專利名稱：一種利用基因重組技術制造丙酰,乙酰螺旋霉素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因重組技術獲得丙酰螺旋霉素，乙酰螺旋霉素的制造方法。
丙酰螺旋霉素和乙酰螺旋霉素是一種治療革蘭氏陽性菌感染有效的抗生素。乙酰螺旋霉素是由化學半合成方法制造，現(xiàn)已投入生產，廣泛應用于臨床。日本專利(52-82790)曾報導用微生物方法轉化螺旋霉素為酰化螺旋霉素，我國曾報導利用麥迪霉素產生菌無活性變株對螺旋霉素進行微生物轉化獲得丙酰螺旋霉素。用化學方法改造螺旋霉素除有環(huán)境污染的缺點外，且酰化反應定向差，當進行4″-羥基?；瘯r，2′-羥基也同時被酰化，以致影響產品的質量。微生物轉化則需要先制造螺旋霉素再進行轉化，工藝繁瑣，且轉化率有一定限制(75～80%)。利用基因重組技術制造丙酰螺旋霉素和乙酰螺旋霉素至今未見文獻報導(附情報所文獻檢索結果)，也沒有同樣的發(fā)明申請過專利(附中國專利局檢索結果)。
本發(fā)明的目的在于利用基因重組技術獲得直接生產丙酰螺旋霉素和乙酰螺旋霉素的基因工程菌。本方法?；磻ㄏ蛐院?，可以簡化化學方法制造酰化螺旋霉素及微生物轉化方法制造丙酰螺旋霉素的生產工藝，并可避免化學法所造成的環(huán)境污染，使生產成本降低，獲得較大的社會經濟效益。
本發(fā)明的內容與要點分述如下一、麥迪霉素4″?；D移酶基因的克隆首先建立了麥迪霉素產生菌生米卡鏈霉菌(Str.mycarofaciens 1748)的基因文庫，將麥迪霉素產生菌的總DNA用Mbol限制性內切酶部分酶切，在蔗糖密度梯度溶液中離心，收集30-40kb的DNA片段，粘粒載體pNJ1用Bgl11酶切，并用堿性磷酸酶處理。在T4連接酶作用下，載體與插入片段相連，用噬菌體包裝蛋白在體外包裝，繼而感染大腸桿菌DH-1，得到1700個左右菌落。提取其中的質粒DNA，并進行酶切分析，確定90%以上為重組DNA，含插入DNA片段30-45kb左右。根據(jù)鏈霉菌染色體分子量估測為10000kb，所建立基因文庫可以概括麥迪霉素產生菌基因組的95%以上。
用碳霉素產生菌4″-異戊酰轉移酶基因為探針，與麥迪霉素產生菌基因文庫進行菌落雜交，得到陽性菌落PCN10F5DNA，Southern分子雜交實驗證明，PCN10F5DNA的BamH1-BamH18.0kb為同源片段。分離PCN10F5DNA的BamH1-BamH18.0kb片段，并與plJ680(分子量為5.3kb)載體相連，通過DNA轉化，從變青鏈霉菌(Str.lividans)TK24轉化子中得到含重組質粒p6F5的克隆。通過酶切分析，確證重組DNA中含BamH1-BamH18.0kb的插入片段，分子量為13.3kb。限制性內切酶酶切圖見(圖1)。
二、麥迪霉素4″-?；D移酶基因在螺旋霉素產生菌中的表達首先將螺旋霉素產生菌(Str.spiramyceticus 371)菌種斜面，挖塊接種到培養(yǎng)基[蔗糖10.3%，K2SO40.025%，MgCl2·6H2O 1.012%，葡萄糖1.0%，胰胨0.1-0.3%，酪蛋白氨基酸0.05-0.3%，蛋白胨0.2%，酵母浸出物0.2-0.5%，K2PO40.1-0.7% 10ml/L，三羥甲基氨基甲烷0.1-0.3M(PH6-8)100ml/L，微量元素溶液(ZnCl20.04%，F(xiàn)ecl3·6H2O 0.02%，CuCl2·2H2O 0.001%，Mncl2·4H2O 0.001%，NaB407·10H2O 0.001%)2ml/L，NaOH 0.5N-2N 2-10ml/L]中，裝量為30-50ml/250ml三角瓶，27-32℃培養(yǎng)2-4天。以2.5-10%接種量轉種上述同樣培養(yǎng)基中，并加入0.1-1%甘氨酸，在同樣條件下培養(yǎng)16-36小時，收集菌體，再用10.3%蔗糖溶液洗滌菌體2-3次，在含溶菌酶0.5-3mg/ml P溶液(三羥甲基氨基甲烷0.25-0.4% PH 8.0 Cacl22H2O 0.25-0.4%，Mgcl26H2O 0.1-0.3%，蔗糖10.3%，葡萄糖1% PH 7.0-8.0)中，28-38℃條件下溶菌15-60分鐘，獲得原生質體。重組質粒p6F5 DNA在濃度為15-50%的PEG媒介下轉化原生質體，獲得含重組質粒DNA的克隆菌株。用BamH1-BamH18.0kb DNA片段作為探針，與克隆菌株的總DNA和質粒DNA進行Southern分子雜交，確證含有重組質粒DNA。含重組質粒的螺旋霉素克隆菌株在一定發(fā)酵培養(yǎng)條件下，產生對八疊球菌有抗菌活性的物質，對產物的薄層層析證明，其遷移值與標準丙酰螺旋霉素相似(圖2)。
三、麥迪霉素4″-?；D移酶基因在螺旋霉素產生菌中表達產物-丙酰，乙酰螺旋霉素的鑒別從含麥迪霉素4″-酰基轉移酶基因的螺旋霉素產生菌克隆菌株的發(fā)酵液中，分離到一種螺旋霉素酰化產物，經紫外光譜，高壓液相層析，質譜及核磁共振等化學分析鑒別為丙酰螺旋霉素Ⅲ，丙酰螺旋霉素Ⅱ(及其同分異構體乙酰螺旋霉素Ⅲ)，乙酰螺旋霉素Ⅱ，其部分理化性質的有關數(shù)據(jù)見(表一)結構式見圖8，紫外吸收光譜見(圖3)，高壓液相層析圖譜見(圖4)，紅外吸收光譜-丙酰螺旋霉素Ⅲ見(圖5)，F(xiàn)D質譜結果見(圖6)。
組份Ⅰ由FD質譜測得基峰為977(M+-Na+)，故其分子量為954，由FD及EIMS所得碎片峰分析201碎片峰表明，在碳霉糖4″位上接有丙?；?，故組份Ⅰ為丙酰螺旋霉素Ⅲ。
組份Ⅱ由FD質譜測得基峰為962(M+-H+Na+)，故其分子量為940，又根據(jù)FD及EIMS所得碎片峰分析，186(M+-H)碎片峰表明4″位上為乙?；?，200(M+-H)碎片峰4″位則為丙?；?，故組份Ⅱ為同分異構體，丙酰螺旋霉素Ⅱ和乙酰螺霉素Ⅲ的混合物。
組分Ⅲ由FD質譜測得基峰為946(M+-H+Na+)故其分子量為926，又根據(jù)FD及EIMS所得碎片峰分析，186(M+-H)碎片峰表明4″位上為乙?；式M分Ⅲ為乙酰螺旋霉素Ⅱ。
克隆菌株產物丙酰螺旋霉素Ⅲ的核磁共振1H譜(AM-500)見[圖7(1)]，13C譜(AM-500)見[圖7(2)]，丙酰螺旋霉素Ⅱ，乙酰螺旋霉素Ⅱ的1H譜(AM-500)分別見[圖7(3)，(4)]。丙酰螺旋霉素Ⅲ的13C(AM-500)碳原子化學位移的數(shù)據(jù)和文獻資料對照的結果見(表2)。
(表2)數(shù)據(jù)表明，克隆菌株產物中丙酰螺旋霉素Ⅲ和文獻中報導的碳原子的化學位移是吻合的。其中9.3，27.7，170.9 PPM為丙?；幕瘜W位移，并根據(jù)質譜碎片峰201m/e，表明其丙酰基接在4″-0-位上。
四、基因工程丙酰、乙酰螺旋霉素的制造方法含麥迪霉素4″-?；D移酶基因的螺旋霉素產生菌克隆菌株，在含5-30ug/ml硫鏈絲菌素的黃豆餅粉-淀粉培養(yǎng)基上，于25-35℃培養(yǎng)5-14天，用挖塊法接種于種子培養(yǎng)基(葡萄糖0.5-2%，淀粉2-4%，黃豆餅粉1-3%，Nacl 0.4%，CaCO30.3-0.8%)，28℃培養(yǎng)40-80小時，以2.5-10%接種量種入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖 1-3%，淀粉2-6%，魚粉1-3%，玉米漿0.5-1.5%，NH4NO30.6%，KH2PO40.01-0.08% MgSO40.1%，NaCl 1.0%，CaCO30.3-0.6%)，26-30℃培養(yǎng)72-120小時，發(fā)酵液按圖9所述提取流程進行分離、提純。
一般發(fā)酵液中未酰化的螺旋霉素僅點7-8%。
丙酰、乙酰螺旋霉素的體內抗菌活性見(表三、四)。由結果可見，丙酰、乙酰螺旋霉素的體內外試驗對金黃色葡萄球菌、甲類鏈球菌、肺炎雙球菌抗菌效果較好，對某些菌如乙類鏈球菌A12，即使在體外試驗的抗菌效果與螺旋霉素、紅霉素等接近，但在體內試驗中表現(xiàn)出明顯優(yōu)越性，因此酰化螺旋霉素在體內外，尤其是在體內的抗菌效果優(yōu)于螺旋霉素。
本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果是利用基因工程菌，直接產生?；菪顾?，?；恢枚ㄏ?，產品質量可以保證，發(fā)酵與提取工藝與螺旋霉素相似，?；a物可達80-90%，并可避免化學半合成工藝的工序，降低成本，能較好地適應工業(yè)生產的要求。
表一麥迪霉素4″-?；富蛟诼菪顾禺a生菌中表達產物的理化性質組分 化合物名稱 分子式 分子量 熔點 旋光值 紫外吸收Ⅰ 丙酰螺旋霉素Ⅲ C49H82N2O16954 135～136C -52.7 232Ⅱ 丙酰螺旋霉素Ⅱ C48H80N2O16940 124～125C -68.0 232(乙酰螺旋霉素Ⅲ)Ⅲ 乙酰螺旋霉素Ⅱ C47H78N2O16926 135～137C -81.8 232＊[α]14D(C1.0，CHCl3)＊＊UVλMeOHmaxnm
表二、13C NMR中克隆菌株產物丙酰螺旋霉素Ⅲ和文獻資料中丙酰螺旋霉素Ⅲ(Pr-SPMⅢ)碳原子的化學位移碳原子 Pr-SPMⅢ 6F6Ⅲ 碳原子 Pr-SPMⅢ 6F6Ⅲ(PPM) (PPM) (PPM) (PPM)C-1 169.9 169.9 C-1′ 104.0 104.0C-2 37.2 37.3 C-2′ 69.2 69.2C-3 71.7 71.5 C-3′ 69.2 69.4C-4 77.8 77.8 C-4′ 74.9 76.7C-5 84.5 84.7 C-5′ 73.0 73.0C-6 28.9 29.0 C-6′ 19.0 19.0C-7 30.2 30.1 C-7′ 42.0 42.0C-8 31.9 32.0 C-8′ 42.0 42.0C-9 79.7 80.0 C-1″ 96.4 96.9C-10 126.7 126.6 C-2″ 41.0 41.0C-11 135.4 135.4 C-3″ 69.5 69.7C-12 132.3 132.4 C-4″ 76.4 77.0C-13 131.9 131.9 C-5″ 66.1 66.4C-14 40.6 40.6 C-6″ 18.3 18.2C-15 68.9 69.0 C-7″ 25.4 25.4C-16 20.3 20.3C-17 42.5 42.5 C-1′′′ 100.3 100.2C-18 201.3 201.3 C-2′′′ 31.2 31.0C-19 15.4 15.4 C-3′′′ 18.3 18.8C-20 170.8 107.9 C-4′′′ 64.9 64.9C-21 29.7 27.7 C-5′′′ 73.7 73.3C-21a 9.0 9.3 C-6′′′ 18.7 18.9C-22 62.4 62.4 C-7′′′ 41.0 41.6C-8′′′ 41.0 41.6碳原子位置參見圖8
表三、丙酰螺旋霉素、乙酰螺旋霉素的抗菌譜MIC(ug/ml)試驗菌丙酰螺 乙酰螺 螺旋霉 紅霉素旋霉素 旋霉素 素金黃色葡萄球菌 15 0.78 1.56 0.78 0.09金黃色葡萄球菌 209P 0.78 3.125 3.125 0.39金黃色葡萄球菌 83-0 0.78 3.125 3.125 0.045表皮葡萄球菌 26069 0.78 0.78 3.125 0.19表皮葡萄球菌 8710 0.78 3.125 0.19 25白色葡萄球菌 Y-7 1.56 3.125 1.56 0.19白色葡萄球菌 Y-14 1.56 3.125 1.56 0.39八疊球菌 0.19 0.19 0.19 0.045枯草桿菌 6633 0.78 1.56 0.78 0.09乙類鏈球菌 A12 0.78 0.78 0.78 0.19乙類鏈球菌 556 0.78 0.78 1.56 0.19乙類鏈球菌 Y-38 0.78 1.56 1.56 0.19乙類鏈球菌 Y-44 0.78 1.56 1.56 0.78甲類鏈球菌 32209 0.19 0.39 3.125 0.78甲類鏈球菌 10 0.19 0.39 0.19 0.19甲類鏈球菌 Y-68 0.78 3.125 3.125 3.125肺炎雙球菌 31109 0.78 0.78 0.39 25肺炎雙球菌 010064 0.19 0.39 0.19 25肺炎雙球菌 010069 0.19 0.39 0.19 12.5肺炎雙球菌 010074 0.19 0.39 0.19 12.5腸球菌 75-5 0.39 0.78 3.125 50腸球菌 75-10 0.19 0.78 6.25 100腸球菌 Y-63 100 100 100 100腸球菌 333 50 50 25 6.25
表四、丙酰螺旋霉素、乙酰螺旋霉素的體內活性(小鼠)ED 50mg/kg試驗菌丙酰螺旋霉素 乙酰螺旋霉素 螺旋霉素 紅霉素乙類鏈球菌556 15.28-14.38 23.8-21.64 29.6-28.5 60.4-60.1腸球菌75-5 17.12-18.16 17.77-20.5 9.97-11.92 26.08-36.7

圖1、重組質粒P6F5 DNA限制性內切酶圖譜圖2、含P6F5重組質粒螺旋霉素產生菌克隆菌株產物薄層層析生物顯跡圖1、丙酰螺旋霉素標準(對照)2、克隆菌株產物3、螺旋霉素標準(對照)圖3、克隆菌株產物的紫外吸收光譜1、乙酰螺旋霉素Ⅱ2、丙酰螺旋霉素Ⅱ3、丙酰螺旋霉素Ⅲ圖4、克隆菌株產物的高壓液相層析圖1、丙酰螺旋霉素Ⅲ，Ⅱ標準(對照)2、粗提品3、丙酰螺旋霉素Ⅲ4、丙酰螺旋霉素Ⅱ5、乙酰螺旋霉素Ⅱ標準(對照)6、乙酰螺旋霉素Ⅱ圖5、克隆菌株產物-丙酰螺旋霉素Ⅲ的紅外吸收光譜圖6、克隆菌株產物的質譜圖1、丙酰螺旋霉素Ⅲ2、丙酰螺旋霉素Ⅱ3、乙酰螺旋霉素Ⅱ圖7、克隆菌株產物的核磁共振圖譜1、丙酰螺旋霉素Ⅲ H-NMR2、丙酰螺旋霉素Ⅲ C-NMR3、丙酰螺旋霉素Ⅱ H-NMR4、乙酰螺旋霉素Ⅱ H-NMR圖8、丙酰螺旋霉素Ⅲ結構(碳原子位置圖)圖9、發(fā)酵液提取流程圖
權利要求
1.一種利用基因工程技術制造丙酰、乙酰螺旋霉素的方法，其特征在于所說的丙酰、乙酰螺旋霉素，是利用碳霉素4″-異戊酰基轉移酶基因獲得麥迪霉素4″-?；D移酶基因，將麥迪霉素4″-?；D移酶基因轉入螺旋霉素產生菌，再將含麥迪霉素4″-?；D移酶基因的螺旋霉素產生菌克隆菌株進行培養(yǎng)、發(fā)酵和提取而得到的。
2.按照權利要求1所說的制造方法，其特征是以碳霉素產生菌4″-異戊?；D移酶基因為探針，與麥迪霉素產生菌基因文庫進行菌落雜交及分子雜交，獲得與之同源的麥迪霉素4″-?；D移酶基因。
3.按照權利要求1所說的制造方法，其特征是用含麥迪霉素4″-酰基轉移酶基因的重組質粒，在濃度為20-40%的PEG媒介下轉化螺旋霉素產生菌的原生質體。
4.按照權利要求1所說的制造方法，其特征在于將含麥迪霉素4″-?；D移酶基因的螺旋霉素產生菌克隆菌株，在加有5-20ug/ml硫鏈絲菌素的黃豆餅粉-淀粉斜面培養(yǎng)基上，于25-35℃下培養(yǎng)5-14天。
全文摘要
本發(fā)明是利用基因重組技術，使麥迪霉素4″-酰基轉移酶基因在螺旋霉素產生菌中得到表達。經過對表達產物理化性質的分析，證實該基因工程菌產生4″-丙酰螺旋霉素III，4″-丙酰螺旋霉素II，4″-乙酰螺旋霉素III的4″-乙酰螺旋霉素II，?；菪顾氐捏w內外抗菌活性優(yōu)于螺旋霉素。用本發(fā)明所述方法制造上述?；菪顾?，?；恢枚ㄏ蛐院?，工藝簡便，產品質量可以保證，更加適應工業(yè)生產的需求。
文檔編號C12N15/09GK1062763SQ9010602
公開日1992年7月15日 申請日期1990年12月26日 優(yōu)先權日1990年12月26日
發(fā)明者王以光, 金蓮舫, 曾應, 余蘭香 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術研究所