專利名稱：與gd2結合的小鼠14.18抗體的人源化抗體(h14.18)以及其與il－2的融合的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總體上涉及經(jīng)修飾抗體。更具體地，本發(fā)明涉及特異結合人細胞表面鞘糖酯GD2的具有已降低免疫原性的經(jīng)修飾抗體，以及它們作為治療劑的用途。
背景技術：
許多年來，在研發(fā)基于抗體的治療中有很大進展。例如，研究者不僅鑒定了許多癌特異標記物，也鑒定了許多與此類標記物特異結合的抗體。抗體可用于向表達標記物的癌細胞遞送特定的分子，例如毒素或免疫刺激物如細胞因子以選擇性殺死癌細胞。
14.18抗體為針對細胞表面鞘糖脂GD2的小鼠來源單克隆抗體。GD2為通常只在神經(jīng)元細胞外表面膜以顯著水平表達的二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯，其中它暴露于免疫系統(tǒng)是受到血腦屏障限制的。
相反的，許多腫瘤細胞鞘糖酯細胞表面表達具有異常水平。例如，GD2在廣泛的腫瘤細胞表面表達，所述腫瘤細胞包括成神經(jīng)細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、星形細胞瘤、黑素瘤、小細胞肺癌、骨肉瘤及其它軟組織肉瘤。因此，GD2為用于將免疫刺激性蛋白質(zhì)結構域靶向腫瘤細胞，以對腫瘤細胞引起有效的免疫反應而破壞它們的一種便利的腫瘤特異標記物。雖然14.18小鼠抗體(m14.18抗體)可有助于將此類蛋白質(zhì)結構域靶向腫瘤細胞，但其小鼠來源的氨基酸序列可降低目的治療作用。
當施用于患者時，抗體在宿主哺乳動物中具有伴隨的免疫原性。當抗體不是自體的時，這更有可能發(fā)生。結果基于抗體治療的有效性常常受到針對治療性抗體的免疫原性反應的限制。當抗體整個或部分來自與宿主哺乳動物不同的哺乳動物，例如當抗體來自小鼠且受者為人時，免疫原性反應一般增加。
對于在人中的臨床用途，將小鼠來源抗體修飾成與人抗體更接近，以將小鼠來源抗體的免疫原性降低或降到最小可能是有利的。小鼠來源抗體的免疫原性可通過制備嵌合抗體降低，所述嵌合抗體將人抗體的恒定區(qū)與小鼠可變結構域進行融合。然而，殘留的小鼠可變結構域在人中一般仍具有免疫原性并因此可降低基于抗體治療的功效。
降低免疫原性的一些方法，如“鑲嵌術(veneering)”及“人源化”涉及導入許多氨基酸替代并可破壞抗體與抗原的結合。m14.18抗體與GD2的結合具有中等親和力。因此，預計顯著降低m14.18對GD2親和力的突變使得m14.18在人中的治療性目的的作用降低。因此，本領域需要可有效靶向GD2并在施用于人時具有降低免疫原性的治療性抗體。
發(fā)明概述總體上，本發(fā)明提供了在人中具有較低免疫原性但仍保持m14.18對人GD2結合親和力的m14.18抗體的經(jīng)修飾形式。
更具體地，本發(fā)明提供了m14.18抗體的人源化形式(hu14.18抗體)，其中一個或多個構架區(qū)的一些小鼠特異氨基酸用不同氨基酸替代以降低它們在人中的免疫原性。本發(fā)明也提供了hu14.18抗體與一種或多種非免疫球蛋白分子融合以增強靶向免疫治療的作用。
一方面，本發(fā)明提供了包括定義了免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL區(qū))的SEQ ID N01所示氨基酸序列的抗體可變區(qū)。另一方面，本發(fā)明涉及包括定義了免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH區(qū))的SEQ ID NO2所示氨基酸序列的抗體可變區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了SEQ ID NO1所示氨基酸序列與SEQ ID NO2所示氨基酸序列連接的抗體可變區(qū)。氨基酸序列可例如通過二硫鍵或肽鍵連接。
另一方面，本發(fā)明涉及與GD2特異結合并包括至少SEQ ID NO1的第1-23位氨基酸、SEQ ID NO2的第1-25位氨基酸或SEQ ID NO2的第67-98位氨基酸的抗體可變區(qū)。此類序列定義了hu14.18抗體的免疫球蛋白可變區(qū)中的構架區(qū)。構架區(qū)在以下進行更詳細的描述。
本發(fā)明的一方面涉及用于靶向表面具有GD2的細胞并包括向患者施用本發(fā)明所述抗體可變區(qū)的方法。在一個實施方案中，靶細胞為腫瘤細胞。本發(fā)明的另一方面包括編碼抗體可變區(qū)的核酸或包括此核酸的細胞，所述核酸或包括此核酸的細胞可向患者施用或用于體外蛋白質(zhì)產(chǎn)生。
本發(fā)明也提供了包括本發(fā)明所述抗體可變區(qū)及至少包含CH2結構域的Fc部分的多肽、編碼多肽的核酸、包括核酸的細胞以及通過向患者施用多肽、核酸或細胞用于靶向表面具有GD2的細胞的方法。在本發(fā)明的一些實施方案中，F(xiàn)c部分來自IgG1。
有或無插入Fc部分的抗體可變區(qū)可與非免疫球蛋白分子連接。具體地，非免疫球蛋白分子可為細胞因子，如白細胞介素、造血因子、淋巴因子、干擾素或趨化因子。白細胞介素可為例如白細胞介素-2或白細胞介素-12。造血因子及淋巴因子可分別為例如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)及淋巴毒素。干擾素可為例如干擾素-α、干擾素-β或干擾素-γ。在本發(fā)明的一些實施方案中，融合蛋白包括第二種非免疫球蛋白分子，如第二種細胞因子。在具體的實施方案中，融合蛋白包括抗體可變區(qū)、IL-2及IL-12。
可以理解文中描述的多種實施方案的特征不是互相排斥的并可以多種組合及互換存在。
附圖描述

圖1A顯示根據(jù)本發(fā)明所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
圖1B顯示根據(jù)本發(fā)明所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
圖2A-D顯示表達載體的核苷酸序列，包括編碼根據(jù)本發(fā)明所述的免疫球蛋白輕鏈及免疫球蛋白重鏈-IL-2融合蛋白的核酸構建體。
圖3A顯示根據(jù)本發(fā)明所述的免疫球蛋白輕鏈的氨基酸序列。
圖3B顯示根據(jù)本發(fā)明所述的免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了在人中具有較低免疫原性但仍能特異結合人GD2的m14.18抗體的經(jīng)修飾形式。降低的免疫原性是由免疫球蛋白可變結構域中一個或多個經(jīng)改變氨基酸序列提供的?？贵w用于治療GD2陽性腫瘤，特別是當與細胞因子或其它免疫調(diào)節(jié)劑融合時，抗體用于治療GD2陽性腫瘤。
如文中應用的，術語“抗體”及“免疫球蛋白”理解為表示(i)完整抗體(例如，單克隆抗體或多克隆抗體)，(ii)其抗原結合部分，包括例如Fab片段、Fab’片段、(Fab’)2片段、Fv片段、單鏈抗體結合部位、sFv，(iii)雙特異抗體及其抗原結合部分，和(iv)多特異性抗體及其抗原結合部分。
如文中應用的，術語“特異結合”及“特異性結合”理解為表示抗體對特定抗原具有至少約106M-1，更優(yōu)選地至少約107M-1，更優(yōu)選地至少約108M-1及最優(yōu)選地至少約1010M-1的結合親和力。
如文中應用的，術語“構架區(qū)”及“FR”理解為表示與互補性決定區(qū)(CDR)相鄰的免疫球蛋白可變區(qū)的區(qū)域。CDR為與抗原主要相互作用的免疫球蛋白部分。如圖1中顯示的，VH及VL區(qū)域均包含四個FR并位于氨基酸序列的加框部分。
特別地，對于圖1A(SEQ ID NO1)顯示的氨基酸序列，輕鏈FR由自Aspl至Cys23(huVLFR1)、自His39至His54(huVLFR2)、自Gly62至Cys93(huVLFR3)及自Phe104至Lys113(huVLFR4)的氨基酸序列定義。對于圖1B(SEQ ID NO2)中顯示的氨基酸序列，重鏈FR由自Glu1至Ser25(huVHFR1)、自Trp36至Gly49(huVHFR2)、自Arg67至Ser98(huVHFR3)及自Trp103至Ser113(huVHFR4)的氨基酸序列定義。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列本發(fā)明以與人細胞表面鞘糖酯GD2結合優(yōu)選地特異結合、并具有衍生自m14.18抗體的經(jīng)修飾區(qū)域的抗體為特征。將VH或VL氨基酸序列(或兩者的氨基酸序列)進行修飾或人源化以在向人施用時，降低它們的免疫原性。根據(jù)本發(fā)明，m14.18抗體例如可用去免疫化(deimmunization)的方法進行人源化，所述去免疫化的方法為將潛在的T細胞表位通過導入降低肽表位與MHC II類分子結合的突變?nèi)コ驕p弱(參見，例如，WO98/52976和WO00/34317)。備選地，將非人T細胞表位突變以便它們與在人抗體中存在的人自身表位相對應(參見，例如，美國專利號5,712,120)。本發(fā)明提供了具有包括至少一個人源化FR序列的VL及VH區(qū)域的GD2抗體，因此在向人施用時降低了免疫原性。
I.重鏈及輕鏈可變區(qū)如以上談及的，hu14.18包括衍生自m14.18抗體的與人GD2抗原保持特異結合性的人源化可變區(qū)。在本發(fā)明的一些實施方案中，hu14.18抗體的VL區(qū)域包括以下多肽D-V-V-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-T-P-G-E-P-A-S-I-S-C-R-S-S-Q-S-L-V-H-R-N-G-N-T-Y-L-H-W-Y-L-Q-K-P-G-Q-S-P-K-L-L-I-H-K-V-S-N-R-F-S-G-V-P-D-R-F-S-G-S-G-S-G-T-D-F-T-L-K-I-S-R-V-E-A-E-D-L-G-V-Y-F-C-S-Q-S-T-H-V-P-P-L-T-F-G-A-G-T-K-L-E-L-K(SEQ ID NO1)。
在具體的實施方案中，hu14.18抗體包括由SEQ ID NO1的1至23位殘基即D-V-V-M-T-Q-T-P-L-S-L-P-V-T-P-G-E-P-A-S-I-S-C(huVLFR1)定義的輕鏈FR1。
在本發(fā)明的其它實施方案中，hu14.18抗體的VH區(qū)域包括以下多肽E-V-Q-L-V-Q-S-G-A-E-V-E-K-P-G-A-S-V-K-I-S-C-K-A-S-G-S-S-F-T-G-Y-N-M-N-W-V-R-Q-N-I-G-K-S-L-E-W-I-G-A-I-D-P-Y-Y-G-G-T-S-Y-N-Q-K-F-K-G-R-A-T-L-T-V-D-K-S-T-S-T-A-Y-M-H-L-K-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-V-S-G-M-E-Y-W-G-Q-G-T-S-V-T-V-S-S(SEQ ID NO2)。
在具體的實施方案中，hu14.18抗體包括由SEQ ID NO2的第1至25位殘基即E-V-Q-L-V-Q-S-G-A-E-V-E-K-P-G-A-S-V-K-I-S-C-K-A-S(huVHFR1)定義的重鏈FR1。在本發(fā)明的又一實施方案中，hu14.18抗體包括由SEQ ID NO2的第67至98位殘基即R-A-T-I-T-V-D-K-S-T-S-T-A-Y-M-H-I-K-S-L-R-S-E-D-T-A-V-Y-Y-C-V-S(huVHFR3)表示的重鏈FR3。
前述實施方案的多種組合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，hu14.18抗體可包括SEQ ID NO1所示VL序列及SEQ ID NO2所示VH序列。取決于VL及VH區(qū)域的核酸序列是如何構建的，它們可通過二硫鍵或肽鍵連接。一般地，當V區(qū)的序列是由分別的DNA構建體編碼時，它們通過二硫鍵連接。相反地，當V區(qū)的序列在單鏈DNA構建體上編碼時，它們一般通過肽鍵連接。
本發(fā)明也考慮與GD2特異結合并至少包括部分人源化V區(qū)的抗體。例如，hu14.18抗體可包括由SEQ ID NO1定義的VL區(qū)域及具有至少一個人源化FR如huVHFR1或huVHFR2的VH區(qū)域。備選地，本發(fā)明的抗體可包括由SEQ ID NO2定義的VH區(qū)域及具有至少一個人源化FR如huVLFR1的VL區(qū)域。hu14.18抗體也可具有包括至少一個人源化FR的VH區(qū)域和/或至少一個人源化FR的VL區(qū)域。
在本發(fā)明的某些實施方案中，輕鏈可變區(qū)及重鏈可變區(qū)可分別與免疫球蛋白的輕鏈恒定區(qū)及重鏈恒定區(qū)偶聯(lián)。免疫球蛋白輕鏈具有稱為κ鏈或λ鏈的恒定區(qū)。在本發(fā)明的具體實施方案中，輕鏈恒定區(qū)為κ鏈。重鏈恒定區(qū)以及其多種修飾及組合在以下進行詳細討論。
II.Fc部分本發(fā)明所述的抗體可變區(qū)任選的與Fc部分融合。如文中應用的，F(xiàn)c部分包含來自免疫球蛋白優(yōu)選人免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)的結構域，包括恒定區(qū)的片段、類似物、變體、突變體或衍生物。免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)定義為與重鏈的至少部分C-端區(qū)域同源的天然存在或人工產(chǎn)生的多肽，包括CH1、鉸合部、CH2、CH3及對于某些重鏈類包括CH4結構域。“鉸合部”區(qū)域連接Fc部分的CH1結構域與CH2-CH3區(qū)域。所有哺乳動物免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)顯示廣泛的氨基酸序列相似性。此類免疫球蛋白區(qū)域的DNA序列是本領域公知的。(參見，例如，Gillies等人，(1989)J.Immunol.Meth.125191)。
在本發(fā)明中，F(xiàn)c部分一般包括至少CH2結構域。例如，F(xiàn)c部分可包括完整的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(CH1-鉸合部-CH2-CH3)。備選地，F(xiàn)c部分可包括所有或部分鉸鏈區(qū)、CH2結構域及CH3結構域。
免疫球蛋白的恒定區(qū)負責許多重要的抗體效應子功能，包括Fc受體(FcR)結合及補體固定。重鏈恒定區(qū)主要有五類，即IgA、IgG、IgD、IgE及IgM，每類具有通過同種型定義的特征性效應子功能。
例如，IgG分為四個γ同種型γ1、γ2、γ3及γ4，也分別稱為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgG分子可與多類細胞受體相互作用，所述多類細胞受體包括三類對抗體IgG類特異的Fcγ受體(FcγR)，即FcγRI、FcγRII及FcγRIII。據(jù)報道對IgG與FcγR受體結合重要的序列在CH2及CH3結構域中。
抗體的血清半衰期是受抗體與Fc受體(FcR)結合能力的影響。同樣，免疫球蛋白融合蛋白的血清半衰期也受其不能與此類受體結合的影響(Gillies等人，Cancer Research(1999)592159-66)。與IgG1相比，IgG2及IgG4的CH2與CH3結構域與Fc受體的結合親和力不能檢測到或結合親和力降低。因此，特征性抗體的血清半衰期可用來自IgG2或IgG4同種型的CH2和/或CH3結構域延長。備選地，抗體可包括來自IgG1或IgG3的CH2和/或CH3結構域，在所述此類結構域的一個或多個氨基酸進行修飾以降低對Fc受體的結合親和力(參見，例如，美國專利申請09/256,156，作為美國專利申請公開2003-0105294-Al而公開)。
Fc部分的鉸鏈區(qū)一般與重鏈恒定區(qū)CH1結構域的C-端連接。當包括在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中時，鉸合部與天然存在的免疫球蛋白區(qū)域同源并一般包括半胱氨酸殘基，所述半胱氨酸殘基如在天然免疫球蛋白中那樣通過二硫鍵連接兩條重鏈。人及小鼠免疫球蛋白鉸鏈區(qū)的代表性序列可在ANTIBODY ENGINEERING，a PRACTICAL GUIDE，(Borrebaeck編輯，W.H.Freeman and Co.，1992)一書中找到。
本發(fā)明的合適鉸鏈區(qū)可衍生自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其它免疫球蛋白同種型。IgG1同種型在鉸鏈區(qū)具有允許形成強效及堅固二硫鍵的兩個二硫鍵。因此，本發(fā)明優(yōu)選的鉸鏈區(qū)來自IgG1。任選地，將IgG1鉸合部的第一個最N-端半胱氨酸突變以增強本發(fā)明所述抗體或抗體融合蛋白的表達及裝配(參見，例如，美國專利申請10/093,958，作為美國專利申請公開2003-0044423-Al而公開)。
與IgG1相反，IgG4的鉸鏈區(qū)已知低效形成鏈間二硫鍵(Angal等人，(1993)，Mol.Immunol.30105-8)。同樣，IgG2鉸鏈區(qū)具有四個二硫鍵，所述四個二硫鍵在重組系統(tǒng)分泌時趨向于促進寡聚化并可能形成不正確的二硫鍵。本發(fā)明的一個合適的鉸鏈區(qū)可衍生自IgG4鉸鏈區(qū)，優(yōu)選地包含增強來自重鏈的部分之間正確形成二硫鍵的突變(Angal等人，(1993)，Mol.Immunol.30(1)105-8)。另一優(yōu)選的鉸鏈區(qū)衍生自IgG2鉸合部，其中最初的兩個半胱氨酸均突變?yōu)榱硪话被幔?，按一般?yōu)選的順序，突變?yōu)榻z氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或硒代半胱氨酸(參見，例如，美國專利申請公開2003-0044423-Al)。
與本發(fā)明抗體可變區(qū)融合的Fc部分可包含衍生自不同抗體同種型的CH2和/或CH3結構域及鉸鏈區(qū)。例如，F(xiàn)c部分可包含IgG2或IgG4的CH2和/或CH3結構域及IgG1的鉸鏈區(qū)。此類雜化(hybrid)Fc部分的裝配在美國專利申請公開2003-0044423-Al中已有描述。
當與本發(fā)明所述的抗體可變區(qū)融合時，F(xiàn)c部分優(yōu)選包含通常用于延長Fc融合蛋白血清半衰期的一個或多個氨基酸修飾。此類氨基酸修飾包括基本降低或去除Fc受體結合或補體固定活性的突變。例如，一類此種突變?nèi)コ庖咔虻鞍字劓淔c部分的糖基化位點。在IgG1中，糖基化位點為Asn297(參見，例如，美國專利申請10/310,719，作為美國專利申請公開2003-0166163-Al而公開)。
III.融合連接區(qū)(junction region)本發(fā)明的抗體可變區(qū)可任選地與非免疫球蛋白部分直接或間接地例如通過接頭肽(例如，(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO3))連接或融合。如在美國專利申請公開2003-0166877-Al中描述的，所公開融合蛋白的免疫原性可通過損壞融合接頭或接頭表位與T細胞受體的相互作用而降低。甚至在兩種人蛋白質(zhì)如人Fc及人IL-2之間的融合中，融合接頭或接頭表位周圍的區(qū)域包括通常在人身體中不存在的肽序列，并因此可具有免疫原性。接頭表位的免疫原性，例如可通過在融合接頭附近導入一個或多個糖基化位點而降低，或如在美國專利公開2003-0166877-A1中描述的通過鑒定跨越接頭的候選T細胞表位以及改變接頭附近的氨基酸以降低候選T細胞表位與T細胞受體相互作用的能力而降低。
蛋白質(zhì)的血清半衰期也可通過將突變導入到融合連接區(qū)而增加。例如，在與非免疫球蛋白部分融合的包括CH3結構域蛋白質(zhì)中，CH3結構域的C-端賴氨酸可改變?yōu)榱硪粋€氨基酸如丙氨酸，如此可使所產(chǎn)生融合蛋白的血清半衰期相當程度的延長。
在某些實施方案中，融合接頭的蛋白酶切割是令人希望的。因此，基因間區(qū)域可包括編碼蛋白酶切割位點的核苷酸序列。可將介于免疫球蛋白與細胞因子之間的此位點設計為在靶位點提供細胞因子蛋白水解釋放的位點。例如，纖溶酶及胰蛋白酶在賴氨酸及精氨酸殘基后的蛋白酶可接近的位點處切割是公知的。其它位點特異性內(nèi)切蛋白酶及其識別的氨基酸序列是公知的。
IV.用hu14.18抗體融合蛋白治療人疾病本發(fā)明所述的抗體可變區(qū)可與診斷劑和/或治療劑連接。所述制劑可與抗體融合以產(chǎn)生融合蛋白。備選地，所述制劑可與抗體化學偶聯(lián)以產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物(immuno-conjugate)。例如，所述制劑可為毒素、放射標記、顯像劑、免疫刺激物等。
本發(fā)明所述的抗體可變區(qū)可與細胞因子連接。優(yōu)選的細胞因子包括白細胞介素如白細胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16及IL-18、造血因子如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)及紅細胞生成素、腫瘤壞死因子(TNF)如TNF、淋巴因子如淋巴毒素、代謝過程的調(diào)節(jié)劑如瘦素(leptin)、干擾素如干擾素α、干擾素β、干擾素γ以及趨化因子。優(yōu)選地，抗體-細胞因子融合蛋白或免疫偶聯(lián)物顯示細胞因子生物學活性。在一個實施方案中，抗體可變結構域與IL-2融合。優(yōu)選地，如在美國專利申請公開2003-0166163-A1中描述的，將在IL-2分子內(nèi)的幾個氨基酸進行突變以降低毒性。
例如，圖3A及3B顯示根據(jù)本發(fā)明所述抗體融合蛋白具體實施方案的氨基酸序列。具體地，圖3A顯示包括可變區(qū)及恒定區(qū)的人源化免疫球蛋白輕鏈的肽序列。圖3B顯示與IL-2連接的人源化免疫球蛋白重鏈的肽序列。所述多肽提供了能特異結合GD2并刺激免疫系統(tǒng)的人源化抗體融合蛋白。
任選地，蛋白質(zhì)復合體可進一步包括第二種試劑，如第二種細胞因子。在一個實施方案中，hu14.18抗體融合蛋白包括IL-12及IL-2。包含免疫球蛋白結構域及兩種不同細胞因子的蛋白質(zhì)復合體的構建在美國專利號6,617,135中進行了詳細描述。
本發(fā)明的融合蛋白在治療人疾病如癌中是有用的。在治療人腫瘤時，每個患者用0.1至100毫克/平方米的劑量，通過輸注或皮下注射施用包含本發(fā)明所述V區(qū)的抗體-IL-2融合蛋白是特別有用的。在優(yōu)選的實施方案中，每個患者用1至10毫克/平方米，以及更優(yōu)選地，每個患者用約3至6毫克/平方米的劑量，通過輸注或皮下注射施用包含本發(fā)明所述V區(qū)的抗體-IL-2融合蛋白是特別有用的。
臨床研究顯示在施用hu14.18-IL-2后，融合蛋白保留通過IL-2受體活化IL-2反應性細胞的能力并保留結合GD2-陽性腫瘤細胞并向它們的表面遞呈IL-2的能力。此外，向癌患者施用hu14.18-IL-2融合蛋白導致令人驚訝的大量患者疾病進展的穩(wěn)定(參見實施例1)。
本發(fā)明的藥學組合物可以固體、半固體或液體劑型的形式，例如丸劑、膠囊劑、粉劑、液體劑、懸液劑等等應用，優(yōu)選適合用于施用精確劑量的單位劑型。組合物包括常規(guī)藥學載體或賦形劑，此外，可包括其它醫(yī)學試劑、藥學試劑、載體、佐劑等。此類賦形劑可包括其它蛋白質(zhì)，例如人血清白蛋白或血漿蛋白質(zhì)。制備此類劑型的實際方法是已知的或?qū)Ρ绢I域技術人員是顯然的。在任何情況下，預施用的組合物或劑型包含對需要治療的受試者達到預期效應的有效量的活性組分。
對所述組合物的施用可通過施用顯示此類活性的制劑所采用的任何公認方式進行。此類方法包括經(jīng)口、腸胃外或局部施用以及全身形式施用。可藥用載體的靜脈內(nèi)注射是優(yōu)選的施用方法(參見實施例1)。
當然，施用的活性化合物的量取決于需要治療的受試者、所受痛苦的嚴重度、施用方式及開處方醫(yī)生的診斷。
本發(fā)明的核酸I.hu14.18抗體構建體本發(fā)明也以能表達每種以上蛋白質(zhì)的核酸為特征。例如，它們包括這樣的核酸，所述核酸編碼SEQ ID NO1列出的氨基酸序列；SEQ ID NO2所示氨基酸序列；包括huVLFR1氨基酸序列的hu14.18抗體VL區(qū)域；包括huVHFR1氨基酸序列的hu14.18抗體VH區(qū)域；包括huVHFR3氨基酸序列的hu14.18抗體VH區(qū)域以及包含含有至少一個前述人源化FR序列的hu14.18抗體和一種或多種治療劑的融合蛋白。
本發(fā)明所述的hu14.18抗體可通過基因工程技術產(chǎn)生；即通過形成編碼包含本發(fā)明所述目的FR的GD2特異抗體的核酸構建體。在一個實施方案中，編碼特征性抗體的基因構建體自5’至3’方向包括編碼包括至少一個人源化FR的重鏈可變區(qū)的DNA片段及編碼重鏈 恒定區(qū)的DNA片段。在另一實施方案中，編碼細胞因子的另一DNA片段與編碼重鏈恒定區(qū)的DNA片段的3’端融合。在不同的實施方案中，基因構建體自5’至3’方向包括編碼包括至少一個人源化FR的重鏈可變區(qū)的DNA片段及編碼細胞因子的DNA片段。備選地，本發(fā)明所述的核酸自5’至3’方向可包括編碼包括至少一個人源化FR的輕鏈可變區(qū)的DNA片段及編碼細胞因子的DNA片段。在一些實施方案中，編碼細胞因子的核酸與編碼恒定區(qū)基因(例如CH3外顯子)的3’端符合讀框地直接連接或通過基因間區(qū)域(例如，通過適當接頭，如通過編碼(Gly4-Ser)3的DNA(SEQ ID NO3))連接。
II.hu14.18抗體構建體的表達將編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸裝配或插入到一個或多個表達載體用于導入到在其中表達的適當受體細胞。核酸導入到表達載體可通過標準分子生物學技術完成。優(yōu)選的表達載體包括來自在細菌或哺乳動物細胞中可表達所編碼蛋白質(zhì)的載體。
根據(jù)本發(fā)明，抗體可變區(qū)重鏈優(yōu)選與對應的輕鏈在同一細胞中共表達。對包含多個多肽鏈的融合蛋白，可應用多個表達載體。例如，用兩個表達載體的共轉(zhuǎn)染方法常常導致將兩個載體均遞呈到一個靶細胞。備選地，用編碼多個多肽的單一載體在同一細胞中共表達有時是有用的。
例如，圖2A-D顯示均編碼根據(jù)本發(fā)明所述的免疫球蛋白重鏈及輕鏈的單一載體的核酸序列。該載體也包括與免疫球蛋白重鏈3’端融合的編碼IL-2的核酸。因此，當導入到細胞中時，僅此載體即可提供特異與GD2結合并刺激免疫功能的人源化抗體-IL-2融合蛋白。
此外，以單鏈分子表達本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)是方便的。例如，抗體可變區(qū)可作為單鏈抗體或任選地與非免疫球蛋白融合的sFv而表達。在另一實施方案中，將重鏈(有或無經(jīng)融合的細胞因子)與輕(或重)鏈配對物(有或無經(jīng)融合的細胞因子)組合以形成單價及二價免疫偶聯(lián)物。
受體細胞系優(yōu)選為淋巴樣細胞，如骨髓瘤(或雜交瘤)。骨髓瘤可合成、裝配并分泌由經(jīng)轉(zhuǎn)染基因編碼的免疫球蛋白并可使蛋白質(zhì)糖基化。特別優(yōu)選的受體細胞為一般不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的Sp2/0骨髓瘤。當轉(zhuǎn)染時，細胞只產(chǎn)生通過由經(jīng)轉(zhuǎn)染基因構建體編碼的免疫球蛋白。經(jīng)轉(zhuǎn)染骨髓瘤可在培養(yǎng)液中生長或在小鼠的腹膜內(nèi)生長，其中可自腹水獲得經(jīng)分泌的免疫偶聯(lián)物。其它淋巴樣細胞如B淋巴細胞也可用作受體細胞。
用包含編碼嵌合Ig鏈的核酸構建體的載體轉(zhuǎn)染淋巴樣細胞有幾種方法。向淋巴樣細胞導入載體的優(yōu)選途徑為通過球芽融合(參見，例如，Gillies等人，(1989)Biotechnol.7798-804)。備選的方法包括電穿孔或磷酸鈣沉淀。產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物的其它有用方法包括制備編碼RNA序列的構建體以及它在適當?shù)捏w內(nèi)或體外系統(tǒng)中的翻譯。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)一旦表達，可通過標準蛋白質(zhì)純化步驟進行收獲(參見，例如，美國專利號5,650,150)。
III.通過基因治療治療癌本發(fā)明所述的核酸可用作基因治療劑用于治療癌及其它疾病，其中定向免疫系統(tǒng)至特異細胞型是令人希望的。例如，細胞可自人或動物中取出，并且可將編碼本發(fā)明所述抗體的一個或多個核酸轉(zhuǎn)染到細胞中。然后將細胞重新導入到人或動物中。經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞可為正常細胞或癌細胞。備選地，核酸可原位導入到細胞中。然后人或動物對癌細胞產(chǎn)生免疫反應，所述免疫反應可治愈或減輕癌的嚴重度。與適當調(diào)節(jié)元件偶聯(lián)以促進在哺乳動物細胞中表達的本發(fā)明抗體可變區(qū)，可通過任何多種技術轉(zhuǎn)染到細胞中，所述多種技術包括通過磷酸鈣、“基因槍”、腺病毒載體、陽離子脂質(zhì)體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體或任何其它有效的轉(zhuǎn)染方法。
在本發(fā)明的具體實施方案中，hu14.18抗體用于體內(nèi)選擇性地向靶細胞遞送細胞因子，從而細胞因子可產(chǎn)生局部生物學效應如局部炎癥反應、刺激T細胞的生長及活化或ADCC活性。將治療有效量的抗體施用到具有靶細胞的受試者的循環(huán)系統(tǒng)中。
本發(fā)明進一步通過非限制性實施例進行闡述。
實施例實施例1hu14.18-IL2的純化及制劑在一個研究中，hu14.18-IL2自NS/0細胞表達，將組織培養(yǎng)上清液收獲，并將hu14.18-IL2蛋白質(zhì)依次進行純化，所述次序為Abx經(jīng)混合樹脂柱層析、重組A蛋白層析及Q瓊脂糖柱層析，接著通過Pellicon 2切向流透析滲濾將緩沖液交換為制劑緩沖液。此純化的步驟在以下詳細描述。病毒失活及去除步驟穿叉在這些純化步驟中，在以下進行描述。病毒失活及除去步驟對純化本身不是必需的，但用于滿足調(diào)控原因。
將包含hu14.18-IL2的兩升NS/0組織培養(yǎng)上清液用1M醋酸將pH調(diào)整到5.9并用于Abx柱(J.T.Baker)；用10mM MES、100mM醋酸鈉pH 6.2洗；并用500mM醋酸鈉pH 7洗脫。將此材料裝到重組A蛋白柱(Pharmacia)上；用100mM磷酸鈉、150mM NaCl pH 7洗；用100mM磷酸鈉、150mM NaCl pH 6洗；用10mM磷酸鈉pH 7洗；并用100mM磷酸鈉、150mM NaCl pH 3.5洗脫。經(jīng)洗脫材料的pH為4.2。為促進病毒失活，將此pH降到3.8并將此制備物孵育30分鐘，然后將pH用1MNaOH中和到7。為去除核酸，將此材料裝到Q瓊脂糖柱(Pharmacia)上并用100mM磷酸鈉、150mM NaCl pH 7洗。核酸結合到柱上，而蛋白質(zhì)在流出液及洗液中發(fā)現(xiàn)，將此步驟重復直到A280返回到基線。按照制造者說明，進行Pellicon 2滲濾(Millipore)，以便將最終hu14.18-IL2材料置于以下劑型中。
1甘露醇 4％2鹽酸精氨酸USP/NF 100mM3.檸檬酸USP-FCC 5mM4.多乙氧基醚 0.01％(w.v)將制劑緩沖液的pH用1M NaOH調(diào)整到7。
作為最終步驟，將制備物通過具有分子量截篩(cutoff)為180,000道爾頓的Viresolve 180膜(Millipore)過濾。這具有“磨光”材料的效應，結果去除了聚集的二聚體及較高數(shù)量級的寡聚物。
實施例2hu14.18-IL-2融合蛋白的抗腫瘤活性I期臨床試驗中觀察到的為評估hu14.18-IL-2的安全性及效力，進行了I期臨床試驗。適應癥患者組織學上確定為外科上及醫(yī)學上不能治愈的黑素瘤。這些患者可患有可測定的或可評估的轉(zhuǎn)移性疾病，或他們在遠端轉(zhuǎn)移或區(qū)域再發(fā)性疾病的外科切除術后無疾病征象。只包括具有多發(fā)性(兩次或多次)局部或區(qū)域性再發(fā)的患者，如果患者以前具有淋巴結參與的征象以及如果每次復發(fā)間隔為至少2個月。所有患者需要具有足夠的骨髓功能(由白細胞總數(shù)(WBC)＞3,500/ml，或有粒白細胞總數(shù)＞2000/ml，血小板＞100,000/ml及血紅蛋白＞10.0g/dl定義)，足夠的肝功能[由天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)＜3x正常值及總膽紅素＜2.0mg/dl定義]以及足夠的腎功能(由血清肌酸酐＜2.0mg/dl或肌酸酐清除率＞60毫升/分鐘定義)。所有患者通過皮質(zhì)腦電描記(ECOG)行為表現(xiàn)狀態(tài)為0或1且壽命至少12周。在研究前4周內(nèi)，接受化學治療、放射治療或其它免疫抑制治療的患者除外?；颊咭郧翱苫加兄袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(CNS)轉(zhuǎn)移，如果已經(jīng)過了治療，則在開始本研究前，必需至少穩(wěn)定4周。征得了所有患者的同意。
將此I期臨床設計為標簽公開、非隨機劑量按比例上升研究，其中3至6患者的組每天按以下劑量水平0.8、1.6、3.2、4.8、6.0或7.5mg/m2接受hu14.18-IL-2。在每個療程的第一周，連續(xù)3天對住院患者進行4小時靜脈內(nèi)(IV)輸注施用hu14.18-IL-2。hu14.18-IL-2融合蛋白以包含4％甘露醇；鹽酸精氨酸，100mM；檸檬酸，5mM及0.01％吐溫80的劑型以pH 7向患者施用。完成第三次輸注后大約24小時，如果穩(wěn)定，患者自醫(yī)院出院。副作用及毒性按NCI Common Toxicity Criteria(第2.0版)及威斯康辛大學綜合性癌中心用于IL-2分級量表(行為表現(xiàn)狀態(tài)、體重增加及溫度)進行分級。劑量限制性毒性(Dose-limiting toxicity；DLT)按發(fā)生3級或4級毒性而不是3級淋巴細胞減少、高膽紅素血癥、低磷酸鹽血或高血糖定義。最大耐受劑量(MTD)由在第1療程中六個患者中兩個患有DLT的劑量水平定義。3級治療相關毒性的患者在第2療程以50％劑量降低繼續(xù)治療前，需要恢復到至少1級。具有≥25％疾病進展的患者自研究中去除。具有穩(wěn)定疾病的患者施用第2療程。
在患者中評估了hu14.18-IL-2的藥物代謝動力學特性。在最初4小時輸注(第1療程，第1天)后立即對來自所有33個患者的系列樣本的hul4.18-IL-2水平進行評估時，發(fā)現(xiàn)半衰期為3.7小時(+/-SD為0.9小時)。這介于它的2個組分的半衰期之間(對IL-2大約為45分鐘及對嵌合m14.18抗體約為3天)，并與在小鼠中觀察到的嵌合m14.18-IL-2的半衰期是可比較的。自這些患者血清中清除hu14.18-IL-2后，不能檢測到IL-2及hu14.18抗體組分。第1療程期間，血清峰及曲線下面積(AUC)顯示顯著的劑量依賴性升高(p＜0.001)。
在本研究中對三十三個患者進行了治療。表1列出了臨床結果。兩個患者(6％)只完成第1療程3天中的前2天。在治療的第2天，這些患者中的一個(劑量水平3)患3級高膽紅素血癥，另一個患者(劑量水平6)患需要繼續(xù)治療的3級缺氧和低血壓。這兩個患者疾病有所發(fā)展，沒有接受治療的第二療程。十九個患者(58％)在治療的第一療程后疾病穩(wěn)定并接受治療的第二療程。由于第1療程的有害作用，五個患者(所有患者的15％)在第2療程需要降低50％劑量。十七個患者(所有患者的52％)完成了第2療程。一個患者(劑量水平4)在第2療程期間拒絕接受最終輸注，在第2療程期間一個患者(劑量水平6)由于低血壓保持最終輸注。在治療的第二療程后，八個患者(所有患者的24％)具有穩(wěn)定的疾病。結果表明在令人驚訝的大量患者中hu14.18-IL-2穩(wěn)定了疾病進程。
在治療的第2療程后，33個患者中八個疾病穩(wěn)定，在完成方案治療后，此8個患者中4個持續(xù)為無進展性疾病征象(1個疾病穩(wěn)定及3個無疾病征象)達20-52個月。
在復發(fā)或轉(zhuǎn)移的外科切除術后，參與研究的33個患者中5個無可檢測的疾病。此五個患者中的兩個有疾病進展，而其余3個患者持續(xù)無疾病征象(20-52個月)。此發(fā)現(xiàn)與低荷瘤患者中最可能自免疫治療介入中獲得臨床益處的假設一致。在治療的兩個療程后，另一患者在肺小結中具有客觀降低，但由于在遠結中的生長，總的疾病反應分類為疾病進展。在hu14.18-IL-2治療后將結切除并且患者在3年期間沒有疾病進展。
表1臨床結果
I期臨床試驗中通過hu14.18-IL-2的體內(nèi)免疫刺激對用hu14.18-IL-2治療的患者的免疫刺激指征也進行檢查。在第2-4天發(fā)生外周血淋巴細胞減少，接著在第5-22天恢復到淋巴細胞增多。此兩種變化為劑量依賴性(分別為p＜0.01及p＜0.05)。對第1療程在5、8、15及22天淋巴細胞計數(shù)顯著高于基線。對第2療程(療程1的29天)基線淋巴細胞計數(shù)比第1療程基線淋巴細胞計數(shù)升高，表明治療的第一療程的作用在29天仍存在。此外，對此12個患者，在第2療程期間的5、8及15天淋巴細胞計數(shù)高于在第1療程期間的5、8及15天的對應值。
hu14.18-IL-2治療第一周后，淋巴細胞表面表型顯示CD16+及CD56+淋巴細胞(自然殺傷(NK)細胞標記)增多。在第1療程的第29天(第2療程第1天)此作用仍存在。對于第19-33號患者(每天接受4.8-7.5mg/m2)，除第1天及第8天外，還在第15天及第22天，對淋巴細胞表面表型進行確定。此分析證明在第8、15及22天，CD56及CD56/CD16共表達細胞的增加保持顯著升高(p＜0.01)。
作為免疫活化的測量標記，獲得了第13-33號患者的C-反應性蛋白(CRP)水平并獲得了完成第1療程的31個患者的可溶性IL-2受體(sIL-2R)水平。與每個療程的基線相比，在第1療程及第2療程治療的第3-5天，存在平均CRP的顯著增加。到每個治療療程的第8天，此CRP的增加復原到基線水平。在第1療程及第2療程期間，hu14.18-IL-2輸注后開始24小時，sIL-2R水平比基線顯著增加，此增加持續(xù)到第8天。發(fā)現(xiàn)sIL-2R的增加是劑量依賴性的(p＝0.014)。對兩個療程中接受同樣劑量的患者，對第2療程的sIL-2R值與第1療程中的對應值相比增加1-5天(p＜0.05)。
將表達GD2并結合hu14.18-IL-2的LA-N-5成神經(jīng)細胞瘤細胞系用于評估來自完成第1療程的31個患者的外周血單核細胞(PBMC)中IL-2活化的NK功能及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。對此兩次測定，與第1天相比，自第8天通過淋巴細胞介導的殺傷顯著增加。接受如第1療程相同劑量的第2療程的12個患者，顯示與在第1療程期間獲得的ADCC結果非常相似。發(fā)現(xiàn)第2療程與第1療程不同的唯一參數(shù)為第1天在存在IL-2時殺傷增強，表明此測定中殺傷增強在第29天(第2療程，第1天)保持升高。
由于LA-N-5靶對新鮮NK細胞具有相對抗性，它用于測定IL-2增強的殺傷及ADCC。然而，由培養(yǎng)基(體外不添加IL-2)中新鮮PBMC介導LA-N-5的弱殺傷在第8天并不比第1天顯著地大。
在第1、8、15及22天，用NK易感的K562靶細胞系對第19-33號患者進行了標準NK測定。與第1天相比，在第8天及第22天，觀察到當在培養(yǎng)基中或在存在時IL-2檢測時，NK裂解K562靶細胞顯著增加。對來自經(jīng)選擇患者的血清樣本也進行評估以確定功能性IL-2活性及功能性抗-GD2抗體。
用hu14.18-IL-2輸注后獲得的患者血清顯示其對IL-2反應性Tf-lb細胞系存在經(jīng)IL-2誘導的增殖。在輸注4小時后，最初4小時期間看到增殖的進展性增加。到此輸注后16小時，值復原到基線，與hu14.18-IL-2大約4小時的血清半衰期一致。通過流式細胞術對來自此時間點的血清樣本也檢查保留IL-2組分及其抗GD2抗體活性的完整hu14.18-IL-2免疫細胞因子(IC)的存在。在IC輸注后，在患者血清樣本中可檢測到能結合M21細胞系(GD2陽性)的hu14.18-IL-2。在4小時輸注后的最初4小時期間，能結合M21的IC量進行性增加，然后降低，也與約4小時的半衰期一致。最后，用來自患者的樣本進行體外測定以確定施用hu14.18-IL-2導致的體內(nèi)情況是否與需要實現(xiàn)ADCC一致。當將hu14.18-IL-2加入到細胞毒性測定時，來自第8天的PBMC顯示對GD2+靶細胞的ADCC增強。來自第8天的PBMC進行與此相同的ADCC測定，然而，不是向測定中加入hu14.18-IL-2，而是加入在hu14.18-IL-2施用前或施用后獲得的來自患者的血清。與在輸注前獲得的血清觀察到的結果相比，在經(jīng)施用hu14.18-IL-2后獲得的血清中存在時，第2療程第8天獲得自患者的PBMC能介導殺LA-N-5細胞系作用增強。因此IV施用后，患者中循環(huán)的hu14.18-IL-2能通過來自同一患者的hu14.18-IL-2體內(nèi)活化的PBMC促進ADCC。
總之，這些結果表明存在與此hu14.18-IL-2治療相關的免疫學變化，所述免疫學變化包括淋巴細胞計數(shù)增加、CD16+及CD56+PBMC的百分數(shù)增加、NK裂解增加及ADCC增加。免疫活化的其它證據(jù)包括CRP及sIL-2R的血清水平增加。血清及PBMC的實驗室分析顯示IV施用后，患者血清中循環(huán)的hu14.18-IL-2分子保持通過IL-2受體活化IL-2反應性細胞的能力、保持結合GD2陽性腫瘤細胞的能力以及向它們表面遞送IL-2的能力，如通過流式細胞術檢測到的。NK細胞的體內(nèi)活化是基于它們體外介導NK及ADCC功能的能力。此外，由施用于這些患者的hu14.18-IL-2體內(nèi)活化的NK細胞能通過這些同一患者血清中循環(huán)的hu14.18-IL-2的促進而介導ADCC。因此，在此研究中在所有患者中達到了達到免疫活化的情況。
序列表<110>默克專利有限公司<120>與GD2結合的小鼠14.18抗體的人源化抗體(H14.18)以及其與IL-2的融合<130>LEX-023<150>US 60/433,945<151>2002-12-17<160>6<170>patentIn版本3.1<210>1<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)<400>1Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg20 25 30Ash Gly Ash Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile His Lys Val Ser Ash Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser85 90 95Thr His Val Pro Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu100 105 110
Lys<210>2<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化免疫球蛋白重鏈可變區(qū)<400>2Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Glu Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr20 25 30Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met His Leu Lys Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser100 105 110Ser<210>3<211>15<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>連接子序列<400>3Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>4<211>10531<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>含有人源化免疫球蛋白輕鏈和重鏈以及IL-2的載體<400>4gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata60gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc120ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag180ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac240atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg300cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg360tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat420agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt480tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc540aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta600cagaacccac tgcttaactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagaccctc
660tagaatgaag ttgcctgtta ggctgttggt gctgatgttc tggattcctg gtgaggagag720agggaagtga gggaggagaa tggacaggga gcaggagcac tgaatcccat tgctcattcc780atgtatctgg catgggtgag aagatgggtc ttatcctcca gcatggggcc tctggggtga840atacttgtta gagggaggtt ccagatggga acatgtgcta taatgaagat tatgaaatgg900atgcctggga tggtctaagt aatgccttag aagtgactag acacttgcaa ttcacttttt960ttggtaagaa gagattttta ggctataaaa aaatgttatg taaaaataaa cgatcacagt1020tgaaataaaa aaaaaatata aggatgttca tgaattttgt gtataactat gtatttctct1080ctcattgttt cagcttcctt aagcgacgtg gtgatgaccc agacccccct gtccctgccc1140gtgacccccg gcgagcccgc ctccatctcc tgcagatcta gtcagagtct tgtacaccgt1200aatggaaaca cctatttaca ttggtacctg cagaagccag gccagtctcc aaagctcctg1260attcacaaag tttccaaccg attttctggg gtcccagaca ggttcagtgg cagtggatca1320gggacagatt tcacactcaa gatcagcaga gtggaggctg aggatctggg agtttatttc1380tgttctcaaa gtacacatgt tcctccgctc acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg1440aaacgtatta gtgtgtcagg gtttcacaag ag ggactaaa gacatgtcag ctatgtgtga1500ctaatggtaa tgtcactaag ctgcgggatc ccgcaattct aaactctgag ggggtcggat1560gacgtggcca ttctttgcct aaagcattga gtttactgca aggtcagaaa agcatgcaaa1620gccctcagaa tggctgcaaa gagctccaac aaaacaattt agaactttat taaggaatag1680
ggggaagcta ggaagaaact caaaacatca agattttaaa tacgcttctt ggtctccttg1740ctataattat ctgggataag catgctgttt tctgtctgtc cctaacatgc cctgtgatta1800tccgcaaaca acacacccaa gggcagaact ttgttactta aacaccatcc tgtttgcttc1860tttcctcagg aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt1920tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca1980aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag2040agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag2100actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg2160tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt agagggagaa gtgcccccac ctgctcctca2220gttccagcct gaccccctcc catcctttgg cctctgaccc tttttccaca ggggacctac2280ccctattgcg gtcctccagc tcatctttca cctcaccccc ctcctcctcc ttggctttaa2340ttatgctaat gttggaggag aatgaataaa taaagtgaat ctttgcacct gtggtttctc2400tctttcctca atttaataat tattatctgt tgtttaccaa ctactcaatt tctcttataa2460gggactaaat atgtagtcat cctaaggcgc ataaccattt ataaaaatca tccttcattc2520tattttaccc tatcatcctc tgcaagacag tcctccctca aacccacaag ccttctgtcc2580tcacagtccc ctgggccatg gtaggagaga cttgcttcct tgttttcccc tcctcagcaa2640gccctcatag tcctttttaa gggtgacagg tcttacggtc atatatcctt tgattcaatt2700
ccctgggaat caaccaaggc aaatttttca aaagaagaaa cctgctataa agagaatcat2760tcattgcaac atgatataaa ataacaacac aataaaagca attaaataaa caaacaatag2820ggaaatgttt aagttcatca tggtacttag acttaatgga atgtcatgcc ttatttacat2880ttttaaacag gtactgaggg actcctgtct gccaagggcc gtattgagta ctttccacaa2940cctaatttaa tccacactat actgtgagat taaaaacatt cattaaaatg ttgcaaaggt3000tctataaagc tgagagacaa atatattcta taactcagca atcccacttc tagggtcgat3060cgacgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt3120catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga3180ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca3240atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca3300gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg3360cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc3420tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt3480ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt3540ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg3600acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tctctggcta3660actacagaac ccactgctta actggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac3720ccaagctcct cgaggctaga atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga
3780ttcctggtga ggagagaggg aagtgaggga ggagaatgga cagggagcag gagcactgaa3840tcccattgct cattccatgt atctggcatg ggtgagaaga tgggtcttat cctccagcat3900ggggcctctg gggtgaatac ttgttagagg gaggttccag atgggaacat gtgctataat3960gaagattatg aaatggatgc ctgggatggt ctaagtaatg ccttagaagt gactagacac4020ttgcaattca ctttttttgg taagaagaga tttttaggct ataaaaaaat gttatgtaaa4080aataaacgat cacagttgaa ataaaaaaaa aatataagga tgttcatgaa ttttgtgtat4140aactatgtat ttctctctca ttgtttcagc ttccttaagc gaggtgcagc tggtgcagtc4200cggcgccgag gtggagaagc ccggcgcctc cgtgaagatc tcctgcaagg cctccggctc4260ctccttcacc ggctacaaca tgaactgggt gcgccagaac atcggcaagt ccctggagtg4320gatcggcgcc atcgacccct actacggcgg cacctcctac aaccagaagt tcaagggccg4380cgccaccctg accgtggaca agtccacctc caccgcctac atgcacctga agtccctgcg4440ctccgaggac accgccgtgt actactgcgt gtccggcatg gagtactggg gccagggcac4500ctccgtgacc gtgtcctccg gtaagctttt ctggggcagg ccaggcctga ccttggcttt4560ggggcaggga gggggctaag gtgaggcagg tggcgccagc caggtgcaca cccaatgccc4620atgagcccag acactggacg ctgaacctcg cggacagtta agaacccagg ggcctctgcg4680ccctgggccc agctctgtcc cacaccgcgg tcacatggca ccacctctct tgcagcctcc4740accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca4800
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac4860tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc4920tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc4980tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttgg tgagaggcca5040gcacagggag ggagggtgtc tgctggaagc caggctcagc gctcctgcct ggacgcatcc5100cggctatgca gtcccagtcc agggcagcaa ggcaggcccc gtctgcctct tcacccggag5160gcctctgccc gccccactca tgctcaggga gagggtcttc tggctttttc cccaggctct5220gggcaggcac aggctaggtg cccctaaccc aggccctgca cacaaagggg caggtgctgg5280gctcagacct gccaagagcc atatccggga ggaccctgcc cctgacctaa gcccacccca5340aaggccaaac tctccactcc ctcagctcgg acaccttctc tcctcccaga ttccagtaac5400tcccaatctt ctctctgcag agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg5460cccaggtaag ccagcccagg cctcgccctc cagctcaagg cgggacaggt gccctagagt5520agcctgcatc cagggacagg ccccagccgg gtgctgacac gtccacctcc atctcttcct5580cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca5640ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag5700accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa5760agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc5820
accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag5880cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aaggtgggac ccgtggggtg cgagggccac5940atggacagag gccggctcgg cccaccctct gccctgagag tgaccgctgt accaacctct6000gtccctacag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc acgggaggag6060atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc6120gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg6180ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg6240cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg6300cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa gccccaactt caagttctac aaagaaaaca6360cagctgcaac tggagcatct cctgctggat ctccagatga ttctgaatgg aattaacaac6420tacaagaatc ccaaactcac caggatgctc acattcaagt tctacatgcc caagaaggcc6480acagagctca aacatctcca gtgtctagag gaggaactca aacctctgga ggaagtgcta6540aacctcgctc agagcaaaaa cttccactta agacctaggg acttaatcag caatatcaac6600gtaatagttc tggaactaaa gggatccgaa acaacattca tgtgtgaata tgctgatgag6660acagcaacca ttgtagaatt tctgaacaga tggattacct tttgtcaaag catcatctca6720acactaactt gataattaag tgctcgaggg atccagacat gataagatac attgatgagt6780ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg6840ctattgcttt atttgtaacc attagaagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca
6900ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc6960tctacaaatg tggtatggct gattatgatc ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga7020aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg7080gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat7140gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc atcagagcag7200attgtactga gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa7260taccgcatca ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg7320ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg7380gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag7440gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga7500cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct7560ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc7620tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg7680gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc7740tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca7800ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag7860ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct7920
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc7980accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga8040tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca8100cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat8160taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac8220caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt8280gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt8340gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag8400ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct8460attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt8520gttgccattg ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc8580tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt8640agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg8700gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg8760actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct8820tgcccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc8880attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt8940
tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt9000tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg9060aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat9120tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg9180cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta9240acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc aagaattccg atccagacat9300gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt9360tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attagaagct gcaataaaca9420agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt9480tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtatggct gattatgatc taaagccagc9540aaaagtccca tggtcttata aaaatgcata gctttcggag gggagcagag aacttgaaag9600catcttcctg ttagtctttc ttctcgtaga ccttaaattc atacttgatt cctttttcct9660cctggacctc agagaggacg cctgggtatt ctgggagaag tttatatttc cccaaatcaa9720tttctgggaa aaacgtgtca ctttcaaatt cctgcatgat ccttgtcaca aagagtctga9780ggtggcctgg ttgattcatg gcttcctggt aaacagaact gcctccgact atccaaacca9840tgtctacttt acttgccaat tccggttgtt caataagtct taaggcatca tccaaacttt9900tggcaagaaa atgagctcct cgtggtggtt ctttgagttc tctactgaga actatattaa9960ttctgtcctt taaaggtcga ttcttctcag gaatggagaa ccaggttttc ctacccataa
10020tcaccagatt ctgtttacct tccactgaag aggttgtggt cattctttgg aagtacttga10080actcgttcct gagcggaggc cagggtcggt ctccgttctt gccaatcccc atattttggg10140acacggcgac gatgcagttc aatggtcgaa ccatgagggc accaagctag ctttttgcaa10200aagcctaggc ctccaaaaaa gcctcctcac tacttctgga atagctcaga ggccgaggcg10260gcctcggcct ctgcataaat aaaaaaaatt agtcagccat ggggcggaga atgggcggaa10320ctgggcggag ttaggggcgg gatgggcgga gttaggggcg ggactatggt tgctgactaa10380ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacacctg10440gttgctgact aattgagatg catgctttgc atacttctgc ctgctgggga gcctggggac10500tttccacacc ctaactgaca cacattccac a10531<210>5<211>220<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化免疫球蛋白輕鏈<400>5Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly1 5 10 15Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg20 25 30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile His Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser85 90 95Thr His Val Pro Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu100 105 110Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp115 120 125Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn130 135 140Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu145 150 155 160Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp165 170 175Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr180 185 190Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser195 200 205Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys210 215 220<210>6<211>575<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人源化免疫球蛋白重鏈和IL-2
<400>6Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Glu Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ser Phe Thr Gly Tyr20 25 30Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Asn Ile Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Ala Ile Asp Pro Tyr Tyr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met His Leu Lys Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Val Ser Gly Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser100 105 110Ser Ala Sar Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser115 120 125Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp130 135 140Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Ash Ser Gly Ala Leu Thr145 150 155 160Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr165 170 175Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln180 185 190Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp195 200 205
Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro210 215 220Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro225 230 235 240Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr245 250 255Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn260 265 270Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg275 280 285Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val290 295 300Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser305 310 315 320Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys325 330 335Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu340 345 350Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe355 360 365Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu370 375 380Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe385 390 395 400Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr420 425 430Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser435 440 445Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln450 455 460Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg465 470 475 480Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys485 490 495His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu500 505 510Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile515 520 525Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr530 535 540Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu545 550 555 560Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr565 570 57權利要求
1.抗體可變區(qū)，其包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2.抗體可變區(qū)，其包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.權利要求2所述的抗體可變區(qū)，其進一步包含SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
4.權利要求3所述的抗體可變區(qū)，其中氨基酸序列通過二硫鍵連接。
5.權利要求3所述的抗體可變區(qū)，其中氨基酸序列通過肽鍵連接。
6.包含氨基酸序列的抗體可變區(qū)，其中所述氨基酸序列選自SEQ IDNO1的第1-23位氨基酸、SEQ ID NO2的第1-25位氨基酸及SEQ IDNO2的第67-98位氨基酸，其中抗體可變區(qū)與GD2特異結合。
7.權利要求6所述的抗體可變區(qū)，其中氨基酸序列包括SEQ ID NO1的第1-23位氨基酸。
8.權利要求6所述的抗體可變區(qū)，其中氨基酸序列包括SEQ ID NO2的第1-25位氨基酸。
9.權利要求6所述的抗體可變區(qū)，其中氨基酸序列包括SEQ ID NO2的第67-98位氨基酸。
10.多肽，其包含根據(jù)前述權利要求中任意一項所述的抗體可變區(qū)和至少含有CH2結構域的Fc部分。
11.權利要求10所述的多肽，其中Fc部分衍生自IgG1。
12.核酸，其編碼根據(jù)權利要求1-9中任意一項所述的抗體可變區(qū)或根據(jù)權利要求10或11所述的多肽。
13.細胞，其包含權利要求12所述的核酸。
14.用于靶向在其表面具有GD2的細胞的方法，所述方法包括施用根據(jù)權利要求1-9中任意一項所述的抗體可變區(qū)或根據(jù)權利要求10或11所述的多肽。
15.權利要求14所述的方法，其中細胞為腫瘤細胞。
16.融合蛋白，其包含與非免疫球蛋白部分連接的根據(jù)權利要求1-9中任意一項所述的抗體可變區(qū)或與非免疫球蛋白部分連接的根據(jù)權利要求10或11所述的多肽。
17.根據(jù)權利要求16所述的融合蛋白，其中非免疫球蛋白部分為細胞因子。
18.根據(jù)權利要求17所述的融合蛋白，其中細胞因子選自白細胞介素、造血因子、淋巴因子、干擾素及趨化因子。
19.權利要求18所述的融合蛋白，其中白細胞介素選自白細胞介素-2(IL-2)及白細胞介素-12(IL-12)。
20.權利要求18所述的融合蛋白，其中造血因子為粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。
21.權利要求18所述的融合蛋白，其中淋巴因子為淋巴毒素。
22.權利要求18所述的融合蛋白，其中干擾素選自干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ。
23.權利要求16所述的融合蛋白，其進一步包含第二種非免疫球蛋白部分。
24.權利要求23所述的融合蛋白，其中融合蛋白包含IL-2及IL-12。
25.權利要求12所述的核酸或權利要求13所述的細胞的用途，用于制備藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了能結合人細胞表面鞘糖脂GD2的人源化抗體H14.18?？贵w包含當向人施用時降低它們的免疫原性的經(jīng)修飾可變區(qū)，更具體地，為經(jīng)修飾的構架區(qū)。所述抗體可與治療劑如IL－2偶聯(lián)并在治療癌中應用。
文檔編號C07K16/46GK1726227SQ200380106522
公開日2006年1月25日 申請日期2003年12月16日 優(yōu)先權日2002年12月17日
發(fā)明者S·D·吉利斯, 勞健明 申請人:默克專利有限公司