專利名稱：人免疫缺陷病毒的疫苗及其治療方法
本申請是1988年2月3日遞交的美國專利申請151，976的部分繼續(xù)申請，而后者又是1986年10月16日遞交的美國專利申請920，197的部分繼續(xù)申請(現(xiàn)在的系列號為585，266)。這些申請以及本文中引用的文獻均以參考文獻形式列入本說明書中。
1-型人免疫缺陷病毒(HIV-1)是一種引起全身性感染的逆病毒，其主要病理學(xué)在于免疫系統(tǒng)，而且是引起獲得性免疫缺陷綜合癥(艾滋病)的病原體〔Barre-Sinoussi，et al，Science，220868-871(1983);Popovic et al。Science，224497-500(1984)〕。HIV-1的臨床分離物也被稱作淋巴結(jié)病相關(guān)病毒〔Feorino，et al.Science，22569-72(1984)〕和艾滋病相關(guān)病毒〔Levy et al.，Science 225840-842(1984)〕。
艾滋病已變得越來越普遍，其疫苗的開發(fā)已成為世界公共健康領(lǐng)域的一個主要課題。大部分感染了HIV-1的患者因T4淋巴細胞的減少而導(dǎo)致免疫功能的逐漸喪失。在這些T4細胞及某些神經(jīng)細胞的表面上具有稱為CD4的分子。HIV-1通過位于病毒顆粒區(qū)膜上的受體識別CD4分子，進入這些細胞并最終復(fù)制和殺死細胞。有效的艾滋病疫苗可望引發(fā)產(chǎn)生與HIV-1包膜結(jié)合的抗體，從而防止其感染T4淋巴細胞或其它易感細胞。
疫苗通常是在接觸患病生物體之前以預(yù)防劑的形式給予健康個體的。但是，也可以考慮將有效的艾滋病疫苗在接觸后免疫中作為對該疾病的免疫療法劑來使用(Salk，J.，Nature，327473-476(1987))。
在艾滋病疫苗的開發(fā)中，普遍認為HIV-1包膜(“env”)是最有希望的候選者〔Francis and Petricciani.New Eng.J.Med.，1586-1559(1985);Vogt and Hirsh，Reviews of Infeetious Disease，8991-1000(1986);Fauci，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，839278-9283〕。最初合成的HIV-1包膜蛋白是分子量為160，000的糖蛋白(gp 160)，然后該gp 160前體被切割成分子量為120，000的外部糖蛋白(gp 120)和分子量為41，000的跨膜糖蛋白(gp 41)。這些包膜蛋白是艾滋病患者體內(nèi)抗體的主要靶抗原(Barin，et al.，Science，2281094-1096(1985))。已證明天然HIV-1 gp 120是免疾原性的并且能夠在嚙齒動物、山羊、恒河猴和黑猩猩中誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體(Robey，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA837023-7027(1986))。
由于被感染細胞中天然HIV-1包膜蛋白的水平極低，并且存在與由HIV-1感染的細胞制備艾滋病疫苗有關(guān)的危險，所以已采用重組DNA方法來生產(chǎn)用作艾滋病疫苗的HIV-1包膜抗原。由于重組DNA技術(shù)能夠產(chǎn)生大量安全且經(jīng)濟的免疫原，因此它是生產(chǎn)艾滋病亞單位疫苗的最佳選擇。已在遺傳上改變的牛痘病毒重組體中表達了HIV-1包膜蛋白〔Chakrabarti，et al.，Nature，320535-537(1986);Huet al.，Nature，320537-540(1986)Kieny，et al.，Biotechnology，4790-795(1986)〕。另外，也已在細菌細胞(Patney，et al.，Science，2341392-1395(1986)，哺乳動物細胞(Lasky，et al，Science，23209-12(1986))及昆蟲細胞中表達了包膜蛋白。由HIV-1 gp41氨基酸序列衍生的合成肽也被認為是艾滋病疫苗的候選者(Kenneely，et al.，(1986))。但是，利用這些材料和方法并未成功地生產(chǎn)出艾滋病疫苗。
利用桿狀病毒-昆蟲細胞載體系統(tǒng)生產(chǎn)重組HIV-1包膜蛋白是1986年10月16日遞交的共同未決和共同轉(zhuǎn)讓的美國專利申請系列號920，197中所公開的發(fā)明的一個方面(本申請的系列號為585，266)(又見系列號151，976)。
已證明桿狀病毒系統(tǒng)在生產(chǎn)HIV-1蛋白及其它蛋白中具有通用性。例如，已將桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾(Autographa Californica)核多角體病毒(AcNPV)用作載體，在被感染的秋粘蟲(Spodoptera frugiperela，fall armyworm)細胞(sfg細胞)中表達HIV-1包膜基因的全長gp160及其各個部分。在上述共同未決專利申請中也公開了截斷的gp160基因(重組體號Ac3046)、由重組體Ac3046產(chǎn)生的蛋白質(zhì)以及包括兵豆植物凝血素親和層析和凝膠過濾層析在內(nèi)的Ac3046基因產(chǎn)物純化技術(shù)。已發(fā)現(xiàn)以該方式純化并聚集成顆粒的gp160蛋白在嚙齒動物及靈長類動物中具有很高的免疫原性。
理想的艾滋病疫苗除了滿足基本上為生物純和非熱原性的要求外，還應(yīng)在一次或幾次注射后能提供抗HIV-1感染的終身保護?；畹牟《疽呙缤ǔＨ绱?。當(dāng)利用殺死的細菌或病毒或其分離物(如類毒素或蛋白質(zhì))制備疫苗時，常常產(chǎn)生很弱的抗體應(yīng)答及短期的免疫性。為了克服或盡量減少疫苗的這些缺陷，可以使用稱作佐劑的附加成分。佐劑是幫助刺激免疫應(yīng)答的物質(zhì)，人疫苗中常用的佐劑是鋁鹽(磷酸鋁或氫氧化鋁)的凝膠，通常稱為明礬佐劑〔Bomford，et al.，“Adjuvants”，Animal Cell Biotech.Vol.2235-250，Academic Press Inc.(London1985)〕。
本發(fā)明提供了人體免疫缺陷病毒(HIV)的疫苗及其治療方法，它包括給被感染個體或易感個體服用重組HIV包膜蛋白。在一優(yōu)選實施方案中，可將包膜蛋白純化、聚集并與佐劑(如明礬)結(jié)合以用作疫苗。
下面結(jié)合


本發(fā)明的具體內(nèi)容。
圖1舉例說明自大腸桿菌質(zhì)粒pNA2中分離HIV-1包膜基因(env)的克隆方案。影線區(qū)為HIV-1 DNA序列。開放區(qū)來自克隆載體。質(zhì)粒p1774中的黑區(qū)是由合成的寡核苷酸構(gòu)建的，并作為SmaI-KpnI片段被引入到質(zhì)粒p1614的SmaI-KpnI位點中。該合成寡核苷酸的序列已被列出。
圖2說明了構(gòu)建重組質(zhì)粒載體(p3046)的方案，該載體又被用于構(gòu)建桿狀病毒表達載體Ac3046。質(zhì)粒PMGS3在位置4.00處克隆位點的兩側(cè)含有得自桿狀病毒AcNPV的序列(交叉影線區(qū))。該位點是SmaI、KpnI和BglⅡ的特定限制性核酸內(nèi)切酶切點。AcNPV多角體啟動子位于4.00位置的5′方向，序列5′-TAATTAATTAA-3′位于3′方向，且在所有三個讀碼中均有一個轉(zhuǎn)譯終止密碼子。質(zhì)粒p1774及合成寡核苷酸區(qū)域的序列如圖1所示。除SmaI和Bgl Ⅱ位點之間的序列(p1774的HIV-1包膜基因在此插入)外，質(zhì)粒p3046含有所有的PMGS3。
圖3顯示側(cè)翼Ac3046 gp160編碼序列的DNA核苷酸序列。+1和+2264之間的3046env DNA序列示于圖4中。
圖4a-4k顯示Ac3046(+1至+2264之間)中HIV-1 enV基因片段的真正DNA序列以及enV基因5′末端的合成寡核苷酸序列。DNA序列上面列出限制性核酸內(nèi)切酶位點的定位，DNA序列下面列出了推測的氨基酸序列。在左和右側(cè)標(biāo)有堿基的編號。
圖5a-5d比較了來自Ac3046的env基因的DNA序列和已公開的來自LAV-1的env基因序列。上面為LAV-1序列，下面為Ac3046的序列。LAV-1序列下面的線(1)表示Ac3046中的序列在該位置相同。所使用的DNA序列編號是Wain-Hobson等(Cell，409-17(1985))所述的編號。
圖6顯示人HIV-1抗體陽性血清(上圖)以及得自用gp160(IJ55，KL55)或gp120(AB55，CD55，GF55)免疫的動物恒河猴血清(下圖)的ELISA終點稀釋滴度。ELISA滴度是通過高度純化的gp120和gp160蛋白測得的。專一性結(jié)合抗體是用羊抗人IgG HRp連接物測定的。試驗中產(chǎn)生陽性反應(yīng)的最高血清稀釋度即為滴度。
圖7以表的形式總結(jié)了已接種過疫苗的血清陽性患者體內(nèi)由gp160疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
圖8(A和B)顯示疫苗誘導(dǎo)的抗特異性HIV包膜表面抗原決定簇的抗體反應(yīng)。
圖9顯示在接種過的血清陽性個體中由疫苗誘導(dǎo)的抗gp160的T-細胞繁殖反應(yīng)。
圖10(A-C)顯示與接種相關(guān)的淋巴細胞增殖性反應(yīng)。
圖11是在應(yīng)答者和非應(yīng)答者中CD4細胞變化的百分數(shù)與時間的關(guān)系圖。
已發(fā)現(xiàn)重組HIV-1 gp160包膜蛋白(“rgp 160”)，特別是當(dāng)它吸附于如明礬(如磷酸鋁)等佐劑上時尤其適于用作艾滋病疫苗。本發(fā)明的一個方面是具有部分HIV-1包膜基因編碼序列的Ac NPV表達載體，所說的部分包括見于重組克隆3046中的氨基酸1-757。本發(fā)明的另一個方面是在昆蟲細胞中生產(chǎn)HIV-1包膜蛋白(及蛋白質(zhì)本身)-尤其是由氨基酸序列1-757(即03046)編碼的rgp160蛋白。
本發(fā)明還包括由產(chǎn)生3046蛋白的重組桿狀病毒的基因產(chǎn)物中純化和形成重組包膜蛋白顆粒并將3046質(zhì)粒吸附于磷酸鋁聚集體上。
本發(fā)明也涉及預(yù)防和/或治療艾滋病或HIV感染的疫苗以及預(yù)防或治療艾滋病或HIV感染的方法。
以下實施例舉例說明本發(fā)明，但并不限制其范圍。
在共同未決且共同轉(zhuǎn)讓的美國專利申請系列號920，197(現(xiàn)在的系列號為585，260)中敘述了重組的桿狀病毒即苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)，它含有編碼HIV包膜蛋白1-757位氨基酸的截短的HIV-1 gp160基因(重組體Ac3046)。其中還公開了用于構(gòu)建含有HIV-1基因或其部分之重組桿狀病毒的克隆步驟，它也列為本文參考文獻。
以下是對用于構(gòu)建Ac3046表達載體的遺傳工程步驟的詳細說明。所使用的材料，包括酶和免疫試劑均通過商業(yè)途徑獲得。并且提供了如何完成和利用本發(fā)明的實施例。
本發(fā)明也考慮到統(tǒng)稱為rgp160的其它重組包膜蛋白，包括重組gp120和gp41蛋白。Ac3046僅僅是本發(fā)明表達載體和重組包膜蛋白的一個實例。
實施例1攜帶HIV-1氨基酸1-757編碼序列的桿狀病毒重組體Ac3046的構(gòu)建在桿狀病毒載體中克隆和表達外源蛋白質(zhì)編碼序列需要將該編碼序列與多角體啟動子及上游序列排列在一端，并將桿狀病毒編碼序列排列于另一端。這樣排列將使得與桿狀病毒基因組的同源重組會導(dǎo)致與多角體啟動子無活性多角體基因一起排列之外源編碼序列的轉(zhuǎn)移。
因此，已設(shè)計出大量的用于構(gòu)建HIV包膜基因的插入載體。設(shè)計下面所述的插入載體MGS3以用于提供ATG轉(zhuǎn)譯起始密碼子。將外源序列插入該載體必須使得由起始密碼子建立的轉(zhuǎn)譯碼在整個外源序列中正確維持。
插入載體MGS3是由噬斑純化的AcMNPV分離物(WT-1)分離的DNA的EcoRI-Ⅰ限制性片段克隆構(gòu)建的。MGS3被設(shè)計成由以下結(jié)構(gòu)組成(a)多角體基因的ATG起始密碼子上游的4000bp序列;(b)通過定點誘變引入的多聚連接子，它由相應(yīng)的多角體密碼子位置處的ATG起始密碼子及限制性酶切位點Sma I、KPn I、Bgl Ⅱ和通用的終止密碼子片段組成;(c)自Kpn Ⅰ限制位點(位于多角體基因內(nèi))延伸至ECORI-Ⅰ克隆的末端ECORI限制位點的1700bp序列(見圖2)。
實施例2構(gòu)建攜帶LAV env編碼序列的桿狀病毒重組體定名為NA2的重組質(zhì)粒(圖1)由插入至pUC18中的完整HIV-1前病毒的21.8Kb片段組成。由于該克隆在轉(zhuǎn)染某些人細胞后能夠產(chǎn)生病毒，所以有報道認為它是具有感染性的(Adachi，et al.，J.Virol.59284-291(1986))。NA2中含有的完整包膜基因序列得自HIV的LAV病毒株(Barre-Sinoussi(1983))。
按以下所述及圖1中所示的方法分離并操作HIV-1包膜基因。包膜基因最初是以3846bp EcoRI/SacI限制片段的形式自NA2中分離出來并被克隆到PUC19的EcoRI/SacI限制性位點。所產(chǎn)生的質(zhì)粒稱作p708。
然后作為2800bp Kpn I限制性片段再次分離包膜基因并克隆到PUC18的Kpn I限制性位點中。所產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為p1614。
p1614中的Kpn I限制性片段含有稍微截短的小部分HIV包膜基因，使得其N-末端相應(yīng)序列缺失121bp。基因中的該缺失部分(包含了信號肽序列)通過插入雙鏈合成寡聚物而被取代。被插入的寡聚物是利用優(yōu)選的多角體基因密碼子根據(jù)LAV氨基酸序列設(shè)計的。為便于進一步操作，將一新的SmaI限制序列同時引入，以代替ATG起始密碼子。ATG起始密碼子將由桿狀病毒插入載體提供。所產(chǎn)生的質(zhì)粒定名為p1774。
參照圖2，得自p1774且含有HIV-1包膜之各個區(qū)域的編碼序列的限制性片段克隆到MGS插入載體(如MGS3)中，從而使插入載體的ATG起始密碼子與包膜基因的密碼子位于同一讀碼中。構(gòu)建物p3046由自插入到質(zhì)粒載體pMGS3之SmaI/Bgl Ⅱ位點中的p1774分離的SmaI/BamHI限制性片段組成。該克隆含有g(shù)p160的氨基酸1-757的編碼序列并利用了由MGS3載體提供的終止密碼子。
實施例3制備并篩選重組桿狀病毒將HIV env基因重組質(zhì)粒p3046與AcMNPVDNA(WT-1)一起用磷酸鈣沉淀，并加到未感染的秋粘蟲細胞中。然后通過同源重組將嵌合基因插入AcMNPV基因組中。根據(jù)閉合陰性噬斑形態(tài)鑒定重組病毒。這類噬斑顯示有可鑒別的細胞病變效應(yīng)，但無核閉合。進行兩次另外的連續(xù)噬斑純化以獲得重組病毒。通過比較重組病毒DNA與野生型病毒DNA的限制性切割和雜交特征來分析HIV env序列的位點特異性插入。
實施例4在感染的昆蟲細胞中表達得自重組桿狀病毒的HIV env在昆蟲細胞中表達得自重組病毒的HIV env序列將導(dǎo)致初級轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的合成。該初級產(chǎn)物將由重組載體所提供的密碼子轉(zhuǎn)譯的氨基酸組成。其結(jié)果得到一種蛋白質(zhì)，它含有自多角體啟動子下游表達載體的ATG起始密碼子到表達載體(如rgp160)上轉(zhuǎn)譯終止信號之間的密碼子所編碼的所有氨基酸。Ac3046之初級轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物的末端應(yīng)為Met-Pro-Gly-Arg-Val，其中4位上的Arg為原始LAV克隆2位上的Arg。Met-Pro-Gly密碼子是作為該克隆方案的結(jié)果提供的。
實施例5gp160插入及其側(cè)翼DNA的核苷酸序列在分離自病毒表達載體Ac3046 DNA的限制性酶切片段中測定出gp160插入子及側(cè)翼DNA的核苷酸序列。序列分析方法包括以下步驟。通過Ac3046病毒DNA的限制性消化純化3.9Kb EcoRI-BamHI片段。已從存在于用來大量生產(chǎn)疫苗之細胞培養(yǎng)基內(nèi)的細胞外病毒中制得Ac3046病毒DNA。
如圖2所示，3.9Kb EcoRV-BamHI片段由完整的gp160基因及100bp上游和約1000bp下游側(cè)翼DNA組成。其中，完整gp160基因的核苷酸序列已被測定，它包括100bp上游和100bp下游側(cè)翼DNA。
簡單地說，序列分析的結(jié)果揭示嵌合構(gòu)建物正如克隆方案所預(yù)期的一樣。gp160的序列基本上與Wain-Hobson等(1985)所報道的相同。在左右側(cè)的轉(zhuǎn)譯起始和終止密碼子之間的2253堿基的序列推測為751個氨基酸的密碼子和28個潛在的N-連接的糖基化位點。所估計的包括糖殘基在內(nèi)的該rgp160的分子量約為145，000。
對200個堿基的側(cè)翼DNA所進行的序列分析表明了如圖3、4和5所示的正確插入。
實施例6gp160的氨基酸序列利用標(biāo)準(zhǔn)的自動Edman降解法和HPLC方法測得gp160的前15個殘基的N-末端序列與由DNA序列推斷的序列完全相同。gp160蛋白上未出現(xiàn)N-末端甲硫氨酸。這與在無N-末端甲硫氨酸時也產(chǎn)生AcNPV多角體蛋白的觀察結(jié)果相符。正如已通過分析AcNPU3046 DNA和純化的gp160所確定的那樣，現(xiàn)將真實gp160 DNA和N-末端蛋白質(zhì)序列總結(jié)如下(表1)。
表1Ac NPV 3046表達載體中的LAV env基因殘基
將這些結(jié)果與如下(表2)所示的原始LAV-1克隆進行比較。
表2原始LAV-1克隆中的LAV env基因殘基1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp GlyATG AGA GTG AAG GAG AAG TAT CAG CAC TTG TGG AGA TGG GGG實施例7重組體gp160的純化本發(fā)明所涉及的一個方面是提取和純化Ac3046表達載體中所編碼的重組HIV-1包膜蛋白的方法。重組HIV-1包膜蛋白gp160是用Ac3046感染4-5天時在秋粘蟲細胞中產(chǎn)生的。該rgp160蛋白的純化包括如下步驟1.洗滌細胞2.細胞裂解3.凝膠過濾層析4.兵豆植物凝血素親和層析5.透析該實施例敘述了自大約2×109個Ac3046感染的細胞中純化重組gp160。
1.洗滌細胞在含有50mM Tris緩沖液(PH7.5)、1mM EDTA和1% Triton X-100的緩沖液中洗滌被感染的細胞。將細胞重新懸浮于該緩沖液中，用常規(guī)方法均漿，并以5000rpm離心20分鐘。將該方法重復(fù)三次。
2.細胞裂解在50mM Tris緩沖液(PH8.0-8.5)、4%脫氧膽酸鹽及1%β-巰基乙醇中通過超聲處理裂解洗滌過的細胞。超聲波處理按常規(guī)方法進行。處理之后只有核膜殘余物是完整的，以5000rpm離心30分鐘將其除去。通過光學(xué)顯微鏡觀察確定含有提取的gp160的上清液中沒有完整細胞。
3.凝膠過濾在填充了Sephacryl樹脂(Pharmacia)的Pharmacia 5.0×50cm玻璃柱上進行凝膠過濾。總的柱床體積為約1750ml。為除去熱原并清洗柱及連接管，至少用6升0.1N NaOH洗柱，總時間為24小時。將自柱中流出的液體連接至UV流動池、監(jiān)視器及曲線記錄儀(Pharmacia)上，然后用4升凝膠過濾緩沖液平衡。將粗gp160在柱頂上樣并用凝膠過濾緩沖液展層。
該柱將粗混合物分離成三個主要的紫外吸收部分。第1峰在約500-700ml緩沖液之間流出，第二峰在700-1400ml緩沖液之間流出，第三峰在1400-1900ml緩沖液之間流出。在小型分析柱上觀察到同樣的洗滌曲線，它已測得第一峰是分子量為≥2，000，000的材料。
由于高分子量脂質(zhì)及脂質(zhì)復(fù)合物的濃縮而使得該峰為半透明的。該峰也含有自被感染細胞提取的10%-20%的gp160很顯然，這部分gp160已與其本身或其它細胞成分復(fù)合，形成了高分子量聚集體。
第二寬峰含有大部分gp160及分子量在大約18，000至200，000之間的蛋白質(zhì)。
第三峰含有很少的蛋白質(zhì)，大部分紫外吸收是由于樣品中存在的β-巰基乙醇所致。
當(dāng)首先通過紫外吸收示蹤檢測第二峰時，是將柱流出物直接加到兵豆植物凝血素柱上。一旦第二峰從柱中洗出，立即從兵豆植物凝血素柱上移開流出物，并導(dǎo)入溶液中。
4.兵豆植物凝血素兵豆植物凝血素親和凝膠基質(zhì)(Lentil Lectin-Sepharose 4B)是以散裝形式自Pharmacia購得的。在Sephadex上通過親和層析分離兵豆植物凝血素達到98%以上的純度，然后利用溴化氰將其偶聯(lián)到Sepharose 4B上而固相化。該基質(zhì)中每毫升凝膠含有約2mg配體。兵豆植物凝血素柱為含有125ml兵豆植物凝血素-Sepharose 4B凝膠的510×30cm玻璃柱(Pharmacia)。親和基質(zhì)在經(jīng)過徹底洗滌并按廠商推薦的方法再生后，可以反復(fù)使用。不使用時將該凝膠加在由0.9%NaCl、1mM MnCl2、1mM CaCl2和0.01%乙基錄硫代水楊酸鈉組成的溶液中在柱內(nèi)保存。每次使用前用250ml上述兵豆植物凝血素緩沖液洗滌和平衡該柱。
當(dāng)自上述凝膠過濾柱上洗脫后，將粗gp160直接上柱。粗gp160一旦與柱結(jié)合，即用含有0.1%脫氧膽酸鹽的800ml兵豆植物凝血素緩沖液洗柱。在這些條件下，所有g(shù)p160均與柱結(jié)合。用兵豆植物凝血素及0.3M α-甲基甘露糖苷洗脫已結(jié)合的糖蛋白，并通過紫外光監(jiān)測器于波長280nm處監(jiān)測之。
5.透析用常規(guī)透析方法除去糖和脫氧膽酸鹽。
自1升感染的細胞純化gp160的方法可總結(jié)于下面的表3中。
在另一實施方案中，可用常規(guī)的離子交換層析(陰離子型或陽離子型)代替凝膠過濾。同樣，各步驟的順序并不嚴(yán)格例如，可在兵豆植物凝血素純化步驟之后進行凝膠過濾或離子交換層析。根據(jù)本發(fā)明，也可使用其它試劑。例如，可用其它去污劑代替脫氧膽酸純化重組蛋白。這類去污劑包括非離子去污劑，如Tween 20(多山梨醇酯20)、Tween 80、Lubrol和Triton x-100。
1總蛋白是根據(jù)280nm處的吸光率估計的。
實施例8A。gp160顆粒的裝配作為本發(fā)明的一個方面，已發(fā)現(xiàn)被純化過程中g(shù)p160抗原能夠被裝配成分子量等于或大于2，000，000的顆粒。從細胞中提取的gp160蛋白是由80-90%單體(分子量160，000)和10-20%聚合物(顆粒形式)組成的混合物。對該部分(凝膠過濾柱中流出的第一峰)中純化gp160的嘗試提示它與其它細胞蛋白質(zhì)甚至與膜碎片復(fù)合。但是，在自凝膠過濾柱中流出的第二峰中的gp160分子量約為160，000-300，000，因此它主要是單體或二聚體形式的。
gp160聚集物或聚合物的形成發(fā)生在兵豆植物凝血素柱展層過程中。已明確無論是在0.5%脫氧膽酸鹽(它約為脫氧膽酸鹽的0.2%臨界膠囊濃度(CMC))中從植物凝血素柱洗脫的，還是在0.1%脫氧膽酸鹽中從柱上洗脫的，該抗原均形成聚集物。
在高分辨率FPLC Superose 12柱(Pharmacia)上測定聚集物的大小。不同批號有代表性的純化的gp160樣品大多具有等于或大于藍葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的分子量(2，000，000)。
由Schwaller等(1989)所進行的交聯(lián)研究證實，昆蟲細胞中產(chǎn)生的gp160是由相等亞單位組成的四聚體。該研究還顯示HIV感染的細胞及病毒顆粒中的gp160為四聚體。因此，重組gp160顆?？赡芫哂信c天然HIV gp160相似的三級和四級結(jié)構(gòu)。
為了形成為gp160正確折疊所需的抗原決定簇，合適的三維結(jié)構(gòu)可能很重要。很可能是由于非糖基化蛋白在與兵豆植物凝血素柱結(jié)合和洗滌過程中失去了與gp160抗原的聯(lián)系，gp160的疏水部分開始形成分子內(nèi)聯(lián)系。由于其濃度可保持在CMC以上，脫氧膽酸鹽很可能不與gp160結(jié)合，抗原仍可形成復(fù)合物。當(dāng)按照本發(fā)明的方法純化該抗原時它便裝配成聚合物，似乎是該蛋白質(zhì)的固有性質(zhì)。這可能是存在于gp160蛋白上的非常疏水的N-末端序列導(dǎo)致該蛋白質(zhì)具有形成顆粒的天然能力。純化之后，可在不明顯喪失蛋白質(zhì)的情況下通過0.2μm的乙酸纖維素濾膜對gp160復(fù)合物進行無菌過濾。
B.分析顆粒的形成用電子顯微鏡觀察純化的gp160顆粒，證明它們是類似蛋白質(zhì)的30-100μm的球形顆粒。
鑒定顆粒存在的另一項試驗是用凝膠過濾法分析純化的gp160。將約100μg gp160加到Superose 12，F(xiàn)PLC凝膠過濾HR 10/30柱(Pharmacia，Inc.)上。該柱首先用蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品校正。自該柱獲得的蛋白質(zhì)分布圖具有很高的可重復(fù)性;洗脫體積與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的分子量成反比。該柱將單體gp 160與多聚體分離開并排除分子量等于或大于2×106的球狀蛋白質(zhì)。在該柱上展層時基本上所有純化的gp160均在外水容積中洗脫，因此其分子量大小等于或大于2×106(2，000，000)。
實施例9A。gp160吸附到明礬上不溶性鋁化合物作為免疫佐劑的效力取決于抗原在固相表面上吸附的完全度。作為本發(fā)明的一部分，已發(fā)現(xiàn)可制得這樣的明礬組合物，它們可在不減少gp160-明礬復(fù)合物作為免疫原之效力的PH條件下有效地吸附gp160。在明礬(磷酸鋁凝膠)組合物形成過程中所要控制的因素有1.抗原吸附于明礬上的最佳PH約為5.0。但是，已發(fā)現(xiàn)與PH7.5相比，在PH6.5時gp160喪失免疫原性，因此要在PH7.1±0.1條件下制備明礬。已發(fā)現(xiàn)在該PH值時基本上100%的gp160仍將被吸附在明礬上。
2.來自NaCl的離子強度相對較低，且小于0.15M。
3.相對于磷酸鈉具有摩爾過量的氯化鋁，以保證上清液中沒有游離的磷酸根離子。
4.將gp160抗原加至剛配制的明礬中，以終止結(jié)晶生長并盡量減小顆粒大小。
如下所述，制備200ml明礬并將純化gp160吸附到明礬上的方法應(yīng)保證抗原的最終濃度為40μg/ml。
3.試劑的制備(共配制200ml)
在100ml無菌無熱原瓶中制備下述溶液?；旌先芤?和溶液2的鹽及氫氧化鈉，并通過0.2μm的乙酸纖維素濾膜過濾至100ml無菌無熱原瓶中。
溶液1 AlCl3·6H2O 0.895gNaHAc·3H2O 0.136g溶于40ml注射用水(WFI)中,0.2μm濾膜過濾溶液2 Na3PO4·12H2O 1.234g溶于40ml WFI, 0.2μm濾膜過濾溶液3 NaOH 2.0g溶于100ml WFI,0.2μm濾膜過濾溶液4 Tris 1.25g溶于100ml WFI,加1ml至90ml WFI,用0.5N HLL調(diào)節(jié)pH至7.5,并用WFI加至100ml將溶液高壓滅菌30分鐘;緩慢抽空。冷卻至室溫。
C.明礬的生成1.用25ml無菌的一次性吸管將溶液1(氯化鋁-乙酸鈉)加到配制容器中，記錄溶液1的體積并開始攪拌溶液。
2.用25ml無菌一次性吸管將溶液2(磷酸鈉)加至溶液中，繼續(xù)攪拌至形成沉淀，記錄溶液2的體積。
3.加入3ml溶液3(氫氧化鈉)并繼續(xù)攪拌5分鐘、取0.5ml樣品測定PH值。如果PH低于7.0，再加0.5ml氫氧化鈉，繼續(xù)攪拌5分鐘后再次測定PH。繼續(xù)該過程至PH為7.0-7.2。
4.測定加至配制容器中的總體積(溶液1+溶液2+溶液3)，然后加無菌WFI將體積補足到100ml。
5.迅速將溶于100ml 1mM Tris(PH7.5)內(nèi)的8，000μg純化的gp160直接加到配制容器中。
6.至少繼續(xù)攪拌20分鐘，然后將配好的疫苗分裝至無菌小瓶中。
實施例10明礬吸附的gp160的免疫原性(特異性Ab反應(yīng))所采用的測定抗原制劑(疫苗)免疫原性的方法是測定一組已給予單劑量抗原的小鼠的特異性抗體反應(yīng)。于4周末給小鼠放血，并通過常規(guī)抗體試驗(如ELISA，酶聯(lián)免疫吸附試驗)測定血清中抗特定抗原(通常是用于免疫動物的抗原)的抗體水平。
表4總結(jié)了沒有在PH6.0和PH7.5條件下吸附了明礬佐劑(實施例9)的或與弗氏完全佐劑混合的純化的gp160在小鼠體內(nèi)的免疫原性。
2小鼠在免疫后28天放血，并用ELISA檢測法檢測血清(1∶10稀釋)中的抗凝膠純化之gp160的抗體滴度。利用商品ELISA藥盒(Genetic Systems Inc.;EIAtmELISA)檢測血清(1∶400稀釋)中抗天然HIV-1蛋白的抗體也得到相似結(jié)果。
3血清轉(zhuǎn)化小鼠數(shù)(P)比被檢小鼠總數(shù)(N)。
用1.0μg不加任何佐劑的gp160抗原一次免疫的小鼠將誘發(fā)出針對gp160的抗體反應(yīng)(見上表)。但是，在用1.0μg吸附于明礬佐劑上的gp160免疫的小鼠組中觀察到更強的抗體反應(yīng)。與完全弗氏佐劑混合或與明礬佐劑配制的小于0.1μg的單劑量gp160將使被免疫小鼠產(chǎn)生50%以上的血清轉(zhuǎn)化。盡管低于這一極值時gp160作為PH7.5和PH6.0時未配制的抗原在小鼠中仍有免疫原性，但在更低的PH值時免疫原性將有所丟失。
實施例11明礬吸附的gp160的免疫原性(ELISA血清研究)候選疫苗誘發(fā)免疫反應(yīng)的能力是一個非常重要的生物學(xué)特性。為了證實用明礬佐劑配制的gp160疫苗在動物中的免疫原性并證實明礬佐劑能增強該免疫原性，進行如下實驗。
于0天，分別用單劑量(0.5μg，1.0μg或5.0μg)gp160、吸附于明礬佐劑上或完全弗氏佐劑(CFA)上的gp160免疫小鼠(10組)。第28天給小鼠放血，并用ELISA法檢測血清(1∶10稀釋)中抗gp160抗體的存在。
從第28天抽取血清所獲得的結(jié)果總結(jié)于下表(表5)中。在所有各組中，均有50%以上的小鼠顯示血清轉(zhuǎn)化。在所有劑量下，在用吸附于明礬佐劑的gp160免疫的小鼠所獲得血清轉(zhuǎn)化數(shù)和平均血清吸收值(在ELISA中以1∶10稀釋的OD450nm值)均高于在僅用gp160免疫的小鼠中所獲得的數(shù)值。
該結(jié)果證明明礬佐劑明顯地增強了gp160抗原的免疫原性。
4在用0.5μg、1μg或5μg VaxsyntmHIV-1免疫后第28天發(fā)生血清轉(zhuǎn)化的小鼠數(shù)(P)與試驗小鼠總數(shù)(N)之比。
5用針對gp160的Sponsor′s ELISA檢測法檢測1∶10稀釋度血清以確定發(fā)生血清轉(zhuǎn)化之小鼠血清的平均吸收值(OD450)。
實施例12中和數(shù)據(jù)HIV-1中和試驗是用于測定抗體制劑是否將抑制HIV-1病毒感染培養(yǎng)的易感人淋巴細胞的方法。在HIV-1中和試驗中，對用gp160免疫的動物的抗血清進行了檢測，其結(jié)果總結(jié)于下面的表6中。
6在第一/第二/第三次免疫時所投予的gp120或gp160的微克數(shù)。
7相對于接觸未免疫動物血清的HIV-1感染細胞產(chǎn)生50%抑制的最高抗血清稀釋度。
實施例13在黑猩猩之中的免疫原性從遺傳角度來看、黑猩猩與人最接近，且目前它是HIV-1感染的唯一動物模型。在三只黑猩猩之中進行的安全性/免疫原性試驗中，用明礬佐配制的疫苗中的40μg或80μg gp160免疫兩只黑猩猩、于第4周分別用40μg或80μg gp160對兩只黑猩猩進行加強免疫。同時用1ml鹽水溶液接種對照動物。每周采集血清樣品，用MccroGeneSys公司開發(fā)的針對純gp160的ELISA檢測法、Western印跡分析法及使用商品ELISA檢測藥盒的三種免疫檢測法對三只黑猩猩的抗gp160抗體和抗HIV-1病毒抗原抗體進行分析。分析結(jié)果如下所述。
A.ELISA(MGSearch HIV 160)ELISA檢測法(MGSearch HIV 160，MGSearch是MceroGenesys 公司(Meriden，Conneeticut U.S.A)產(chǎn)品的商標(biāo))是針對于gp160的免疫吸附檢測法，并已在在共同未決共同轉(zhuǎn)讓的美國專利申請系列號920，197(現(xiàn)在的系統(tǒng)號為585，266)中作了描述。
將免疫前及初次免疫后第11周所采集的血清樣品在1∶10-1∶100，000的范圍內(nèi)稀釋，然后與每點上含有100μg純化之gp160的硝酸纖維素條一起保溫。終點稀釋滴度為最高稀釋度，其中當(dāng)用單抗人IgG一堿性磷酸酶連接物進行檢測時該試驗對抗gp160抗體為陽性。
得自對照動物及免疫動物的免疫前血清的血清樣品為陰性。接受80μg劑量的黑猩猩到第2周時在1∶100稀釋度為陽性，接受40μg劑量的黑猩猩到第4周時才在1∶10稀釋度處呈現(xiàn)陽性?？筭p160的抗體滴度一套增加至第5周，至此終點稀釋滴度分別約為1∶100，000和1∶2，000，000。在6-11周兩只動物的抗體滴度均稍微下降。
這一類型的免疫反應(yīng)無論是在定性上還是定量上均已在已用人乙型肝類病毒疫苗接種的黑猩猩之中所觀察到的抗體反應(yīng)相似。
B.商業(yè)性ELISA試驗從對VaxSyn(MicrogeneSys公司的艾滋病疫苗的商標(biāo))免疫的黑猩猩進行的MGSearch HIV 160 ELISA和Western印跡分析中可清楚看出，它們已產(chǎn)生血清轉(zhuǎn)化并具有天抗亞組gp160的抗體。為了測定它們是否也產(chǎn)生識別天然病毒包膜蛋白的抗-HIV抗體，在被許可的市售ELISA試驗藥盒即Genetic System Corporation(Seattle，Washington)公司的LAV EIAtm試驗藥盒中對免疫前血清及1-11周后的血清進行試驗。用80μg gp160免疫的動物至第2周在1∶100稀釋度處開始出現(xiàn)陽性，且其抗體水平直到第6周一直表現(xiàn)為增加。用40μg gp160免疫的動物直到第6周才在1∶100稀釋度處呈現(xiàn)陽性。
實施例14抗體在gp120和gp41之間的分配測定接種動物中產(chǎn)生的抗gp160抗體反應(yīng)是否也抗gp41gp120或這兩者是很重要的。采用包括放射性免疫沉淀法(RIP)、熒光免疫法(IF)、Western印跡分析法(WB及定量ELISA法在內(nèi)的各種免疫學(xué)方法對三種不同的重組包膜抗原進行分析以檢測和測定抗體在HIV-1包膜蛋白的各個部分間的分配。
圖6總結(jié)了以下三種不同重組抗原的免疫反應(yīng)性〔ART〕〔TAB〕〔1〕gp120-δ〔其為分子的C-末端缺失了約40個氨基酸的截短的重組HIV-1 gp120〕;〔ART〔TAB〕(2)gp120(全長重組HIV-1gp120)及〔ART〕〔TAB〕(3)gp160。
自50個HIV-1抗體陽性個體獲得的人血清及3份混合的人血清與gp160有免疫反應(yīng)性，與gp120有中等反應(yīng)性，與截短的gp120沒有反應(yīng)或僅有很弱的反應(yīng)性。這很可能是因為代表了90%以上HIV-1外部糖蛋白之截短gp120含有保護性決定簇。艾滋病陽性人血清中僅有很少的抗該部分包膜的抗體，這一觀察結(jié)果與免疫反應(yīng)對病毒感染不具有完全保護及陽性人血清在體外通常顯示出低水平中和活性這一確實相一致。
與此相反，用gp160免疫原或截短的gp120免疫的恒河猴具有與HIV-1包膜截短的gp120部分強烈反應(yīng)的抗體這種病毒包膜中抗體識別位點分布上的差異可能是由于猴血清具有較高的中和滴度。
用人和免疫恒河猴血清對這三種重組包膜抗原的免疫反應(yīng)性所作的定量評值示于圖7中。包括來自用gp160免疫的動物的血清在內(nèi)的所有被試猴血清均具很高的抗截短之gp120抗原(gp120-δ)的抗體滴度。
這些結(jié)果證明重組gp160在恒河猴中誘發(fā)了不同于在天然感染過程中常常發(fā)生的免疫反應(yīng)。在gp-160的gp120-δ區(qū)域中具有能在已免疫猴中被有效識別的抗原決定簇，它在感染過程中未被人體免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)。這類新的抗原決定基對抗HIV-1保護作用可能很重要，且可能是用于預(yù)防和治療HIV感染的重組gp160的重要性質(zhì)。
實施例15治療疫苗的使用用30個HIV血清陽性患者進行臨床試驗以確定用克隆的HIVgp160(在如上所述的桿狀病毒系統(tǒng)中產(chǎn)生)接種后對HIV感染個體的影響。
用重組gp160接種后導(dǎo)致30個HIV血清陽性志愿者中有19人(63%)的gp160HIV一特異性體液和細胞免疫反應(yīng)增強。15個接受6劑量疫苗的志愿者中有14人(93%)顯示出其總gp160抗體的增加。因此，可按有利方式使用重組HIV蛋白(即rgp41，rgp120，rgp160及其混合物)治療被HIV感染的患者。
可按照在領(lǐng)域熟知的技術(shù)確定出用于本發(fā)明該實施方案中的HIV蛋白的有效量。一般來說，該有效量的范圍為每千克患者體重約1-100μg。也可按已知的方法確定服用次數(shù)。在一優(yōu)選實施方案中，是通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)等胃腸道外途徑給藥。
A。志愿人員的篩選吸收30個被HIV被HIV感染的志愿人員，只有患有早期HIV感染一稱作Waltar Keed一期或二期(CD4細胞計數(shù)在3個月以上期間內(nèi)不少于400個，有或無淋巴結(jié)病)一的血清陽性志愿人員才有資格入選(Kedfield，etal，New Engl J.Med.314;131-132(1986))。其它入選條件包括志愿人員限定為18-50歲的成年人，其有正常的全血細胞計數(shù)，無終末器官疾病癥狀，在前12個月的時間內(nèi)未濫用酒精或毒品，并且未接受過抗逆病毒藥或免疫調(diào)節(jié)藥物。在被隨機分成若干治療組之前，對所有患者均進行了2個月的基線評估。在試驗過程中所有志愿人員均未接受任何的抗逆病毒藥物或免疫調(diào)節(jié)藥物。
30個志愿人員中有26個為男性，4個為女性。14個白種人，13個黑人，3個西班牙人。其平均年齡為29(18-49)。在入選時8個志愿人員為Walter Keed一期，22個為Walter Keed二期?；€平均CD4計數(shù)為668個(范圍為388-1639)。最初確診到進入研究之間的平均時間為24個月(從3個月至49個月)。
B.疫苗產(chǎn)物及免疫方案如本文所述，試驗疫苗包括得自桿狀病毒表達之重組蛋白質(zhì)的gp160的非感染性亞單位糖蛋白。該免疫原蛋白是在鱗翅目昆蟲細胞中產(chǎn)生的，經(jīng)過生物化學(xué)純化并被吸附至磷酸鋁上以作為最終疫苗制劑。
使用了以下三種劑量的gp160制劑;40μg/ml，160μg/ml和320μg/ml。40μg及160μg劑量的注射體積為1ml;使用2ml注射液(320μg/ml)輸送640μg劑量的疫苗。
30個志愿人員被分成6組，每組5人。對兩種免疫方案進行了研究方案A，在第0、30和120天接種;方案B，在第030、60、120、150和180天接種。在每種免疫方案(A或B)中均有三組志愿人員接受了不同劑量的疫苗(表7)。所有接種物均通過肌內(nèi)途徑注射到三角肌內(nèi)。試驗期為10個月2個月的基線評估及開始接種后8個月的隨訪評估。
表7-免疫方案gp160的給藥量(μg)天 0 30 60 120 150 180方案A第1組 40 40 40第3組 160 160 160第5組 640 640 640方案B第2組 40 40 40 160 160 160第4組 160 160 160 640 640 640第6組 640 640 640 640 640 640
C.安全性和毒性的評定在每次注射后的第0、1、2、3、15和30天對每一位志愿人員進行問診和檢查，了解其有無發(fā)熱、寒冷、惡心、嘔吐、關(guān)節(jié)痛、肌痛、不適、蕁麻疹、氣喘、頭暈或頭痛等癥狀為評定在注射部位發(fā)生的局部反應(yīng)所進行的檢查包括觀察紅斑、腫脹、癢、疼痛和觸痛、皮膚變色、皮膚損傷、局部淋巴結(jié)病的變化、注射肢體的功能變化以及注射部位皮下小結(jié)的形成。對每月的全血計數(shù)、血清化學(xué)、凝血曲線及尿液分析的結(jié)果也進行了評定。
按照Richman等人Clinical Lmmuno S285-95，1989Birx等人J.Acguir.lmmue Defic、Syndr、4188-196，1991所述的方法，通過T-細胞表型檢測還評價了總淋巴細胞，CD4和CD8細胞表型未評定體外細胞免疫功能。還評價了T-細胞對有絲分裂素美洲商陸及ConA和對照抗原Candidealbicans和tetanus的增殖性反應(yīng)Birx等，同上通過對照抗原即流行性腮腺炎、破傷風(fēng)類類毒素、Candida albicans和毛癬菌的遲發(fā)性超敏性皮膚試驗評估體內(nèi)細胞免疫功能。
按照Burke等人J.Acguir.lmmnuke Defic·Syndr·31159-1167，1991所述的方法對外周血單核細胞PBMC及血漿的定量病毒培養(yǎng)物進行評估。評估DNA聚合酶鏈反應(yīng)Wages，etal，J.Med.Virol.3358-63，1991)和血清p24抗原水平以監(jiān)測體內(nèi)HIV病毒容量。
未觀察到全身性毒性，但在87%的對象(每組中13個)中發(fā)現(xiàn)有局部反應(yīng)原性。局部反應(yīng)包括注射部位硬化、觸痛及形成短暫的皮下小結(jié)。很少發(fā)現(xiàn)局部腺病的增加。沒有人拒絕接受加強注射。在初次免疫、加強注射或定量給藥時所觀察到的局部反應(yīng)次數(shù)沒有差異。通過體外有絲分裂素和抗原特異性增殖應(yīng)答、或體內(nèi)遲發(fā)性皮膚超敏試驗或通過定量CD4細胞清除的加速證實其對免疫系統(tǒng)沒有副作用。對于疫苗反應(yīng)者和非反應(yīng)者，基線平均CD4細胞計數(shù)分別為716和605。對于疫苗反應(yīng)者和非反應(yīng)者，在研究開始的第180-240天的平均CD4細胞計數(shù)分別為714和561。在歷時240天的試驗過程中，疫苗反應(yīng)者中平均CD4細胞計數(shù)的凈改變?yōu)?0.2%，而在疫苗非反應(yīng)者中平均CD4細胞計數(shù)下降了7.3%(圖11)。在整個試驗過程中的任何個體中，疫苗誘導(dǎo)的HIV免疫原性與CD4的加速下降沒有關(guān)聯(lián)。
為了評估作為接種結(jié)果的HIV繁殖及病毒在個體中的負荷增加的可能性，通過定量血漿和PBMC病毒培養(yǎng)物、PBMC DNA聚合酶鏈反應(yīng)和P24抗原的血清水平來測定體內(nèi)病毒活性。定量培養(yǎng)物和DNA聚合酶鏈反應(yīng)檢測法證明在該試驗過程中沒有改變。在個體中未檢測到血清P24抗原。
D.免疫原性評估利用重組產(chǎn)生的病毒基因產(chǎn)物gp160、p66、p24和原型HIV病毒株MN的全病毒溶解產(chǎn)物來測定抗整個HIV蛋白的抗體。使用Toubin等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 764350-4354(1979))所述的點印跡和Western印跡技術(shù)。同時檢測對特定包膜抗原決定簇的抗體反應(yīng)(見圖7)。
圖7中所選擇的是抗原決定簇88(gp120中的第88-98位氨基酸)和448c(gp120中的第448-514位氨基酸)，因為據(jù)報道抗gp120的這些區(qū)域的抗體與早期HIV感染相關(guān)。
之所以選擇抗原決定簇106(gp120中的第106-121位氨基酸)、241(氨基酸241-272)、254(氨基酸254-272)、300(氨基酸300-340)、308(氨基酸308-322)、422(氨基酸422-454)和735(氨基酸735-752)是因為它們具有推測的功能重要性。抗原決定簇106和422影響CD4結(jié)合;抗原決定簇241、254和735影響到組群特異性中和作用;抗原決定簇300和308影響到類型特異性中和作用。
之所以選擇抗原決定簇582(氨基酸582-602)作為對照是因為它代表了天然HIV感染中的免疫優(yōu)勢包膜區(qū)域。其它被研究的抗原決定簇包括49(氨基酸49-128)和342(氨基酸342-405)。
圖7中，陰影框代表了有文獻記載的HIV包膜針對性免疫反應(yīng)的變化。帶有(＝)的陰影框表示初級體液反應(yīng);帶有(+)的陰影框表示次級體液反應(yīng);(-)表示對特定的抗原決定簇免疫前和免疫后的抗體陰性;(+)表示對特定的抗原決定簇免疫前和免疫后抗體陽性，但無定量變化。帶有(·)的陰影框表示對gp160后續(xù)免疫的新的T-細胞增殖反應(yīng)。單獨的(·)表示對gp160無細胞反應(yīng);hb表示“高本底”(不可解釋);nd代表“未做”。
用Nara(Nature，333469-470(1988))所述的合胞體抑制檢測法檢測了對三個原型分離物(HIV-ⅢBRF和MN)的中和活性。按照已知的淋巴細胞增殖檢測技術(shù)，用gp160，p24和桿狀病毒表達系統(tǒng)對照蛋白(Birx，同上)檢測HIV特異性細胞免疫反應(yīng)。
E.疫苗反應(yīng)者和非反應(yīng)者對于被試人員只要針對HIV包膜特異性抗原決定簇的細胞和體液免疫反應(yīng)出現(xiàn)與接種系列有關(guān)的可重復(fù)的選擇性增加(圖7)就將其歸類為疫苗反應(yīng)者中。疫苗誘導(dǎo)的體液免疫性被定義為針對HIV包膜特異性抗原決定簇的血清轉(zhuǎn)化和/或針對包膜特異性抗原決定簇的二次加強免疫反應(yīng)。疫苗誘導(dǎo)的細胞免疫性被定義為針對gp160形成新的、可重復(fù)的、疫苗相關(guān)性的細胞增殖反應(yīng)(這一疫苗反應(yīng)者的定義相對這一試驗的科學(xué)目的，如評估感染后免疫的適用性而言是非常嚴(yán)格的)。對gp160抗原決定簇或HIV包膜既不產(chǎn)生體液反應(yīng)也不產(chǎn)生細胞增殖反應(yīng)的個體或僅產(chǎn)生體液反應(yīng)或細胞增殖反應(yīng)的個體定為非反應(yīng)者。
F.疫苗誘導(dǎo)的體液反應(yīng)參見圖7，30個被檢者中有19個(63%)顯示出疫苗誘導(dǎo)的gp160 HIV特異性體液和細胞免疫反應(yīng)的增強。這19個病人被定為“疫苗反應(yīng)者”。11個“非反應(yīng)者”中有4個人僅出現(xiàn)體液或細胞免疫反應(yīng)。所有7個未顯示任何可檢測之疫苗誘導(dǎo)的反應(yīng)的病人僅接受了3個劑量的疫苗(方案A)。未測得抗體與HIV聚合酶(p66)、結(jié)構(gòu)性(p24)基因產(chǎn)物或非HIV對照抗原(破傷風(fēng))之結(jié)合能力的變化。在任何個體中均未形成抗桿狀病毒鱗翹目昆蟲細胞對照蛋白的抗體。
利用全病毒裂解產(chǎn)物HIV-MN，通過Western印跡法測得13個個體中出現(xiàn)包膜抗體(gp160)增加。方案A的15個病人中的3個(20%)和方案B的15個病人中的10個(67%)的抗包膜蛋白抗體增加(通過Fisher氏準(zhǔn)確度試驗測得p＝0.025，兩端拖尾)。所有13個個體也產(chǎn)生了針對特定包膜抗原決定簇的血清轉(zhuǎn)化。
與此相反，在未對任何包膜特異性抗原決定簇發(fā)生血清轉(zhuǎn)化的10個個體中，通過Western印跡分析未發(fā)現(xiàn)任何個體的包膜抗體增加。通過Western印跡未發(fā)現(xiàn)在剩余的7個個體中出現(xiàn)整個病毒包膜抗體的變化。未在任何個體中觀察到抗非包膜HIV蛋白抗體的變化。
方案B(6劑量)的15個個體中有14個(93%)顯示了總gp160抗體的增加，而在方案A(3劑量)的15個個體中只有7個顯示出抗體增加(P＝0.01)(圖7)。
如圖8所示，每一gp160特異性抗原決定簇從免疫前至接種后的優(yōu)勢分別為抗原決定簇49(27-70%)，抗原決定簇88(28-52%)、抗原決定簇106(50-87%)，抗原決定簇214(0-14%)，抗原決定簇254(0-13%)，抗原決定簇300(47-77%)，抗原決定簇308(42-69%)，抗原決定簇342(0-27%)，抗原決定簇422(3-10%)，抗原決定簇448C(73-87%)和抗原決定簇735(17-33%)。觀察到抗除582以外的所有特異性抗原決定簇的疫苗誘導(dǎo)的血清轉(zhuǎn)化(圖7)。抗抗原決定基241、254或342的抗體(血清轉(zhuǎn)化)僅在后續(xù)免疫時檢測得。
檢測對以下抗原決定簇的次級免疫反應(yīng)88，106，300448C和582。對抗原決定簇582的抗體優(yōu)勢100%是在免疫前出現(xiàn)的，且僅在一個病人(3%)中證明有次級免疫反應(yīng)。
疫苗誘導(dǎo)的抗包膜抗原決定簇HIV抗體的反應(yīng)曲線是可變的(圖7)。在20個個體中產(chǎn)生了針對至少一個抗原決定簇的初級抗體反應(yīng);分別為15人的組中有14人接受方案B，6人接受方案A(P＝0.005，F(xiàn)isher's，兩尾)。采用方案A的病人僅對110個潛在的對其無預(yù)免疫抗體的抗原決定簇中的15個(14%)產(chǎn)生血清轉(zhuǎn)化。采用方案B的病人對129個抗原決定簇中的60個(47%)產(chǎn)生血清轉(zhuǎn)化。(P＜0.0001，F(xiàn)isher's，雙尾)。在隨機化采用方案B的9個病人(60%)對三個或多個包膜抗原決定簇發(fā)生血清轉(zhuǎn)化，但方案A組僅2個病人(13%)產(chǎn)生對三個或多個包膜抗原決定簇的血清轉(zhuǎn)化(P＝0.02 Fisher's，雙尾)。
于第0、90和195天在檢測7個個體對于三個不同病毒株(HIV-ⅢB，MN和RH)的血清中和活性。5個疫苗反應(yīng)者中有4個顯示有對一個或多個分離物之中和活性的增強。與非反應(yīng)者相比，疫苗反應(yīng)者抑制合胞體形成的能力也有所提高。
G。疫苗誘導(dǎo)的細胞反應(yīng)細胞免疫反應(yīng)的變化是基于利用Wilcoxon行列求和試驗(rank sum test)來比較接種前(基線)和接種后平均淋巴細胞刺激指數(shù)(LSI)確定的。
免疫后30個個體中有21人(70%)產(chǎn)生了針對gp160的新的T細胞增殖反應(yīng)(圖7)。
圖9說明了四個典型疫苗反應(yīng)者中于不同時間出現(xiàn)的針對gp160、p24和桿狀病毒對照蛋白的細胞增殖反應(yīng)。對于所有個體，gp160誘導(dǎo)的增殖從基線平均LSI為3增加至10(利用末次免疫后4個數(shù)值的均數(shù)算出)。相反，針對于HIV p24蛋白或?qū)φ諚U狀病毒蛋白的增殖反應(yīng)則未發(fā)生變化。
圖10說明了所有個體、根據(jù)疫苗反應(yīng)性分組的個體以及根據(jù)免疫方案分組的個體中所出現(xiàn)的疫苗誘導(dǎo)的平均LSI值的變化。
疫苗反應(yīng)者和非反應(yīng)者在對gp160的增殖反應(yīng)的變化方面明顯不同(＜0.0001，Wilcoxon'一側(cè)拖尾)。由方案B(6劑量)誘導(dǎo)的gp160增殖反應(yīng)高于由方案A(3劑量)誘導(dǎo)的gp160增殖反應(yīng)(P＜0.10，Wilcoxon'一側(cè)拖尾。
對gp160產(chǎn)生增殖反應(yīng)的21個病人中，有19人也發(fā)展了體液反應(yīng)(疫苗反應(yīng)者)。對于所有疫苗反應(yīng)者，所觀察到的對gp160的最大平均淋巴細胞刺激指數(shù)(LSI)均為50.1但是，每一疫苗反應(yīng)者的反應(yīng)都是可變的(峰值范圍從LSI為3至171)(圖7)，正如對gp160的細胞反應(yīng)與接種量和反應(yīng)期間的暫時相互關(guān)系那樣(圖9)。
H.結(jié)果討論盡管該試驗的樣本數(shù)有限，但已證實有幾個因素與疫苗免疫原性有關(guān)，對于方案A，15個病人中有6個(40%)為疫苗反應(yīng)者，而在方案B的15個病人中有13個(87%)為疫苗反應(yīng)者)(P＝0.02，F(xiàn)isher's，雙拖尾)(圖7)。在平均基線CD4計數(shù)大于每毫升600的16個病人中有13個(81%)為疫苗反應(yīng)者，而在平均進入CD4計數(shù)小于每毫升600個細胞的14個病人僅有6個(43%)為疫苗反應(yīng)者。如表8中所總結(jié)的那樣，多次免疫能改進免疫原性，甚至對于其基線CD4計數(shù)小于每毫升600個細胞的病人也是如此。例如，與接受3次注射(方案A)的8個病人中僅有1個為疫苗反應(yīng)者相比，方案B(6次注射)的6個病人中有5個為疫苗反應(yīng)者(P＝0.03，F(xiàn)isher's，雙拖尾)(表8)表8根據(jù)基線CD4數(shù)和免疫方案確定的GP160疫苗免疫反應(yīng)性CD4計數(shù) N 反應(yīng)者數(shù)(%) 非反應(yīng)者數(shù)(%)方案A>600 7 5(71%) 2(29%)500-600 5 1(20%) 4(80%)<500 3 0(%) 3(100%)小計 15 6(40%) 9(60%)方案B>600 9 8(89%) 1(11%)500-600 2 2(100%) 0(0%)<500 4 3(75%) 1(25%)小計 15 13(87%) 2(13%)總計 30 19(63%) 11(37%)·在十九世紀(jì)巴斯德就已將疫苗應(yīng)用于治療急性狂犬病感染。但沒有深入探討過這種治療手段在對付其他感染中的實用性。盡管有一些改進感染后病毒特異性免疫的實例(如接觸甲型或乙型肝炎病毒后)，但沒有充分證據(jù)證明該方法在人體內(nèi)對已形成或慢性病毒感染的可行性。
因此，本發(fā)明提供了通過感染后的主動免疫改善病毒特異性免疫的方法。具體地說，對于早期HIV感染的30個病人中的19個來說，衍生于HIV包膜基因的gp160疫苗增強了人體宿主針對性病毒特異性體液和細胞免疫反應(yīng)。
該研究定性并定量地測定了在與感染后免疫相對的天然感染免疫中針對于特定HIV抗原決定簇的不同抗體反應(yīng)。在這方面，已在70%個體中精確測定了疫苗在已感染的個體中誘導(dǎo)了體液免疫原性。例如，20個個體(19個疫苗反應(yīng)者和1個疫苗無反應(yīng)者)已對特定的包膜抗原決定簇發(fā)生血清轉(zhuǎn)化。血清轉(zhuǎn)化僅與對10個病人進行的疫苗接種(抗原決定簇241，254和342有關(guān)。
因此，對通過抗原決定簇作圖所鑒定的針對該疫苗的體液反應(yīng)的改變，將使得對特定抗體反應(yīng)的預(yù)期起因和效果進行分析成為可能，并且提供了鑒定天然感染過程中所未誘發(fā)的潛在免疫調(diào)節(jié)機制獨特的機會。
盡管目前還不知道血清中和活性的體內(nèi)相關(guān)性，但觀察到在5個疫苗反應(yīng)者中有4個提高了抗不同HIV病毒株(MB、RF、MN)的中和活性，提示感染后免疫誘導(dǎo)了功能性抗體的變化。試驗疫苗誘導(dǎo)了對特定HIV株血清中和能力的提高。并且可能將有助于限定組群特異性中和抗原決定簇。
對HIV包膜蛋白的增殖反應(yīng)很少發(fā)生在天然HIV感染中。但是在用gp160免疫后，在21個病人(70%)中證實了特異性T-細胞增殖反應(yīng)。這一差異的原因還不清楚。一種可能是引起了一種針對疫苗特有的包膜抗原決定簇的新的增殖反應(yīng)(作為疫苗生產(chǎn)方法或體內(nèi)抗原加工的結(jié)果)?；蛘?，用于增殖檢測的蛋白質(zhì)可能未刺激針對天然病毒的同源“野生型”包膜的初級T-細胞增殖反應(yīng)。但是，已得到了疫苗接種可提高宿主細胞免疫反應(yīng)的其它證據(jù)已在所選擇的疫苗反應(yīng)者中證實HIV-ⅢB型特定性胞毒性T-細胞反應(yīng)產(chǎn)生于加強免疫之后。
負責(zé)HIV感染病人之疫苗免疫反應(yīng)性的因素還有待澄清。即使在早期HIV感染的情況下，與相應(yīng)的對照相比，個體對各種疫苗都可產(chǎn)生較理想的免疫反應(yīng)。這一超反應(yīng)性與早期B細胞調(diào)節(jié)障礙和T-細胞機能障礙有關(guān)。因此，疫苗免疫應(yīng)答性與基線CD4細胞計數(shù)相關(guān)，而這正與宿主的免疫狀態(tài)是疫苗反應(yīng)性的重要決定因素這一假設(shè)相一致。但在特異性T-細胞計數(shù)間隔內(nèi)的免疫方案也影響到疫苗反應(yīng)性方案B(6次注射)更為優(yōu)越。事實上，通過增加接種次數(shù)也可以使在低CD4細胞計數(shù)之病人中觀察到的疫苗反應(yīng)的降低得到改善，此提示可通過改變劑量、給藥方式、佐劑或配方來進一步改善宿主免疫反應(yīng)性。
盡管用HIV特異性疫苗產(chǎn)物對HIV感染的患者進行主動免疫的安全性已引起關(guān)注，但目前沒有產(chǎn)生免疫特異性毒性的證據(jù)。定量培養(yǎng)物、DNA聚合酶鏈反應(yīng)檢測以及血清抗原檢測顯示出體內(nèi)HIV負荷的增加。病人中，尤其是分類為疫苗反應(yīng)者的病人中，HIV復(fù)制的一個極好的體內(nèi)標(biāo)記-CD4細胞下降率-受到有利地影響。反應(yīng)者的平均CD4計數(shù)變化為-0.2%，無反應(yīng)者則為-7.3%。該數(shù)據(jù)說明感染后免疫反應(yīng)性與CD4破壞的增加無關(guān)，并提示與下降的HIV體內(nèi)受制相關(guān)。
在該項研究中，也將免疫接種結(jié)果與10個感染且未治療病人的年令、種族和基線CD4細胞計數(shù)等基本參數(shù)進行了比較。在該參考組中平均CD4計數(shù)下降了8.7%，接受方案A病人這一計數(shù)下降了7.2%，接受方案B的病人則增加了0.6%。這些結(jié)果說明用重組HIV包膜蛋白進行感染后免疫接種是可行的，而且就該疫苗的預(yù)防應(yīng)用來說該結(jié)果也是令人鼓舞的。
權(quán)利要求
1.對受人免疫缺陷病毒(HIV)感染的個體進行治療的方法，它包括給被感染個體使用重組HIV包膜蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中重組蛋白是以約1-100μg/千克體重的劑量使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中重組蛋白是以約10μg-4000μg的劑量使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中重組蛋白是以約40μg-1280μg的劑量使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中至少使用3個劑量。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中至少使用6個劑量。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中每一劑量以約30-60天的間隔使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中每一劑量以約30-60天的間隔使用。
9.治療受人免疫缺陷病毒(HIV)感染的個體的方法，它包括以足以提高HIV特異性細胞或體液免疫反應(yīng)的量給被感染的個體使用重組HIV包膜蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中重組蛋白是由桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)產(chǎn)生的。
11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中重組蛋白是由桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)產(chǎn)生的。
12.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中重組蛋白是由桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)產(chǎn)生的。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中重組蛋白的分子量約為145，000。
14.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中重組蛋白的分子量約為145，000。
15.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中重組蛋白的分子量約為145，000。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中HIV包膜為gp160、gp120及gp41中的至少一種。
17.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中HIV包膜為gp160、gp120及gp41中的至少一種。
18.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中HIV包膜為gp160、gp120及gp41中的至少一種。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中重組蛋白是由桿狀病毒昆蟲細胞載體Ac3046表達的。
20.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中重組蛋白是由桿狀病毒昆蟲細胞載體Ac3046表達的。
21.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中重組蛋白是由桿狀病毒昆蟲細胞載體Ac3046表達的。
22.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中重組蛋白聚集成分子量至少約為2，000，000的顆粒。
23.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中重組蛋白聚集成分子量至少約為2，000，000的顆粒。
24.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中重組蛋白聚集成分子量至少約為2，000，000的顆粒。
25.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中重組蛋白與佐劑相結(jié)合。
26.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中重組蛋白與佐劑相結(jié)合。
27.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中重組蛋白與佐劑相結(jié)合。
28.治療受人免疫缺陷病毒(HIV)感染的個體的方法，它包括給被感染個體使用由重組HIV包膜蛋白和明礬佐劑組成的組合物，其中重組蛋白已形成分子量至少約為2，000，000的顆粒。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中重組蛋白是由桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)產(chǎn)生的。
30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中重組蛋白選自于重組gp160、重組gp120、重組gp41、分子量約145，000的重組HIV包膜蛋白及由Ac3046載體表達的重組蛋白。
31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中重組蛋白包括gp160的757個連續(xù)氨基酸且基本上不包括gp160的40個連續(xù)末端的氨基酸。
32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中重組蛋白以約10μg-4000μg的劑量使用。
33.治療性HIV疫苗組合物，它包括重組HIV包膜蛋白及明礬佐劑，其中重組蛋白已形成分子量至少約為2，000，000的顆粒。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的組合物，其中重組HIV包膜蛋白是以每劑大約10μg-4000μg的量提供的。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中重組蛋白是由桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)產(chǎn)生的。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中重組蛋白包括gp160的約757連續(xù)的氨基酸且基本上不包括gp160 40個末端的氨基酸。
全文摘要
已在桿狀病毒昆蟲細胞載體系統(tǒng)中由克隆的HIV—1包膜基因產(chǎn)生出含有人缺陷免疫病毒、1型(HIV—1)包膜蛋白的獲得性免疫缺陷綜合癥(艾滋病)疫苗。重組HIV—1蛋白被純化裝配成顆粒并被吸附至磷酸鋁佐劑上。該艾滋病疫苗在HIV感染的個體中誘導(dǎo)出新的體液和細胞免疫反應(yīng)，并可作為疫苗療法劑用于推遲或預(yù)防病毒對免疫系統(tǒng)的破壞。
文檔編號C12R1/91GK1068266SQ9210451
公開日1993年1月27日 申請日期1992年6月11日 優(yōu)先權(quán)日1991年6月11日
發(fā)明者G·E·史密斯, F·沃爾沃維茨 申請人:微型基因體系公司