（Schlaeger and Christensen) (1999)細胞技術（Cytotechnology) 30 (1-3) :71-83 ;喬丹（Jordan)等人（1998)細胞技術 (Cytotechnology) 26(1) :39-47 ;林德（Lindell)等人（2004)生物化學與生物物理學報 (Biochim. Biophys. Acta) 1676(2) :155-61)。這些大規(guī)模培養(yǎng)物一般是在具有攪拌板的生 物反應器、振蕩器或培養(yǎng)箱中生長，且還可稱作"旋動"或"懸浮"培養(yǎng)物。因此，與其中細 胞附著于板或燒瓶上的傳統(tǒng)轉染相反，所揭示方法一般使用懸浮培養(yǎng)物。大規(guī)模細胞培養(yǎng) 物一般視為具有大于約l〇〇ml體積的細胞培養(yǎng)物。
[0064] 在一些情形中，可能先產(chǎn)生表達相關多肽的細胞系且隨后使用所述細胞系接種大 規(guī)模細胞培養(yǎng)物。表達相關蛋白的穩(wěn)定細胞系可通過各種熟知的方法（包括用于本文所揭 示瞬時轉染的方法）來產(chǎn)生。一般來說，穩(wěn)定細胞系可通過在化學成份確定的培養(yǎng)基中長 期生長和選擇來產(chǎn)生。舉例來說，經(jīng)編碼相關多肽的核酸轉染（例如，通過磷酸鈣沉淀、或 脂質(zhì)體轉染）的細胞可伴隨經(jīng)攜帶新霉素抗性基因的載體轉染，此賦予對新霉素/遺傳霉 素的抗性（G418)。經(jīng)轉染細胞隨后在含有G418的培養(yǎng)基中生長且生存的細胞無性系地繁 殖擴大以產(chǎn)生穩(wěn)定表達的細胞系。此細胞系等份試樣隨后可用于接種大規(guī)模培養(yǎng)物并產(chǎn)生 大量相關蛋白。
[0065] 轉染細胞需要優(yōu)化若干變量，包括細胞接種密度（例如，約lxlO5個至約3xl0 6個 細胞/mL培養(yǎng)物）、血清濃度（例如，0-10% )、培育溫度（例如，約20-38°C )、轉染媒介或 試劑（化學或電）、培養(yǎng)體積（例如，約5ml-20升）、及培育時間（例如，約24-144小時）。 對于各細胞類型來說，最佳參數(shù)會有所變化。然而，對于利用選定宿主細胞轉染的特定細胞 類型，商業(yè)供應商一般會提供用于其轉染的優(yōu)化指導，如那些所屬領域的技術人員已知的 各種參考文獻所述。此等資料來源可用于指導所選宿主細胞的轉染，或可用作起始點，自所 述起始點可使用簡單的反復試驗來提供最佳轉染參數(shù)。
[0066] 細胞培養(yǎng)物
[0067] 生產(chǎn)相關多肽的典型程序包括分批培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)。在傳統(tǒng)上，分批培養(yǎng)過 程包括用特殊細胞密度的接種培養(yǎng)物接種大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)物，使所述細胞在有助于細胞生 長和存活的條件下生長，當所述細胞達到指定細胞密度時收獲所述培養(yǎng)物，并純化經(jīng)表達 多肽。補料分批培養(yǎng)程序包括如下額外步驟：用在所述細胞生長期間消耗的營養(yǎng)素和其它 組份補充分批培養(yǎng)物。一名普通技術人員應可意識到本發(fā)明可應用于任何可在其中培養(yǎng)細 胞的系統(tǒng)，包括但不限于分批系統(tǒng)、補料分批系統(tǒng)和灌注系統(tǒng)。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施例 中，使所述細胞在補料分批系統(tǒng)中生長。
[0068] 傳統(tǒng)培養(yǎng)（例如，分批培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)）的持久未解決的問題是代謝廢物的 產(chǎn)生，所述代謝廢物對細胞生長、存活和表達多肽產(chǎn)生具有不利作用。具有特別不利作用的 兩種代謝廢物是乳酸和銨，其分別是由于葡萄糖和谷酰胺代謝而產(chǎn)生的。除了由于谷酰胺 代謝而以酶促方式產(chǎn)生外，銨還會由于隨時間進行非代謝性降解而聚集于細胞培養(yǎng)物中。
[0069] 傳統(tǒng)培養(yǎng)基調(diào)配物（包括市售培養(yǎng)基，例如，Ham' s F10(西格瑪（Sigma))、 最低必需培養(yǎng)基（[MEM]，西格瑪）、RPMI-1640(西格瑪）和杜貝克氏改良鷹氏培養(yǎng)基 (Dulbeccc/ s Modified Eagle' s Medium) ([DMEM]，西格瑪））具有較高葡萄糖和谷醜胺 含量（后者是相對于其它氨基酸來說）。先前，據(jù)信，需要豐富的這些組份，這是因為所述組 份是細胞初級代謝的能量來源。然而，這些營養(yǎng)素迅速地被消耗，造成乳酸和銨聚集，如上 文所述。另外，葡萄糖和谷酰胺的初始高含量與乳酸和銨的后來聚集均會產(chǎn)生高摩爾滲透 壓濃度，此情況本身經(jīng)常會對細胞生長、細胞存活和多肽產(chǎn)生不利。本文所揭示合理設計的 培養(yǎng)基可經(jīng)改良以減少有害代謝產(chǎn)物的聚集。所述改良形式可發(fā)現(xiàn)于（例如）美國公開專 利申請案第2005/0070013號（限制葡萄糖補加）和第2006/0121568號（改良氨基酸含量 和比率）中，所述兩個案件的全文均以引用的方式納入本文中。
[0070] 合理的培養(yǎng)基設計和調(diào)配
[0071] 與本發(fā)明的培養(yǎng)基調(diào)配物相比，傳統(tǒng)培養(yǎng)基調(diào)配物以較低氨基酸總含量開始。舉 例來說，DME-F12(杜貝克氏改良鷹氏培養(yǎng)基與Han^ s F12培養(yǎng)基的50 : 50混合物）的總 氨基酸含量為7. 29mM且稱為RPMI-1640的傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)基的總氨基酸含量為6. 44mM(參 見，例如，莫頓（Morton) (1970)活體外（In Vitro) 6 :89-108 ;漢姆（Ham) (1965)美國國家 科學院學報（Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A.) 53 :288-93 ;穆爾（Moore)等人（1967)美國醫(yī)學 會期刊（J. Am. Medical Assn. ) 199 :519-24,所有參考文獻均以引用的方式納入本文中）。 最新培養(yǎng)基調(diào)配物（例如，揭示于美國公開專利申請案第2006/0121568號中的培養(yǎng)基）含 有更高濃度的氨基酸和營養(yǎng)素。然而，傳統(tǒng)調(diào)配物并非基于實際計算的細胞要求（其包括 細胞生長、細胞維持）和（對于用于生產(chǎn)重組多肽的細胞培養(yǎng)物來說）生產(chǎn)要求。使用本 文所提供這些變量是確定具有更高而且無毒性總氨基酸濃度的培養(yǎng)基調(diào)配物的方法。
[0072] 本文所述細胞培養(yǎng)基調(diào)配物（例如，大規(guī)模細胞培養(yǎng)基調(diào)配物）在依據(jù)（例如） 本文所述其它培養(yǎng)步驟及依據(jù)（例如）諸如那些發(fā)現(xiàn)于（例如）美國公開專利申請案第 2006/0121568號中的改良形式等改良形式使用時可優(yōu)化細胞密度和多肽效價。本文所述 培養(yǎng)基調(diào)配物的氨基酸濃度是基于1)細胞群細胞群；2)細胞維持；和3)多肽生產(chǎn)所需氨 基酸濃度。在一個本發(fā)明實施例中，細胞培養(yǎng)基含有用于細胞群細胞群的計算濃度的氨基 酸、用于細胞維持的計算濃度的氨基酸、及納入相關多肽中的計算濃度的氨基酸。在另一本 發(fā)明實施例中，細胞培養(yǎng)基含有通過等式A = [(M*X) + (N*P) + (Y*M*X)]*F表示的濃度A的 氨基酸，其中X是每單位細胞群細胞群所用氨基酸濃度，P是針對每單位多肽效價納入相關 多肽中的氨基酸濃度，Μ是期望細胞群細胞群（即，期望細胞群細胞群峰值單位）的乘數(shù)，N 是相關多肽的期望濃度（即，期望或目標多肽效價）的乘數(shù)，Υ是細胞維持因數(shù)；且F是基 線因數(shù)。
[0073] 在上述等式中針對每單位多肽效價納入相關多肽中的氨基酸濃度Ρ是基于重組 蛋白的一級結構，即，所述多肽的氨基酸含量。因此，Ρ將根據(jù)擬通過所述大規(guī)模細胞培養(yǎng) 生產(chǎn)的相關多肽而有所變化。隨后可使用相關多肽的期望濃度（即，期望或目標多肽效價） 的乘數(shù)Ν將Ρ轉化成對相關多肽目標濃度的氨基酸要求。在下文一些本發(fā)明代表性實例中， 多肽效價的基本單位是lg/L。在含有使用本文所提供等式所獲得代表性計算值的下文表1 中，在10g/L效價下相關多肽所需細胞培養(yǎng)基的氨基酸濃度（第4列）可通過在lg/L下所 需氨基酸濃度P(第2列）乘以乘數(shù)N來確定，其中N = 10。
[0074] 表1 :在期望細胞群細胞群下10g/L抗體目標效價所需經(jīng)基線調(diào)整氨基酸濃度的 代表性確定值，其中期望細胞群細胞群是通過15xl0 6個細胞/mL的期望峰值細胞密度來表 /_J、1 〇
[0075]

【權利要求】
1. 一種細胞培養(yǎng)基，其包含如下所列的必需氨基酸。
2. 如權利要求1所述的細胞培養(yǎng)基，其進一步包含大于或等于3mM的酪氨酸。
3. 如權利要求1或權利要求2所述的細胞培養(yǎng)基，其中亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、脯氨酸 和纈氨酸的組合濃度是全部必需氨基酸在所述細胞培養(yǎng)基中濃度的60%到80%之間。
4. 如權利要求1或權利要求2所述的細胞培養(yǎng)基，其中必需氨基酸的組合濃度是全部 氨基酸濃度的30%到50%之間。
5. 如權利要求1或權利要求2所述的細胞培養(yǎng)基，其包含介于120mM與350mM之間的 氨基酸總濃度。
6. -種在細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包含： (1) 提供細胞培養(yǎng)物，其包含： a. 細胞，所述細胞包含編碼相關多肽的核酸；及 b. 如權利要求1至5中任一權利要求所述的細胞培養(yǎng)基；和 (2) 將所述細胞培養(yǎng)物維持在可使所述相關多肽表達的條件下。
7. 如權利要求6所述的方法，其進一步包含自加載物流體回收經(jīng)純化多肽的方法，所 述回收方法包含如下步驟： 使所述加載物流體在作業(yè)條件下經(jīng)過存于柱中的基質(zhì)，所述作業(yè)條件可使所述基質(zhì)結 合至少2. 8mg多肽/mL基質(zhì)，其中所述基質(zhì)選自由下述組成的群組：帶電離子交換型基質(zhì)、 疏水作用色譜樹脂、及固定化金屬親和色譜樹脂；和 從所述柱的流出物回收所述經(jīng)純化多肽。
8. 如權利要求6所述的方法，其進一步包含自加載物流體回收經(jīng)純化多肽的方法，所 述回收方法包含如下步驟： 使所述加載物流體在由至少為0. 1的分配系數(shù)界定的作業(yè)條件下經(jīng)過存于柱中的基 質(zhì)；和 從所述柱的流出物回收所述經(jīng)純化多肽。
9. 一種在細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包含： (1) 提供細胞培養(yǎng)物，其包含 a. 細胞，所述細胞包含編碼相關多肽的核酸；及 b. 起始細胞培養(yǎng)基，其中所述起始細胞培養(yǎng)基的體積占期望細胞培養(yǎng)基體積的 60-99% ； (2) 對步驟（1)的所述細胞培養(yǎng)物提供補加細胞培養(yǎng)基，其中所述補加細胞培養(yǎng)基的 體積占所述期望細胞培養(yǎng)基體積的1-40%，且其中所得期望細胞培養(yǎng)基為如權利要求1至 5中任一權利要求所述的細胞培養(yǎng)基；和 (3) 將所述細胞培養(yǎng)物維持在可使所述相關多肽表達的條件下。
10. 如權利要求6至9中任一權利要求所述的方法，其中所述細胞培養(yǎng)物是大規(guī)模細胞 培養(yǎng)物。
11. 如權利要求6至9中任一權利要求所述的方法，其中所述細胞是動物細胞。
12. 如權利要求6和9中任一權利要求所述的方法，其中所述多肽是經(jīng)純化的。
13. 如權利要求6至9中任一權利要求所述的方法，其中所述培養(yǎng)基是確定成份培養(yǎng) 基，其中所有組份具有已知化學結構的培養(yǎng)基。
【文檔編號】C12N5/00GK104152395SQ201410370624
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2007年11月7日 優(yōu)先權日:2006年11月8日
【發(fā)明者】欒嚴同, 王文格, 瑞安·諾蘭, 丹尼斯·德拉波 申請人:惠氏公司