專利名稱：克隆有丙?；富虻穆菪顾劓溍咕臉?gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域。
丙酰螺旋霉素是一種新藥，目前尚未用于臨床，但是據(jù)藥理實(shí)驗(yàn)初步結(jié)果看，體內(nèi)外抗菌活性優(yōu)于目前臨床使用的乙酰螺旋霉素，目前尚無(wú)產(chǎn)品。當(dāng)前獲得丙酰螺旋霉素可以采用下列方法1.生物轉(zhuǎn)化法中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所劉若瑩教授在中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?7104407中介紹一種生物轉(zhuǎn)化法，該法基本上將具有丙?；富钚缘纳卓ㄦ溍咕冎暝?8℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，于培養(yǎng)液中加入螺旋霉素，在菌株的丙?；缸饔孟?，使螺旋霉素生物轉(zhuǎn)化成為丙酰螺旋霉素。
采用上述生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵方法獲得丙酰螺旋霉素時(shí)，可以減少因化學(xué)合成所造成的三廢污染;可以將具有丙?；富钚缘纳卓ㄦ溍咕苽涑晒滔嗷?xì)胞，從而提高生物轉(zhuǎn)化率，有利于工業(yè)生產(chǎn)。但此法存在著缺點(diǎn)，它必須通過發(fā)酵獲得螺旋霉素，才能進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，因此工藝復(fù)雜，成本較高。
2.半合成方法采用半合成方法使螺旋霉素4″-0丙?；?，從而獲得丙酰螺旋霉素，該法需先通過發(fā)酵獲得螺旋霉素后再用化學(xué)方法，在保護(hù)其它位點(diǎn)情況下進(jìn)行半合成，因此，工藝仍很復(fù)雜，成本高，有三廢污染，且目前尚無(wú)報(bào)導(dǎo)。
3.基因工程方法目前有人采用其它基因克隆路線(尚未發(fā)表)，將生米卡鏈霉菌的酰化酶基因克隆至螺旋霉素產(chǎn)生菌株中，但得到的產(chǎn)物成分較多，除螺旋霉素外，還有乙酰螺旋霉素和丙酰螺旋霉素以及其它?；煞荨Ｓ捎诙嘟M份，為化學(xué)提取和使用均帶來很大困難，從而直接影響經(jīng)濟(jì)效益，目前未有報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明目的在于采用基因工程方法，構(gòu)建一種可直接產(chǎn)生丙酰螺旋酶素的基因工程菌，只需將其一次發(fā)酵即可獲得丙酰螺旋霉素產(chǎn)品，從而簡(jiǎn)化生產(chǎn)步驟，可使丙酰螺旋霉素占產(chǎn)物總組成的20%以上并減少生產(chǎn)過程中的三廢污染。
本發(fā)明目的是這樣達(dá)到的將有丙酰化酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至螺旋霉素生產(chǎn)菌株，選擇出所需轉(zhuǎn)化子，再經(jīng)原位雜交即可獲得丙酰螺旋霉素基因工程菌，即克隆有丙?；富虻穆菪顾劓溍咕?。
以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
附

圖1是克隆有丙?；富虻穆菪顾劓溍咕臉?gòu)建步驟方框圖;
附圖2是丙?；富蚩寺【?Streptomyces lividans TK 54 No.9菌株)孢子絲;
附圖3是No.9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物薄層層析圖;
附圖4是No.9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物生物顯跡圖;
附圖5是丙酰螺旋霉素高壓液相色譜;
附圖6是NO.9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高壓液相色譜;
附圖7為Southern分子雜交圖;
附圖8是NO.9重組質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶圖譜;
附圖9是原位雜交放射自顯影圖;
附圖10是Southern分子雜交圖;
附圖11圖No.61轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)物薄層層析圖;
附圖12為NO.61轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)物生物顯跡圖;
附圖13是丙酰螺旋霉素高壓液相色譜;
附圖14是NO.61轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)物高壓液相色譜;
附圖15是丙酰螺旋霉素質(zhì)譜分析圖;
附圖16是NO.61轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)譜分析圖;
附圖17是丙酰螺旋霉素基因工程菌孢子絲照片;
附圖18為丙酰螺旋霉素基因工程菌孢子(1×12000);
附圖19為丙酰螺旋霉素結(jié)構(gòu)示意圖。
附圖1是本發(fā)明克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素鏈霉菌(也稱丙酰螺旋霉素基因工程菌)構(gòu)建步驟方框圖。
從附圖1可見，第一步驟是鳥槍克隆，其原理是以研究任何生物體的基因?yàn)閷?duì)象，將酶切后的不同大小、簡(jiǎn)單或復(fù)雜的基因經(jīng)載體帶入特定受體菌中，并進(jìn)行分離、篩選、純化和擴(kuò)增。在鳥槍克隆法中，以質(zhì)粒PIJ702為載體，它具有硫鏈絲菌素抗性基因和黑色素基因，因此，一旦插入外源基因后極易選擇，且拷貝數(shù)高，易于制備，若選用其它質(zhì)粒作載體則難以選擇轉(zhuǎn)化子。在鳥槍克隆法中將限制性內(nèi)切酶BglⅡ酶切過的生米卡鏈霉菌(Streptomyces mycarofaciens)總DNA經(jīng)T4-DNA連接酶進(jìn)行連接;第二步驟是轉(zhuǎn)化，重組后的質(zhì)粒被引入受體菌中，引入的步驟稱之為轉(zhuǎn)化。本發(fā)明將上述連接過的DNA轉(zhuǎn)化至變鉛青鏈霉菌TK54(S·lividans TK 54)原生質(zhì)體;第三步驟為挑選轉(zhuǎn)化子及提取重組質(zhì)粒，先選擇抗硫鏈絲菌素的轉(zhuǎn)化子，即以硫鏈絲菌素為選擇標(biāo)記，挑選耐藥轉(zhuǎn)化子，然后提取重組質(zhì)粒，選出生米卡鏈霉菌No.9重組質(zhì)粒;第四步驟為含丙?；富虻纳卓ㄦ溍咕鶱o.9重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，該No.9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至螺旋霉素產(chǎn)生菌株(Streptomyces spiramyceticus)，以硫鏈絲菌素為轉(zhuǎn)化子選擇標(biāo)記;第五步驟為挑選克隆有NO.9重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，先選擇抗硫鏈絲菌素的菌落，然后進(jìn)行原位雜交，采用“分子克隆”手冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，以P32-標(biāo)記的NO.9重組質(zhì)粒為探針，對(duì)上述轉(zhuǎn)化子進(jìn)行原位雜交，從中選擇，得到陽(yáng)性雜交菌落。
以下對(duì)各步驟進(jìn)行詳細(xì)說明。
(一)鳥槍克隆1.含有丙?；富虻纳卓ㄦ溍咕鸁o(wú)活性變株(Streptomyces mycarofaciens)總DNA的分離基本上采用Sambrook方法(Sambrook，J.et alMolecular cloning.A laboratory Manual.Seccond Edition.Cold Spring.Horbour.P1.42，1989)，生米卡鏈霉菌生長(zhǎng)于26～28℃，采用SGYS培養(yǎng)基培養(yǎng)48～50小時(shí)(淀粉2～4%;硫酸胺0.3%;蛋白胨0.3-0.5%;葡萄糖2%;酵母膏0.5%;磷酸氫二鉀0.05%;硫酸鎂0.02%;碳酸鈣0.5%自然PH)，于4℃～10℃離心(3000轉(zhuǎn)/分)去上清液得濕菌絲2克左右，加入3-5ml的Saline-EDTA緩沖液(0.15MNaCl，0.01MEDTA，PH8.0)其中含溶菌酶5mg/ml，于35-37℃水浴保溫30-60分鐘，立即置于-20℃冰箱，令其迅速凍結(jié)，加入15-20mlTris-SDS緩沖液(0.1M Tris，1%SDS，0.1M NaClPH9.0)置于60℃化凍，再置于-20℃凍結(jié)并再度于60℃化凍，加入20ml酚于室溫下振蕩抽提，于12000-14000轉(zhuǎn)/分4-10℃離心15-20分鐘，取上清液，加入2倍體積預(yù)冷過的無(wú)水乙醇，-20℃放置2小時(shí)以上，12000-15000轉(zhuǎn)/分4-10℃離心10-15分鐘，棄去乙醇，沉淀物溶于Saline-Citrate緩沖液中(0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉)，加入250微升RNA酶(1微克/微升)，37℃保溫1小時(shí)，加入等體積酚振蕩去蛋白，12000-15000轉(zhuǎn)/分，10分鐘左右，取上清，加入2倍體積預(yù)冷過的無(wú)水乙醇，-20℃放置2小時(shí)以上，12000-15000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘左右溶于2mlTE緩沖液(10mM Tris.HCl，1.0mM EDTA PH8.0)，加入0.5ml醋酸鹽-EDTA，(3.0M醋酸鈉，0.001M EDTA，PH7.0)，迅速振蕩，加入1.5-2.0ml異丙醇，緩慢振蕩，出現(xiàn)絮狀沉淀，逐滴加入乙醇，置于-20℃2小時(shí)以上，12000-15000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘左右，棄灑精，沉淀溶于2ml Saline-檸檬酸緩沖液中，自加入醋酸鹽-EDTA步驟后重復(fù)2-3次，樣品置于-20℃?zhèn)溆?，得到含丙酰化酶基因生米卡鏈霉菌無(wú)活性變株總DNA。
本發(fā)明所采用的分離方法的特征在于，采用反復(fù)快速冷凍和解凍法，如其中，當(dāng)將離心后的濕菌絲加入含溶菌酶的Saline-EDTA緩沖液后，35～37℃水浴保溫后立即于-20℃凍結(jié)，加入Tris-SDS緩沖液后于60℃化凍，再度于-20℃凍結(jié)和60℃化凍。其目的在于簡(jiǎn)化方法，可用便宜試劑并便于配制。
2.質(zhì)粒PIJ702的提取含有質(zhì)粒PIJ702的變鉛青鏈霉菌Tk54(Streptomyces lividans TK54)培養(yǎng)于YEME培養(yǎng)基中(酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，麥芽提取物0.3%，葡萄糖1-2%，蔗糖34%，MgCl0.1%，余量為無(wú)鹽水，PH7.0-7.2)，26-28℃培養(yǎng)40-48小時(shí)，2000-2500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘左右，去上清，用STE緩沖液洗滌(蔗糖10.3%，EDTA25mM，Tris.HCl25mM，PH8.0)離心(2000-2500轉(zhuǎn)/分)棄上清液，加入10-15mlSTE緩沖液(內(nèi)含5mg/ml溶菌酶，37℃，30-60分鐘保溫，加入20ml堿性SDS溶液(0.2N NaOH，1%SDS)于冰浴中放置5-10分鐘，加入15ml 3M醋酸鈉，于冰浴放置30-60分鐘，12000-15000轉(zhuǎn)/分離心15-30分鐘，取上清，加入2.5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，-20℃放置2小時(shí)以上，12000-15000轉(zhuǎn)/分離心15-30分，除上清加入10mlTE緩沖液，1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，-20℃放置2小時(shí)以上，12000-15000轉(zhuǎn)/分離心，15-30分，真空干燥，溶于1毫升TE緩沖液，-20℃保存?zhèn)溆茫玫劫|(zhì)粒PIJ702。本發(fā)明采用PIJ702為載體，因?yàn)樗哂辛蜴溄z菌素抗性基因和黑色素基因，因此一旦插入外源基因后極易選擇，且本質(zhì)?？截悢?shù)高，易于制備，本提取方法快速而簡(jiǎn)便。
3.酶切采用限制性內(nèi)切酶BglⅡ分別酶切上述PIJ702質(zhì)粒DNA和生米卡鏈霉菌總DNA，酶切緩沖液為10×Y10緩沖液(Tris 10mM，MgCl26mM，巰基乙醇7mM，NaCl10mM)，37℃保溫反應(yīng)1小時(shí)以上。
4.連接將以上BglⅡ酶切過的生米卡鏈霉菌總DNA和BglⅡ酶切過的PIJ702質(zhì)粒DNA(二者濃度比3～5∶1最好為5∶1)在T4-DNA連接酶作用下，于10-14℃放置3小時(shí)以上，連接緩沖液組成為Tris 60mM，MgCl26mM，巰基乙醇10mM，PH7.5，得到重組DNA分子。本方法特點(diǎn)在于由BglⅡ切過的生米卡鏈霉菌總DNA的濃度和由BglⅡ酶切過的PIJ702質(zhì)粒DNA濃度比為3～5∶1，最好為5∶1，在14℃下過夜進(jìn)行連接反應(yīng)。
(二)轉(zhuǎn)化本發(fā)明采用PEG處理除去受體菌細(xì)胞壁，在原生質(zhì)體形成的情況下，直接和DNA接觸，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，再在特定再生培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，使細(xì)胞壁重新形成，成為轉(zhuǎn)化子。
1.原生質(zhì)體的制備將變鉛青鏈霉菌TK 54(Streptomyces lividans TK54)種于25mlYEME培養(yǎng)基中(并中加入適量玻璃珠)，26-28℃培養(yǎng)24-30小時(shí)，再以10-15%接種于新鮮YEME培養(yǎng)基中(加入0.5%甘氨酸，適量玻璃珠)26-28℃培養(yǎng)36-40小時(shí)，2000-3000轉(zhuǎn)/分離心，10-15分鐘，去上清，用10.3%蔗糖溶液洗滌并離心兩次，加入4-5mlP緩沖液(Tris 0.31%，MgCl2·6H2O2.04%，葡萄糖0.1%，CaCl2·2H2O，0.386%，蔗糖10%)其中含有溶菌酶1-2mg/ml，于26-28℃放置30分鐘以上，于相差顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形成率大于90%，于1500-2000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘左右，去上清，用1-2mlP緩沖液洗滌一次，1500-2000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘左右，將所得原生質(zhì)體懸浮于100微升P緩沖液中。
本方法特點(diǎn)原生質(zhì)體形成率高。
2.轉(zhuǎn)化操作本發(fā)明在轉(zhuǎn)化操作中采用Hopwood(Hopwood，D.A.et al.Genetic Manipulation in streptomyces.The John Innes Foundation，Norwich，p110.1985.)方法。取50微升變鉛青鏈霉菌TK54的原生質(zhì)體與1微克以下，最好為0.5微克的上述已連接的DNA樣品混勻，加入25%PEG1000(P緩沖液中)1ml，緩慢振蕩3-5分鐘，立即加入5ml P緩沖液，于1500-2000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘左右，用P緩沖液洗滌并離心一次，將原生質(zhì)體懸浮于1mlP緩沖液中，取50-100微升涂布R2瓊脂平板(蔗糖10.3%，酵母粉0.4%，CaCl2·2H2O0.7%，酪蛋白水解物0.01%，Tris0.3%，K2SO40.025%，蛋白胨0.3-0.5%，MgCl2·6H2O1%，葡萄糖1%，KH2PO40.003%，瓊脂1.5，微量元素溶液0.2%，(ZnCl20.004%，Na2B4O7·10H2O0.001%，MnCl2·4H2O0.001% CuCl2·2H2O0.001%，F(xiàn)eCl3·6H2O0.02%)28-30℃培養(yǎng)18-20小時(shí)后，于每一瓊脂平板上加入一定體積軟瓊脂上層(與R2相同，但瓊脂為0.6%)內(nèi)含硫鏈絲菌素終濃度為25μg/ml，28-30℃培養(yǎng)7-14天得到抗硫鏈絲菌素的轉(zhuǎn)化子。
本方法特點(diǎn)轉(zhuǎn)化率高。
(三)挑選轉(zhuǎn)化子1.選擇抗硫鏈絲菌素的轉(zhuǎn)化子于28-30℃培養(yǎng)7-14天后，陸續(xù)從R2瓊脂平板挑選含重組質(zhì)粒的菌落，如前所述本發(fā)明是從PIJ702BglⅡ酶切位點(diǎn)插入生米卡鏈霉菌BglⅡ酶切片段的，因?yàn)锽glⅡ位于PIJ702黑色素編碼區(qū)，因此凡是含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子則呈白色，而只含有PIJ702質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子呈黑色，根據(jù)上述顏色區(qū)別可以很快挑選出含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。本方法特點(diǎn)由于所用載體PIJ702帶有特殊的編碼黑色素基因，因此易于從顏色變化選擇轉(zhuǎn)化子，方法簡(jiǎn)便。
2.重組質(zhì)粒的提取在重組粒提取中，本發(fā)明采用Katz的快速堿變性方法(Katz.E et al1983，J.Gen.Microbiol.1292703)，其中，每次選取10-50株不等轉(zhuǎn)化子，種于2ml YEME培養(yǎng)基中(加入少量玻璃珠)，26-28℃培養(yǎng)24-30小時(shí)，10%-15%轉(zhuǎn)種于新鮮YEME培養(yǎng)基2ml(加入少量玻璃珠)中，26-28℃培養(yǎng)40-48小時(shí)，2000-2500轉(zhuǎn)/分，離心5-10分鐘，去上清，用STE緩沖液洗滌，離心，去上清液，加入0.2-0.5mlSTE緩沖液(內(nèi)含5-3mg/ml溶菌酶)37℃，30-60分，加入0.3-0.5ml堿性SDS溶液，冰浴5-10分，加入0.2-0.4ml 3M醋酸鈉冰浴30分-1小時(shí)，12000-15000轉(zhuǎn)/分離心15-30分鐘，取上清，加入2.5倍體積預(yù)冷過的無(wú)水乙醇，-20℃放置2小時(shí)以上，12000-15000轉(zhuǎn)/分離心15-30分，去上清液，加入200μl TE緩沖液，1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，-20℃2小時(shí)以上，于12000-15000轉(zhuǎn)/分離心15-30分鐘，去上清，真空干燥，溶于50μl TE緩沖液中，取適量進(jìn)行瓊脂糖凝膠水平平板電泳(1%瓊脂糖)，電壓為3.5V/cm，緩沖液為L(zhǎng)oening緩沖液(Tris.HCl0.036M，Na2HPO40.036M，EDTA0.001M，PH7.8)。
將瓊脂糖凝膠電泳后確定為重組質(zhì)粒的樣品，再進(jìn)行限制性內(nèi)功酶BglⅡ的酶切，酶切后的DNA片段與在同一瓊脂糖凝膠電泳平板上泳動(dòng)的入噬菌體DNA限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切片段泳動(dòng)距離進(jìn)行比較(λ-HindⅢ為分子量標(biāo)準(zhǔn))，可確定各片段分子量大小。本發(fā)明挑選了分子量為10.0Kb，插入片段為4.16Kb的No.9重組質(zhì)粒。含No.9重組DNA的No.9轉(zhuǎn)化子的形態(tài)見附圖2。附圖2是變鉛青鏈霉菌TK 54 No.9菌株(丙?；缚寺【?孢子絲照片，所用斜面培養(yǎng)基(%)麥芽糖1、酵母粉0.4、葡萄糖0.4、瓊脂1.5、自然PH，溫度28～30℃，培養(yǎng)6-7天;其生長(zhǎng)形態(tài)為有較多氣生菌絲、孢子較多、頂部有卷曲、氣生菌絲呈灰白色、產(chǎn)生紫紅色色素、菌落表面平滑、基內(nèi)菌絲呈紫紅色。
為了確認(rèn)含NO.9重組質(zhì)粒的NO.9轉(zhuǎn)化子是否已經(jīng)克隆有來自生米卡鏈霉菌的丙?；富?，通過NO.9轉(zhuǎn)化子的生物轉(zhuǎn)化來觀察克隆菌株是否具有將螺旋霉素轉(zhuǎn)化為丙酰螺旋霉素的能力。
將NO.9轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)于YEME培養(yǎng)基中，28-30℃培養(yǎng)40-48小時(shí)后，加入500mg-200g/升螺旋霉素，再于28-30℃培養(yǎng)40-48小時(shí)，上述培養(yǎng)液經(jīng)2000-3000轉(zhuǎn)/分離心10-20分鐘，棄菌絲，上清液在PH8.0左右用乙酸丁酯進(jìn)行抽提，然后轉(zhuǎn)至PH2.0-3.0的磷酸緩沖液中，重復(fù)一次，最后用二氯甲烷抽提，減壓干燥，將上述樣品用硅膠柱層析進(jìn)行進(jìn)一步純化，以氯仿-甲醇(75∶25)洗脫，收集高活性部分，濃縮、干燥，得出NO.9轉(zhuǎn)化子生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
下述步驟是對(duì)NO.9轉(zhuǎn)化子的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的確定步驟(1)薄層層析采用0.1N NaOH配制的硅膠GF254板進(jìn)行層析，以乙酸乙酯∶甲醇＝9∶1展層，以碘顯跡(附圖3)。附圖4是含NO.9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的薄層層析圖，圖中橫坐標(biāo)1代表乙酰螺旋霉素樣品;2代表丙酰螺旋霉素樣品;3代表NO.9轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化產(chǎn)物樣品;4代表變鉛青鏈霉菌TK54生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物樣品;5代表螺旋霉素樣品。
由圖可見NO.9轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(樣品3)和標(biāo)準(zhǔn)丙酰螺旋霉素(樣品2)Rf值相同。因此說明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是丙酰螺旋霉素。樣品1為乙酰螺旋霉素，其Rf值與NO.9轉(zhuǎn)化產(chǎn)物不同，樣品5為螺旋霉素，是在生物轉(zhuǎn)化過程中加入的樣品和變鉛青鏈霉菌生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(4)同，說明該菌本身不具有轉(zhuǎn)化螺旋霉素為丙酰螺旋霉素的能力，NO.9轉(zhuǎn)化子之所以具有轉(zhuǎn)化螺旋霉素成為丙酰螺旋霉素能力，是由于含有NO.9重組質(zhì)粒的緣故。
同時(shí)可以進(jìn)行生物顯跡(附圖4)。生物檢定菌為八疊球菌(Sarcinalutea)。八疊球菌保存斜面培養(yǎng)基組分為麥芽糖1%、酵母粉0.4%、葡萄糖0.4%、瓊脂1.5%、自然PH。其檢定培養(yǎng)基為蛋白胨1-2%、酵母粉0.2-0.4%、牛肉膏0.1-0.3%、葡萄糖0.1-0.3%、瓊脂1.2-1.5%，PH8.0。附圖5是含NO.9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化產(chǎn)物生物顯跡圖。橫坐標(biāo)上1代表變鉛青鏈霉菌TK54生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物樣品，2代表NO.9轉(zhuǎn)化子生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物樣品;3代表螺旋霉素樣品;4代表標(biāo)準(zhǔn)丙酰螺旋霉素樣品。從圖可見NO.9轉(zhuǎn)化子生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物樣品1和標(biāo)準(zhǔn)丙酰螺旋霉素樣品4有相同的Rf值，而且均有抗八疊球菌的生物活性;變鉛青鏈霉菌TK54生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1與螺旋素樣品相同，說明該菌本身無(wú)轉(zhuǎn)化螺旋霉素為丙酰螺旋霉素的能力。
(2)高壓液相色譜分析采用國(guó)產(chǎn)C-18柱，流動(dòng)相為乙腈0.2M醋酸胺∶水＝53∶10∶37，柱溫為30℃，在232nm紫外光下檢測(cè)(見附圖5和圖6)。
附圖5是丙酰螺旋霉素高壓液相色譜，附圖6是含NO.9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高壓液相色譜，從此二圖可知，含NO.9重組質(zhì)粒的NO.9轉(zhuǎn)化子生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高壓液相色譜的保留時(shí)間與丙酰螺旋霉素基本相同，因此確證轉(zhuǎn)化子生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為丙酰螺旋霉素。
鑒于上述結(jié)果已確證NO.9轉(zhuǎn)化子可以轉(zhuǎn)化螺旋霉素成為丙酰螺旋霉素，說明丙?；富蛭挥贜O.9重組質(zhì)粒的4.16Kb DNA片段部分。
為了確證4.16Kb DNA片段確實(shí)來源于生米卡鏈霉菌變株DNA，進(jìn)行了Southern分子雜交。Southern分子雜交方法見Sambrook.J的文章(Sambrook.J，1989，Molecular cloning.A.laboratory.Manual.Second Edition.Cold Spring Harbour，P.1.42.)本方法原理DNA分子為雙螺旋結(jié)構(gòu)，彼此以G-C，A-T互補(bǔ)方式形成雙鏈結(jié)構(gòu)，基于具有同源性的DNA單鏈可以重新配對(duì)互補(bǔ)的原理，因此建立了本方法。其中，用NO.9重組質(zhì)粒作為探針和BglⅡ酶切過的生米卡鏈霉菌總DNA進(jìn)行雜交。
采用同前述方法提取了生米卡鏈霉菌變株總DNA和NO.9重組質(zhì)粒DNA，依前述同條件用限制性內(nèi)切酶BglⅡ分別酶切生米卡鏈霉菌總DNA和NO.9重組質(zhì)粒，并按同前方法進(jìn)行瓊脂糖凝膠水平平板電泳。電泳畢，以溴化乙錠染色(0.5μg/ml)在紫外燈下攝影隨后操作按下列步驟進(jìn)行a.DNA的變性和固定將上述電泳畢凝膠浸于200-300ml0.25N HCl中緩慢振蕩10-20分，棄去鹽酸，重復(fù)用0.25N HCl再振蕩10-20分，以無(wú)鹽水洗滌除去鹽酸，再用0.5M NaOH/1M NaCl 200-300ml洗滌兩次，每次10-20分，棄去上述溶液后，用無(wú)鹽水沖洗，再加入200-300ml 0.5M Tris.HCl/1M NaCl洗滌，棄去用無(wú)鹽水沖洗再換成0.5M Tris，HCl/3M NaCl200-300ml振蕩洗滌，在凝膠上放置與其大小相同的硝酸纖維素濾膜(預(yù)先用20×SSC浸泡過，20×SSC組分為3M NaCl、0.3M檸檬酸鈉)進(jìn)行DNA膜轉(zhuǎn)移，過夜放置，次日取下濾膜，于紫外燈下檢查DNA轉(zhuǎn)移是否完全，室溫下晾干膜后置于真空干燥烤箱內(nèi)，80℃烤2-3小時(shí)。
b.探針的制備采用NO.9重組質(zhì)粒作為探針，用同位素P32進(jìn)行缺刻翻譯標(biāo)記，反應(yīng)在14℃反應(yīng)3.5小時(shí)，反應(yīng)畢加下終止液(10mM Na EDTA，1%SDS)，用葡聚糖凝膠(Sephadex.G-50)柱將標(biāo)記的NO.9質(zhì)粒和殘存未標(biāo)記的同位素分開，經(jīng)液體閃爍計(jì)數(shù)器記錄CPm值后，探針(P32標(biāo)記的NO.9質(zhì)粒)在沸水中煮10-5分即刻置于冰浴中。
c.雜交將已烤干的硝酸纖維素濾膜浸泡于5×SSC溶液中至濕，再用6×SSC浸泡2-5分鐘，將膜置于雜交袋中，進(jìn)行預(yù)雜交，預(yù)雜交液中含有6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardts溶液(0.01%Ficoll，0.01%牛血清清蛋白，0.01%PVP)，100μg/ml鮭魚精DNA(在沸水中煮過5-10分鐘，置于冰浴中)，封袋后于68℃水浴放置4小時(shí)以上，然后將袋剪開一口，取出預(yù)雜交液，加入雜交液，其中含有6×SSC0.01M EDTA 5×Denhardts 0.5%SDS100μg/ml已變性處理過的鮭魚精DNA，另外加入已用P32標(biāo)記的探針，NO.9質(zhì)粒DNA，封袋后，于68℃雜交20小時(shí)以上，雜交畢，將膜從袋中取出于65℃3×SSC中洗滌10-30分，再于2×SSC中洗滌20-30分，最后于1×SSC中洗滌30分，室溫下晾干膜，用塑料薄膜將膜包好后置于X光片暗盒中，上置X光片，進(jìn)行放射自顯影，于-80℃放置適當(dāng)時(shí)間，取出沖洗后即可獲雜交結(jié)果(附圖7)。
在附圖7中，左圖是Southern分子雜交前瓊脂糖凝膠電泳，右圖是Southern分子雜交后放射自顯影圖，在圖中1代表BglⅡ酶切的NO.9重組質(zhì)粒;2代表BglⅡ酶切生米卡鏈霉菌變株DNA;3代表NO.9重組質(zhì)粒。從右圖看，樣品1(BglⅡ酶切NO.9重組質(zhì)粒)和BglⅡ酶切的生米卡鏈霉菌變株DNA的樣品2在同一位置有相同雜交帶，說明NO.9重組質(zhì)粒中4.16Kb片段(圖中小片段)與生米卡鏈霉菌總DNA有同源性，它確系來源于生米卡鏈霉菌總DNA，而不是污染的結(jié)果。盡管從左圖看樣品2呈連續(xù)降解的核苷酸狀態(tài)，無(wú)明顯帶狀，但是在雜交后從右圖可見樣品1和BglⅡ酶切的生米卡鏈霉菌變株DNA(樣品2)在同一位置，有相同雜交帶出現(xiàn)。
限制性內(nèi)切酶圖譜是表明不同限制性內(nèi)切酶在某種質(zhì)粒DNA上相互位置的圖譜，是質(zhì)粒DNA重要特征。按前述方法對(duì)NO.9重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切和雙酶切。(BamHⅠ，KpnⅠ，PVuⅡ，KPnⅠ-PVuⅡ，PVuⅡ-BamHⅠ，KPnⅠ-BamHⅠ)從而繪制出NO.9重組質(zhì)粒的特征限制性內(nèi)切酶圖譜(見附圖8)。
附圖8表明，生米卡鏈霉菌來源4.16Kb DNA片段(圖中粗黑實(shí)線部分)是由BglⅡ酶切位點(diǎn)插入質(zhì)粒PIJ702的(黑細(xì)線部分)。在4.16kb DNA片段部分有一個(gè)KPnⅠ兩個(gè)BamHⅠ和一個(gè)SalⅠ酶切位點(diǎn)。本圖表明了這三種酶在該片段中的相關(guān)位置。該質(zhì)粒分子量為10.0kb。
(四)含丙酰化酶基因的NO.9重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化目的通過NO.9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入螺旋霉素生產(chǎn)菌株Streptomyces spiramyceticus.使丙?；富蛟谄渲锌寺”磉_(dá)，以形成能直接產(chǎn)生丙酰螺旋霉素的基因工程菌。
1.S.spiramyceticus原生質(zhì)體的制備將該菌種于一種可溶性培養(yǎng)基中(牛肉膏0.3-0.4%，蛋白胨0.5-0.8%，酵母粉0.3-0.5%，PH7.1)培養(yǎng)并中加入適量玻璃珠，28-30℃一級(jí)培養(yǎng)40-48小時(shí)后，以10-15%接種于新鮮同種培養(yǎng)基中，(加入適量玻璃珠，0.5%甘氨酸)28-30℃二級(jí)培養(yǎng)24-30小時(shí)，基本按前述方法制備原生質(zhì)體，但溶菌酶加量為5-15mg/ml，成球達(dá)90%以上需1.5-3小時(shí)。在現(xiàn)有技術(shù)中，一級(jí)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間短，而二級(jí)培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，在本發(fā)明中，將一級(jí)培養(yǎng)時(shí)間改為40～48小時(shí)，而二級(jí)培養(yǎng)時(shí)間改變24～30小時(shí)。這是由于在這個(gè)時(shí)間中，菌絲生長(zhǎng)狀況最佳。因此形成原生質(zhì)體效率高，可達(dá)90%以上。如按現(xiàn)有技術(shù)，將兩個(gè)時(shí)間間隔調(diào)換過來，則菌絲生長(zhǎng)的生理狀況衰老，所形成的原生質(zhì)體效率極低(大約為20～30%)，無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。此外，本發(fā)明所加溶菌酶量顯著高于制備其它鏈霉菌所用量，本發(fā)明加入溶菌酶為5～15毫克/毫升，最佳條件為10毫克/毫升，如低于5毫克/毫升，則原生質(zhì)體幾乎不形成;形成原生質(zhì)體的時(shí)間為1.5～3小時(shí)，若少于1.5小時(shí)，則原生質(zhì)體形成率僅20%，若高于3小時(shí)，則原生質(zhì)體有破裂，也無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
2.轉(zhuǎn)化操作與前述Hopwood轉(zhuǎn)化方法基本相同。
(五)挑選克隆有NO.9重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子1.選擇抗硫鏈絲菌素的菌落凡是在R2再生瓊脂平板(含硫鏈絲菌素終濃度為25μg/ml)均全部挑選。
2.原位雜交原理與Southern分子雜交大體相同，探針可以與轉(zhuǎn)化子菌落直接雜交以確定其DNA同源性。本方法適用于快速、準(zhǔn)確、大量篩選陽(yáng)性克隆菌株，尤其當(dāng)克隆片段不能表現(xiàn)一種能方便檢測(cè)的表型時(shí)，這種方法則更為適宜。
隨機(jī)挑選上述轉(zhuǎn)化子菌落，點(diǎn)種于已鋪在SASM瓊脂平板上的硝酸纖維素薄膜(已消過毒)上(SASM成份淀粉2-5%，黃豆餅粉1-3%，NaCl 0.3-0.5%，CaCO30.4-0.6%，瓊脂1.5% PH7.5)。28℃-30℃，培養(yǎng)40-48小時(shí)，取出膜，置于3張3MM厚濾紙上(紙已用10-15mg/ml溶菌酶P緩沖液浸泡過)，靜置30-60分鐘，以形成原生質(zhì)體，再將濾紙(菌落朝上)移至用1%SDS，1M NaOH浸泡過的3張3MM厚濾紙上，放置20-30分鐘，再放置于干厚濾紙上，以除去多余液體，然后置于用中和溶液(70%PH7.5 1MTris-HCl和30%5M NaCl)浸泡過的三張厚濾紙，5-10分鐘，重復(fù)三次，再置于用90%乙醇處理過的厚濾紙上5-10分，室溫下晾干，將膜置于80℃真空干燥烤箱烘烤1.5-3小時(shí)。隨后的操作步驟和試劑全部同前述Southern分子雜交。以P32標(biāo)記的No9重組質(zhì)粒為探針，原位雜交結(jié)果見圖9，從中挑選了陽(yáng)性雜交結(jié)果包括NO.61在內(nèi)的克隆菌株進(jìn)行工作。
采用了原位雜交方法來篩選轉(zhuǎn)化子，也是本構(gòu)建方法的特征，本發(fā)明用原位雜交方法從200株轉(zhuǎn)化子中挑選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子130余株，僅用了4天時(shí)間，效率高，工作準(zhǔn)確性強(qiáng)。而若用常規(guī)快速質(zhì)粒抽提法，則需10天以上，且誤差較大。
附圖9是原位雜交放射自顯影圖。圖中1為NO.9質(zhì)粒DNA作為雜交陽(yáng)性對(duì)照。
2為S.spiramyceticus受體菌，圖中未出現(xiàn)黑色雜交點(diǎn)，說明該菌與NO.9重組質(zhì)粒無(wú)DNA同源性，是負(fù)對(duì)照。
3是NO.61轉(zhuǎn)化子，具有與陽(yáng)性對(duì)照相同強(qiáng)度的陽(yáng)性雜交點(diǎn)，因此說明它和NO.9重組質(zhì)粒有DNA同源性，是陽(yáng)性雜交菌落。
為了進(jìn)一步選擇NO.61克隆菌株，還可進(jìn)行Southern分子雜交。以NO.9重組質(zhì)粒為探針，與BglⅡ酶切過的螺旋霉素鏈霉菌受體菌總DNA和NO.61轉(zhuǎn)化子總DNA雜交。
按前述方法制備了NO.61轉(zhuǎn)化子菌株和受體菌S.spiramyceticus總DNA。將NO.9重組質(zhì)粒和分別用BglⅡ酶切過的上述兩種總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，條件與前相同，以NO.9重組質(zhì)粒作為探針，其它操作裝步驟同于前述部分。結(jié)果見附圖10。
附圖10是Southern分子雜交圖，其中，a為雜交前瓊脂糖凝膠電泳;b是雜交后放射自顯影。附圖中1代表BglⅡ酶切NO.61轉(zhuǎn)化子DNA;2代表BglⅡ酶切S.spiriamyceticus DNA;3代表NO.9重組質(zhì)粒。
由b.可見NO.9重組質(zhì)粒(3)與S.spiramyceticus受體菌(2)未出現(xiàn)雜交帶，而與NO.61克隆菌株(1)有明顯雜交帶，說明NO.9重組質(zhì)粒與克隆受體菌S.spiramyceticus沒有DNA同源性，而與NO.61克隆菌株有DNA同源性。表明NO.9重組質(zhì)粒確已轉(zhuǎn)化至S.spiramyceticus受體菌中而獲得NO.61克隆菌株。
本步驟確證了NO.9重組質(zhì)粒和NO.61克隆菌株總DNA有同源雜交帶，而與受體菌S.spiramycetions DNA無(wú)同源性，說明NO.9重組質(zhì)粒確已克隆至NO.61菌株。
七.S.streptomyceticus NO.61克隆菌株的發(fā)酵目的為了確證NO.61克隆菌株的發(fā)酵產(chǎn)物。
將NO.61克隆菌株種于下列培養(yǎng)基淀粉3-5%，黃豆并粉2-4%，NaCl0.3-0.5%，蛋白胨0.5-2%，CaCO30.5%，于28-30℃振蕩培養(yǎng)40-48小時(shí)，以10-15%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉4-7%，玉米漿0.5-2.5%，葡萄糖1.5-3.0%，NH4NO30.4-0.7%，Mg2SO40.5-2.5%，KH2PO40.03-0.06%，NaCl0.5-1.5%，CaCO30.3-0.6%，余為自來水，PH6.5-7.0。28℃-30℃振蕩培養(yǎng)，96-120小時(shí)，于3000轉(zhuǎn)/分離心發(fā)酵液，取上清棄去菌絲，提取步驟同前。得到丙酰螺旋霉素。
丙酰螺旋霉素的確證為了證實(shí)包括NO.61在內(nèi)的克隆菌株發(fā)酵產(chǎn)物為丙酰螺旋霉素，因此選擇No61克隆菌株進(jìn)行若干檢測(cè)1.薄層層析方法同前，碘顯跡和生物顯跡均表明發(fā)酵產(chǎn)物中具有與丙酰螺旋霉素Rf值相同的組分(圖11、圖12)。
附圖11是NO.61轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)物薄層層析圖。其中1代表丙酰螺旋霉素;2代表NO.61轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)物;3代表螺旋霉素。附圖11表明NO.61轉(zhuǎn)化子產(chǎn)物(2)具有Rf值與丙酰螺旋霉素(1)相同的成份。從而證明NO.61克隆菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中有丙酰螺旋霉素。此外NO.61轉(zhuǎn)化子也產(chǎn)生與螺旋霉素(3)Rf值相同產(chǎn)物，說明它也產(chǎn)生螺旋霉素。
附圖12是NO.61轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)物生物顯跡圖，其中1代表丙酰螺旋霉素;2代表NO.61轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)物。附圖12表明，NO.61轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)物(2)具有與丙酰螺旋霉素(1)相同的Rf值，且均有抗八疊球菌的生物活性，因此證明NO.61轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)物中有丙酰螺旋霉素。
2.高壓液相色譜分析采用μ Bondapack TM C18柱，流動(dòng)相為甲醇水(用磷酸調(diào)至PH2.8-2.9)＝67∶33，室溫操作，于232nm進(jìn)行紫外檢測(cè)(圖13、14)。
附圖13是丙酰螺旋霉素高壓液相色譜圖。附圖14是NO.61轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)物高壓液相色譜圖。可見NO.61克隆菌株產(chǎn)物中具有與標(biāo)準(zhǔn)丙酰螺旋素保留時(shí)間相似的組分(見箭頭所示)，說明NO.61克隆菌株能產(chǎn)生丙酰螺旋霉素。
3.質(zhì)譜分析采用FAB法，結(jié)果見附圖15和圖16。附圖15是丙酰螺旋霉素質(zhì)譜分析圖;附圖16是NO.61轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)譜分析圖。
從結(jié)果可見標(biāo)準(zhǔn)丙酰螺旋霉素Ⅱ在942處有一分子離子峰，NO.61克隆菌株在943處有一分子離子峰，數(shù)值相同，說明該克隆菌株產(chǎn)物中有丙酰螺旋霉素Ⅱ組分。
綜上所述，我們通過前述七步主要技術(shù)關(guān)鍵步驟獲得了可以直接產(chǎn)生丙酰螺旋素的基因工程菌株。該菌株形態(tài)見附圖17和18。附圖17為克隆有丙?；虻穆菪顾劓溍咕鶱O.61菌株(丙酰螺旋霉素基因工程菌)孢子絲照片。所用SASM培養(yǎng)基為淀粉4.0%、黃豆餅粉2.0%、NaCl0.4%、CaCO30.5%、瓊脂1.5%，PH7.5，15磅、20分滅菌，于28℃培養(yǎng)8-10天。
生長(zhǎng)形態(tài)氣生菌絲孢子較少，氣生菌絲為灰白色，菌落表面呈皺褶，不產(chǎn)生色素，基內(nèi)菌絲為椰殼色。
附圖18是克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素鏈霉菌NO.61菌株(丙酰螺旋霉素基因工程菌)孢子(1×12000)照片，該照片說明該孢子具有棘狀突起。附圖19是丙酰螺旋霉素結(jié)構(gòu)示意圖。
本發(fā)明構(gòu)建方法提供可用于工業(yè)生產(chǎn)的丙酰螺旋霉素基因工程菌，效價(jià)500μg/ml以上，丙酰螺旋霉素在總產(chǎn)物中含量為20%以上，菌種遺傳性狀穩(wěn)定，在一般條件下除螺旋霉素外，只產(chǎn)生丙酰螺旋霉素。
權(quán)利要求
1.克隆有丙?；富虻穆菪顾劓溍咕臉?gòu)建方法，其特征在于a、鳥槍克隆以質(zhì)粒PIJ702為載體將經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bg1Ⅱ分別酶切過的米生卡鏈霉菌(Streptomyces mykarofaciens)總DNA和PIJ702質(zhì)粒DNA，以3～5∶1濃度比，在T4-DNA連接酶作用下，于10～14℃放置3小時(shí)以上進(jìn)行連接反應(yīng)，得到重組DNA分子。b、轉(zhuǎn)化采用a步驟中連接后的重組DNA，以變鉛青鏈霉菌TK54的原生質(zhì)體為受體，按Hopwood等人的方法將連接后的DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入所說的受體菌中；c、挑選轉(zhuǎn)化子及提取重組質(zhì)粒以含硫鏈絲菌素終濃度為25微克/毫升的R2瓊脂平板挑選含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，在所說的含硫鏈絲菌素R2平板上所選的白色菌落即為含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，然后采用快速堿變性方法提取含重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子，將瓊脂糖凝膠電泳后確定為重組質(zhì)粒的樣品再進(jìn)行限制性內(nèi)切酶Bg1Ⅱ的酶切，酶切后的DNA片段與在同一瓊脂糖凝膠電泳平板上泳動(dòng)的入噬菌體DNA限制性內(nèi)切酶HindⅢ酶切片段泳動(dòng)距離進(jìn)行比較，從而確定各片段分子量大小，挑選出其中質(zhì)粒分子量為10.0kb，插入片段為4.16kb的NO.9重組質(zhì)粒；從而得到NO.9重組質(zhì)粒DNA；d、NO.9重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以螺旋霉素鏈霉菌為受體菌，按照Hopwood等人的方法，將該NO.9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入受體菌內(nèi)，使丙?；富蛟谄渲锌寺『捅磉_(dá)；e、挑選克隆有NO.9重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。在含硫鏈絲菌素終濃度為25微克/毫升的R2再生瓊脂平板上進(jìn)行挑選轉(zhuǎn)化子，采用Hopwood等人的方法進(jìn)行原位雜交，以NO.9重組質(zhì)粒為探針，與固定于硝酸纖維素薄膜上經(jīng)過變性處理的轉(zhuǎn)化子DNA進(jìn)行原位雜交，從中挑選出陽(yáng)性雜交結(jié)果的克隆菌株，因此，獲得克隆有丙?；富虻穆菪顾劓溍咕?br> 2.按照權(quán)利要求1所說的構(gòu)建方法，其特征在于對(duì)在e步驟中挑選出陽(yáng)性雜交結(jié)果的克隆菌株后再進(jìn)行Southern分子雜交，其中，以NO.9重組質(zhì)粒為探針，將BglⅡ酶切過的螺旋霉素鏈霉菌受體菌總DNA和NO.61克隆轉(zhuǎn)化子總DNA雜交，獲得NO.61克隆菌株。
3.按照權(quán)利要求1所說的構(gòu)建方法，其特征在于在a步驟的鳥槍克隆方法中，BglⅡ酶切過的生米卡鏈霉菌DNA與BglⅡ酶切過的PIJ702連接時(shí)，其濃度比為5∶1。
4.按照權(quán)利要求1所說的構(gòu)建方法，其特征在于在a步驟的鳥槍克隆操作中，在生米卡鏈霉菌無(wú)活性變株總DNA的分離方法中采用反復(fù)快速冷凍和解凍法，其中，當(dāng)將離心后的濕菌絲加入含溶霉菌的Saline-EDTA緩沖液后，35～37℃保溫后立即于-20℃凍結(jié)，加入Tris-SDS緩沖液后于60℃化凍，再置于-20℃凍結(jié)并再度于60℃化凍，隨后進(jìn)行振蕩抽提。
5.按照權(quán)利要求1所說的構(gòu)建方法，其特征在于在b步驟轉(zhuǎn)化操作中，50微升變鉛青鏈霉菌TK54原生質(zhì)體與已連接的DNA混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，該已連接的DNA濃度在1微克以下。
6.按照權(quán)利要求4所說的構(gòu)建方法，其特征在于在b步驟轉(zhuǎn)化操作中，50微升變鉛青鏈霉菌TK54原生質(zhì)體與已連接的DNA混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，該已連接的DNA濃度為0.5微克。
7.按照權(quán)利要求1所說的構(gòu)建方法，其特征在于在d步驟NO.9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過程中，在加入適量玻璃珠的可溶性培養(yǎng)基中，在28～30℃下，一級(jí)培養(yǎng)40～48小時(shí)，再以10～15%接種于新鮮相同的可溶性培養(yǎng)基中在28～30℃下二級(jí)培養(yǎng)24～30小時(shí)，用以制備螺旋霉素鏈霉菌原生質(zhì)體。
8.按照權(quán)利要求1所說的構(gòu)建方法，其特征在于在d步驟NO.9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過程中，所用溶菌酶量為5～15毫克/毫升，在26～28℃下放置1.5～3小時(shí)，形成螺旋霉素鏈霉菌原生質(zhì)體成球率達(dá)90%。
9.克隆有丙?；富虻陌∟O.61在內(nèi)的螺旋霉素鏈霉菌用于制造丙酰螺旋霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別是克隆有丙?；富虻穆菪顾劓溍咕臉?gòu)建方法。本發(fā)明采用基因工程方法，其中包括采用質(zhì)粒PIJ702為載體對(duì)生米卡鏈霉菌總DNA進(jìn)行鳥槍克隆，轉(zhuǎn)化至變鉛青鏈霉菌TK54，挑選轉(zhuǎn)化子和提取重組質(zhì)粒，得到№9轉(zhuǎn)化子，將自№9轉(zhuǎn)化子提取得到的№9重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至螺旋霉素鏈霉菌，挑選克隆有№9重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，得到克隆有丙?；富虻陌ā?1在內(nèi)的螺旋霉素鏈霉菌，將該螺旋霉素鏈霉菌進(jìn)行發(fā)酵即可工業(yè)生產(chǎn)丙酰螺旋霉素，丙酰螺旋霉素在總產(chǎn)物中含量在20％以上，菌種遺傳性穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1052507SQ9110002
公開日1991年6月26日 申請(qǐng)日期1991年1月9日 優(yōu)先權(quán)日1991年1月9日
發(fā)明者李元, 李煥婁, 石蓮英, 劉伯英, 李曉平 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所