一種血紅素的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血紅素的提取方法，包括以下步驟：將新鮮豬血離心分離，收集豬血球；將豬血球與水按一定比例混合后，高速攪拌使豬血球破膜，然后調(diào)節(jié)溫度至30～70℃、pH4.0～9.0，再加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解6～24h，接著調(diào)節(jié)酶解后的酶解液pH至4.0～9.0，并加熱至溫度50～90℃；再將酶解液離心分離收集沉淀，此沉淀為血紅素粗品；向血紅素粗品中加入氫氧化鈉溶液，加熱至50～90℃，攪拌使血紅素粗品溶解；溶液冷卻后，加入CMC，攪拌均勻；離心分離，收集獲得CMC-血紅素；使用超濾膜分離CMC和血紅素烘干，即為血紅素成品。本方法不需要任何有機(jī)溶劑，安全環(huán)保，生產(chǎn)工藝簡單可控，純度可達(dá)85％以上。
【專利說明】一種血紅素的提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種血紅素的提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬血中含有0.5%的血紅素，它不僅可作為肉制品中的發(fā)色劑使用，還可作為半 合成膽紅素原料，而且是抗癌的特效藥，在臨床上還可作為補(bǔ)鐵劑，治療由缺鐵引起的貧血 癥。目前國內(nèi)血紅素的研究比較熱門，但生產(chǎn)上分離提取仍未突破傳統(tǒng)的方法，要獲得高純 度的血紅素，依然靠的是酸性丙酮沉淀法。此方法先用氯仿沉淀豬血球中的血紅蛋白，然 后過濾收集沉淀，加入5倍體積2. 5%的濃鹽酸丙酮溶液，攪拌浸提，收集丙酮血紅素溶液， 最后真空抽濾回收丙酮，獲得血紅素純品。這種傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)是工藝復(fù)雜，使用大量有機(jī) 溶劑，不安全環(huán)保，得到的血紅素油性大，需要蒸餾塔等大型設(shè)備，設(shè)備投入很大，產(chǎn)品成本 高，應(yīng)用受到限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有的血紅素提取方法工藝復(fù)雜，使用大量的有機(jī)溶劑的技術(shù) 問題，本發(fā)明提供一種新型環(huán)保的血紅素的提取方法。
[0004] 為了達(dá)到上述的技術(shù)效果，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：
[0005] -種血紅素的提取方法，包括以下步驟：
[0006] 步驟一：將新鮮豬血離心分離，收集豬血球；新鮮豬血經(jīng)連續(xù)分離機(jī)進(jìn)行離心分 離，轉(zhuǎn)速 > 5000rpm。
[0007] 步驟二：酶法水解分離血紅素肽：將豬血球與水按一定比例混合后，高速攪拌使 豬血球破膜，然后調(diào)節(jié)溫度至30?70°C、pH4. 0?9. 0,再加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解6?24h， 接著調(diào)節(jié)酶解后的酶解液pH至4. 0?9. 0,并加熱至溫度50?90°C;再將酶解液離心分離 收集沉淀，此沉淀為血紅素粗品；此步驟為使用胰蛋白酶水解血紅蛋白，將血紅蛋白分解成 小分子的肽，包裹在血紅蛋白內(nèi)部的疏水性的血紅素暴露出來，血紅素上還連有一些未被 水解的小肽，經(jīng)后期調(diào)節(jié)pH、加熱處理，肽鏈變性，與疏水性的血紅素一起形成沉淀。
[0008] 步驟三：血紅素肽重新溶解并吸附：向血紅素粗品中加入氫氧化鈉溶液并加熱至 溫度50?90°C，攪拌使血紅素粗品溶解；待溶液冷卻后，加入羧甲基纖維素鈉 CMC，攪拌均 勻；將CMC-血紅素粗品進(jìn)行離心分離，收集獲得CMC-血紅素；CMC是一種大分子、粘稠性的 親水物質(zhì)，它能吸附血紅素形成粘稠的糊狀物，使其與小肽分離。
[0009] 步驟四：CMC-血紅素的分離：使用截留分子量為500?50000Da的超濾膜分離CMC 和血紅素，超濾后取超濾截留物，烘干，即為血紅素成品。
[0010] 進(jìn)一步的技術(shù)方案是：所述的豬血球與水的質(zhì)量比為1:1?3。
[0011] 進(jìn)一步的技術(shù)方案是：所述的胰蛋白酶的加入量為每千克豬血球中加入50?500 萬U酶活力單位。
[0012] 進(jìn)一步的技術(shù)方案是：所述的酶解液離心分離采用臥螺離心機(jī)或三軸離心機(jī)，離 心轉(zhuǎn)速大于3000rpm，離心20min以上。
[0013] 進(jìn)一步的技術(shù)方案是：所述的氫氧化鈉溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1?5%;氫氧化鈉溶 劑的加入量為血紅素粗品質(zhì)量的15?30倍。
[0014] 進(jìn)一步的技術(shù)方案是：步驟三中加入CMC的終濃度為0. 1?10%，S卩加入羧甲基 纖維素鈉 CMC后，CMC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1?10%。
[0015] 進(jìn)一步的技術(shù)方案是：所述的CMC-血紅素粗品進(jìn)行離心分離采用碟片離心機(jī)，轉(zhuǎn) 速大于5000rpm，離心時間為30min。
[0016] 進(jìn)一步的技術(shù)方案是：所述的超濾膜的材料為聚酰胺，超濾膜的膜組件為卷式，超 濾溫度為60°c，料液pH為4?10,超濾壓力為0· OIMPa，超濾時間為30?60min。
[0017] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的有益效果：
[0018] 本方法結(jié)合酶解法和CMC吸附法來提取血紅素，不需要任何有機(jī)溶劑，安全環(huán)保， 生產(chǎn)工藝簡單可控，設(shè)備投入不大，可連續(xù)化操作；提取的血紅素不油性，純度可達(dá)85%以 上。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述和說明。
[0020] 血紅素的提取方法，包括以下步驟：
[0021] 1、豬血球前處理：新鮮豬血經(jīng)高精度連續(xù)分離機(jī)分離（轉(zhuǎn)速> 5000rpm)，收集獲 得豬血球。
[0022] 2、酶法水解分離血紅素肽：在夾套式的酶解罐中加入一定量的血球，加入一定質(zhì) 量的水，高速攪拌l〇min?2h，在低滲透壓下，血球破膜，釋放出血紅蛋白，同時酶解罐溫度 升高到30?70°C，稀鹽酸調(diào)節(jié)酶解液pH4. 0?9. 0,加入胰蛋白酶，加入量按每lkg血球加 50?500萬U酶活力單位，酶解6-24h后，調(diào)節(jié)酶解液pH至4. 0?9. 0,并加熱至50?90°C 保持30min，處理結(jié)束。酶解液用臥螺離心機(jī)或三軸離心機(jī)離心分離，轉(zhuǎn)速大于3000rpm，離 心20min以上，收集沉淀。此沉淀為血紅素粗品。
[0023] 3、血紅素肽重新溶解并吸附：在酶解罐中加入血紅素肽沉淀，加入15?30倍質(zhì)量 的0. 1 %?5%氫氧化鈉溶液，加熱到50?90°C，快速攪拌使血紅素肽溶解。溶液冷卻后， 加入羧甲基纖維素鈉（CMC)，使其終濃度為0. 1?10%，攪拌。CMC是一種大分子、粘稠性的 親水物質(zhì)，它能吸附血紅素形成粘稠的糊狀物，使其與小肽分離。碟片離心機(jī)離心分離，轉(zhuǎn) 速大于5000rpm，離心30min以上，收集CMC-血紅素。
[0024] 4、CMC_血紅素與肽的分離：使用超濾設(shè)備分離CMC和血紅素，膜組件為卷式，材料 為聚酰胺，超濾膜截留分子量為500?50000Da，超濾溫度為60°C，料液pH為4?10,超濾 壓力為0. OIMPa，循環(huán)超濾時間為40min。超濾后取超濾截留物，烘干，即為血紅素成品。
[0025] 實(shí)施例1 :
[0026] 在夾套式酶解罐中加入分離獲得的新鮮豬血球150kg，加水150kg混合，快速攪拌 (頻率30赫茲）破膜lh，然后將酶解罐溫度升高到溫度50°C、用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0， 再加入胰蛋白酶4. 5kg，溶解后攪拌速度降低（頻率14赫茲），酶解10h后，調(diào)節(jié)酶解液pH 至5. 0,并加熱至80°C維持30min，處理結(jié)束。待冷卻后，用臥螺離心機(jī)分離，轉(zhuǎn)速4000rpm， 離心20min，收集沉淀得血紅素粗品，純度為30 %。
[0027] 將血紅素粗品10kg放入酶解罐中，加入200kg0. 5%氫氧化鈉溶液并加熱到90°C， 快速攪拌使其溶解。待溶液冷卻后，加入羧甲基纖維素鈉6kg，攪拌。碟片離心機(jī)5000rpm 離心分離30min，收集糊狀沉淀，S卩CMC-血紅素。
[0028] 將收集的糊狀沉淀10kg，加水40kg，調(diào)節(jié)pH為9,采用截留分子量為lOOODa的卷 式超濾膜設(shè)備超濾，超濾溫度為60°C，超濾壓力為0. OIMPa，循環(huán)超濾時間為30min。超濾后 的截留物經(jīng)烘干即為血紅素成品。血紅素純度經(jīng)檢測為87%。實(shí)施例2:
[0029] 在夾套式酶解罐中加入分離獲得的新鮮豬血球150kg，加水300kg混合，快速攪拌 (頻率30赫茲）破膜lh，然后將酶解罐溫度升高到溫度40°C、用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至5. 0， 再加入胰蛋白酶4. 5kg，溶解后攪拌速度降低（頻率14赫茲），酶解15h后，調(diào)節(jié)酶解液pH 至8. 0,并加熱至80°C維持30min，處理結(jié)束。待冷卻后，用臥螺離心機(jī)分離，轉(zhuǎn)速4000rpm， 離心20min，收集沉淀得血紅素粗品，純度為30%。
[0030] 將血紅素粗品10kg放入酶解罐中，加入150kg2%氫氧化鈉溶液并加熱到70°C，快 速攪拌使其溶解。待溶液冷卻后，加入羧甲基纖維素鈉 l〇kg，攪拌。碟片離心機(jī)5000rpm離 心分離30min，收集糊狀沉淀，S卩CMC-血紅素。
[0031] 將收集的糊狀沉淀10kg，加水40kg，調(diào)節(jié)pH為9,采用截留分子量為5000Da的卷 式超濾膜設(shè)備超濾，超濾溫度為60°C，超濾壓力為0. OIMPa，循環(huán)超濾時間為30min。超濾后 的截留物經(jīng)烘干即為血紅素成品。血紅素純度經(jīng)檢測為89%。
[0032] 實(shí)施例3 :
[0033] 在夾套式酶解罐中加入分離獲得的新鮮豬血球150kg，加水200kg混合，快速攪拌 (頻率30赫茲）破膜lh，然后將酶解罐溫度升高到溫度70°C、用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至9. 0， 再加入胰蛋白酶4. 5kg，溶解后攪拌速度降低（頻率14赫茲），酶解15h后，調(diào)節(jié)酶解液pH 至8. 0,并加熱至90°C維持30min，處理結(jié)束。待冷卻后，用臥螺離心機(jī)分離，轉(zhuǎn)速4000rpm， 離心20min，收集沉淀得血紅素粗品，純度為29 %。
[0034] 將血紅素粗品10kg放入酶解罐中，加入300kg0. 1%氫氧化鈉溶液并加熱到70°C， 快速攪拌使其溶解。待溶液冷卻后，加入羧甲基纖維素鈉20kg，攪拌。碟片離心機(jī)5000rpm 離心分離30min，收集糊狀沉淀，S卩CMC-血紅素。
[0035] 將收集的糊狀沉淀10kg，加水40kg，調(diào)節(jié)pH為9,采用截留分子量為20000Da的卷 式超濾膜設(shè)備超濾，超濾溫度為60°C，超濾壓力為0. OIMPa，循環(huán)超濾時間為30min。超濾后 的截留物經(jīng)烘干即為血紅素成品。血紅素純度經(jīng)檢測為88%。
[0036] 盡管這里參照本發(fā)明的解釋性實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了描述，上述實(shí)施例僅為本發(fā) 明較佳的實(shí)施方式，本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，應(yīng)該理解，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以設(shè)計出很多其他的修改和實(shí)施方式，這些修改和實(shí)施方式將落在本申請公開的原則 范圍和精神之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種血紅素的提取方法，其特征在于包括以下步驟： 步驟一：將新鮮豬血離心分離，收集豬血球； 步驟二：酶法水解分離血紅素肽：將豬血球與水按一定比例混合后，高速攪拌使豬血 球破膜，然后調(diào)節(jié)溫度至30?70°C、pH4. 0?9. 0,再加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解6?24h，接著 調(diào)節(jié)酶解后的酶解液pH至4. 0?9. 0,并加熱至溫度50?90°C;再將酶解液離心分離收集 沉淀，此沉淀為血紅素粗品； 步驟三：血紅素肽重新溶解并吸附：向血紅素粗品中加入氫氧化鈉溶液并加熱至溫度 50?90°C，攪拌使血紅素粗品溶解；待溶液冷卻后，加入羧甲基纖維素鈉 CMC，攪拌均勻；將 CMC-血紅素粗品進(jìn)行離心分離，收集獲得CMC-血紅素； 步驟四：CMC-血紅素的分離：使用截留分子量為500?50000Da的超濾膜分離CMC和 血紅素，超濾后取超濾截留物，烘干，即為血紅素成品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血紅素的提取方法，其特征在于所述的豬血球與水的質(zhì) 量比為1:1?3。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血紅素的提取方法，其特征在于所述的胰蛋白酶的加入 量為每千克豬血球中加入50?500萬U酶活力單位。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血紅素的提取方法，其特征在于所述的酶解液離心分離 采用臥螺離心機(jī)或三軸離心機(jī)，離心轉(zhuǎn)速大于3000rpm，離心20min以上。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血紅素的提取方法，其特征在于所述的氫氧化鈉溶液的 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 1?5% ;氫氧化鈉溶劑的加入量為血紅素粗品質(zhì)量的15?30倍。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血紅素的提取方法，其特征在于步驟三中加入CMC的終 濃度為〇. 1?10%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血紅素的提取方法，其特征在于所述的CMC-血紅素粗品 進(jìn)行離心分離采用碟片離心機(jī)，轉(zhuǎn)速大于5000rpm，離心時間為30min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種血紅素的提取方法，其特征在于所述的超濾膜的材料為 聚酰胺，超濾膜的膜組件為卷式，超濾溫度為60°C，料液pH為4?10,超濾壓力為0. OIMPa， 超濾時間為30?60min。
【文檔編號】C12P17/18GK104195195SQ201410409254
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】郝剛 申請人:成都宏安生物科技有限公司