專利名稱：有機(jī)化合物的或涉及有機(jī)化合物的改進(jìn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適于從組織培養(yǎng)中再生整個(gè)植株的改進(jìn)的體細(xì)胞胚形成方法，更具體地講，涉及使用液體培養(yǎng)基本身通過體細(xì)胞胚形成而獲得體細(xì)胞胚的改進(jìn)方法。
人們認(rèn)為有效利用體細(xì)胞胚形成方法的商業(yè)化比(例如)有機(jī)生成的克隆更合乎需要，并且從經(jīng)濟(jì)上講，它更吸引人，因?yàn)樗邆湓谙鄬?duì)短的時(shí)間間隔內(nèi)得到更高產(chǎn)量的植物的潛力。
已知當(dāng)某些植物細(xì)胞在合適的植物組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，它們具有分化為整個(gè)植株的潛力。這樣的培養(yǎng)基通常含有無機(jī)鹽、碳源(如蔗糖、肌醇、硫胺素等等)。普遍使用的植物組織培養(yǎng)基的實(shí)例是Murashige and Skoog(MS培養(yǎng)基)、Gamborg的Lindsmaier and Skoog(B5培養(yǎng)基)，等等。
為了使所用的特定的植物細(xì)胞進(jìn)行最佳生長，可以改變植物組織培養(yǎng)基的組成。幾乎所有植物細(xì)胞都需要植物激素，如生長素或類似生長素的化合物，如吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸或2，4-D，和/或細(xì)胞分裂素(如芐基腺嘌呤、玉米素、激動(dòng)素)等。為了保證最理想的生長，加入如煙酸、吡哆素等維生素或其他組分(如椰子奶、酪蛋白水解產(chǎn)物等)也可能是有用的。
過去，真正的體細(xì)胞胚的形成需要使用愈傷組織材料，該愈傷組織材料含有具有非常大的液泡且未分化的細(xì)胞團(tuán)粒以及較小的有非常小的液泡的圓細(xì)胞，以該愈傷組織材料作為最初生長階段材料并可從中衍生出細(xì)胞胚。但是在體細(xì)胞胚形成中使用這樣的材料作為起始材料有許多缺陷，已證明，在獲得大量具有基本相似的表型和/或在倍性水平方面基本一致的植物時(shí)，它的使用受到限制。起源于愈傷組織的植物，其體細(xì)胞克隆在倍性水平方面顯示有變異和/或不整齊。(Chaleff R.S.(1983)Science 219676-682;Larkin P.J.(1987)Iowa State Journal of Research 61(4)393-434;De Klerk G-J(1990)Acta Bot.Neerl.39(2)129-144;Karp A.& Bright S.W.J.(1985)Oxford Surveys of Plant Molecular & Cell Biology 2199-234;Custers J.B.M.et al (1990) Acta Bot.Neerl.39(2)153-161(cucumis sativus L.);Kysely W.et al(1987)Plant cell Reports 6305-308(pisum sativum L.);Ezura H.(1992)Plant Science 85209-213(cucumis melo);and Kiviharju E.et al(1992)Plant Cell，Tissue，and Organ Culture 28187-194(Cyclamen persicum Mill)]已有已知的專利申請(qǐng)實(shí)例描述了愈傷組織材料在體細(xì)胞胚形成中的應(yīng)用。例如，WO 90/01058(Plant Genetics Inc)描述了使用愈傷組織材料來獲得體細(xì)胞胚，同時(shí)考察了使用多種合成生長素的效果。將合適的外植體材料在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)和/或再次培養(yǎng)許多星期后即形成或長成愈傷組織，然后通過將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有諸如2，4-D或它的一種類似物的植物激素的培養(yǎng)基中即開始體細(xì)胞胚形成。沒有提及體細(xì)胞胚的倍性水平或獲得的植物的倍性水平。在體細(xì)胞胚形成中使用愈傷組織材料可能有助于獲得植物，其中獲得的體細(xì)胞克隆變體或許對(duì)豐富有用的基因庫有意義，但對(duì)簡(jiǎn)單希望獲得具有基本相同的基因型的銷售量植物的種子商人和育種者來說則無甚用途。
公知已從由分生組織細(xì)胞組成的微團(tuán)將胡蘿卜細(xì)胞系進(jìn)行了克隆并研究了他們生成胚的能力(P.Coutos Thevenot等，Plant Cell Reports(1990)8∶605-608)。
該作者報(bào)導(dǎo)了使用由在含有生長素2，4-D的植物組織培養(yǎng)基中的家用胡蘿卜(Sl品系)的下胚軸得到的一種初始細(xì)胞懸浮液，用過濾法分離細(xì)胞團(tuán)粒，再將細(xì)胞團(tuán)在含有生長素2，4-D的植物組織培養(yǎng)基中懸浮以增加團(tuán)塊數(shù)的密度，將從分離的細(xì)胞團(tuán)得到的細(xì)胞集落轉(zhuǎn)移到裝有含有2，4-D和1%細(xì)菌用瓊脂的固體植物組織培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，以誘導(dǎo)細(xì)胞集落的形成，并將其在含2，4-D和1%細(xì)菌用瓊脂的第2代固體培養(yǎng)基中在培養(yǎng)S1品系愈傷組織附近沉積，再將它在含2，4-D的植物組織培養(yǎng)基中分離成單個(gè)細(xì)胞集落。在含2，4-D的植物組織培養(yǎng)基中再培養(yǎng)所獲得的培養(yǎng)物，隨后分析根據(jù)這個(gè)方法所獲得的細(xì)胞系，結(jié)果表明在40個(gè)細(xì)胞系中有13個(gè)是能進(jìn)行胚形成的，但這些細(xì)胞系的大多數(shù)隨時(shí)間進(jìn)行而失去胚形成的潛力，只有一個(gè)細(xì)胞系在經(jīng)過更長時(shí)間內(nèi)有相當(dāng)恒定的胚形成潛力。根據(jù)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，后者的細(xì)胞系是二倍體。
本發(fā)明提供了通過懸浮培養(yǎng)物獲得體細(xì)胞胚的方法，該方法的技術(shù)簡(jiǎn)單，不需要在愈傷組織附近沉積細(xì)胞系，因此利用本發(fā)明的方法可以以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)體細(xì)胞胚。本發(fā)明的體細(xì)胞胚能夠被用來提供銷售量的具有基本一致基因型的植物。
迄今，已表明在獲得植物方面體細(xì)胞胚形成是潛在的有力手段，但是，利用從愈傷組織材料開始的體細(xì)胞胚形成的非實(shí)用性阻止了這一技術(shù)的成功開發(fā)。
現(xiàn)在已驚奇地發(fā)現(xiàn)可通過使用液體培養(yǎng)技術(shù)本身，并且不需要使用固體培養(yǎng)基和/或愈傷組織，或獲得銷售量的真正的體細(xì)胞胚。也發(fā)現(xiàn)在液體培養(yǎng)基中提高PEMs的生物量是可能的，因此液體培養(yǎng)基有生產(chǎn)銷售量的體細(xì)胞胚的能力，使用這種液體培養(yǎng)技術(shù)消除了采用愈傷組織培養(yǎng)/愈傷組織再培養(yǎng)步驟的必要性，且首次提供了獲得具有均一的倍性水平的體細(xì)胞胚群體的手段。
本發(fā)明提供了通過體細(xì)胞胚形成獲得體細(xì)胞胚的方法，該方法基本上減少或根除了獲得體細(xì)胞克隆變體的風(fēng)險(xiǎn)。
它提供了非胡蘿卜屬體細(xì)胞胚懸浮培養(yǎng)物，其中所包含的體細(xì)胞胚的倍性水平基本上是一致的。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了具有基本一致的倍性水平的植物(如二倍體植物或四倍體植物)，該植物由基本具有所需倍性水平的體細(xì)胞胚懸浮培養(yǎng)物衍生得到。
本發(fā)明提供了從外植體材料中獲得銷售量真正體細(xì)胞胚的更可靠方法，它不依賴于使用愈傷組織和/或使用固體培養(yǎng)基作為所說方法的基本材料。
通過閱讀下列描述和實(shí)施例將很容易理解上述內(nèi)容以及本發(fā)明的其他目的。
本發(fā)明提供了促進(jìn)由外植體材料形成原胚形成群(PEM)的方法，其中的PEMs能夠產(chǎn)生存活的體細(xì)胞胚，該方法的特征在于將非愈傷組織植物組織放置于含有有效量的生長素或生長素混合物的液體植物組織培養(yǎng)基中。
促進(jìn)原胚形成群(PEM)的形成是指可以誘導(dǎo)PEM形成和/或可以增加PEM的生物量。
使用的外植體材料可以是單子葉植物或雙子葉植物種。優(yōu)選的是，外植體材料從雙子葉植物得到。典型的是，體細(xì)胞胚從原胚形成群(PEMs)得到。從形態(tài)學(xué)上講，該結(jié)構(gòu)同愈傷組織材料明顯不同并且還已知它是分生組織束。PEMs具有與它們由之得到的外植體材料相同的倍性水平。因此，當(dāng)從雙倍體植物獲取含有雙倍體和四倍體細(xì)胞的外植體材料時(shí)，在液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)前，必須通過過篩、細(xì)胞分選等方法分離得到的二倍體和四倍體細(xì)胞。
PEMs含有基本上分化的正在生長的植物組織，它可被認(rèn)為是真正體細(xì)胞胚的前體。在光學(xué)顯微鏡下(40倍至100倍)，PEMs顯現(xiàn)為小的、圓的、含有小液泡的富含細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞團(tuán)。依比，本發(fā)明的PEMs可被認(rèn)為在遺傳方面與植物親代細(xì)胞基本相同，其中PEMs由此衍生得到并可最終長大成真正的體細(xì)胞胚，該胚被確認(rèn)為具有二極性，即具有從分生組織的根和芽組織中長大為根的芽的能力。因此，當(dāng)使用本領(lǐng)域內(nèi)通常使用的方法作合適的進(jìn)一步處理時(shí)，一個(gè)存活的真正的體細(xì)胞胚也是一種可以長大成至少一個(gè)小植物的胚，從遺傳上說，該小植物與其由之衍生的外植體前代細(xì)胞材料基本相同。
適合于本發(fā)明的方法的植物組織材料是可從任何植物器官或部分，或其他合適的植物分化組織(如原生質(zhì)體)得到的外植體材料。這樣的組織選自于莖、葉、花瓣、下胚軸區(qū)、頂端分生組織、子房、合子胚本身、塊莖、維管束、中柱鞘、花藥絲等等。另外，合適的外植體材料可以是體細(xì)胞胚本身。植物組織可以從所需的任何植物種得到，包括選自單子葉植物或雙子葉植物的植物組織，在籽苗評(píng)估手冊(cè)(J.Bekendam 和R.Grob，ISTA，Zurich，Switzerland 1979，28-29頁，以及在索引122-126頁進(jìn)一步舉例說明，這里引入本文作為參考)中可發(fā)現(xiàn)所需植物類型的選擇法。優(yōu)選的植物類型包括選自仙客來屬、南瓜屬、番茄屬(優(yōu)選的是餐用或可食用的番茄)、蔥屬、秋海棠屬、甜菜屬、報(bào)春花屬、蕓苔屬、辣椒屬、菊苣屬、扶郎花屬、鳳仙花屬、萵苣屬、稻屬、天竺葵屬、碧科茄屬、堇菜屬和玉蜀黍?qū)?。最?yōu)選的植物類型選自仙客來屬、南瓜屬、甜菜屬(如甜菜普通種(糖甜菜))、蕓苔屬(如B.Oleracea或甘藍(lán)型油菜)、堇菜屬、天竺葵屬和辣椒屬。
適合用于本發(fā)明的方法的液體植物組織培養(yǎng)基是任何適于誘導(dǎo)和/或促進(jìn)胚形成的液體植物培養(yǎng)基。本領(lǐng)域普遍使用的基本培養(yǎng)基的例子包括Gamborg′s B5培養(yǎng)基(B5)、Murashige和Skoog培養(yǎng)基(MS)和他們的變體。
本發(fā)明計(jì)劃在起始誘導(dǎo)階段將能夠誘導(dǎo)PEM形成的足夠量的生長素加入到含外植體或其他合適起始材料的合適的液體培養(yǎng)基中，在上述起始誘導(dǎo)階段之后，進(jìn)一步使用能促進(jìn)PEM生長和繁殖的合適的液體培養(yǎng)基，以合適的時(shí)間間隔補(bǔ)充該培養(yǎng)基的生長素濃度。利用本領(lǐng)域已知的(例如)標(biāo)準(zhǔn)高效液相色譜技術(shù)監(jiān)測(cè)整個(gè)時(shí)間內(nèi)的生長素濃度有利于保證懸浮液的發(fā)育階段固定在PEM水平上。不加入太多的生長素到植物組織培養(yǎng)基中也很重要，這樣可避免可能發(fā)生的生長素的毒害副作用并保持PEMs處于存活狀態(tài)。
用于PEM生長和繁殖的液體植物組織培養(yǎng)基可以是原始誘導(dǎo)階段植物組織培養(yǎng)基，其中以適宜的時(shí)間間隔，簡(jiǎn)單地補(bǔ)充該培養(yǎng)基中的生長素濃度和/或其它必需成分，從而使體細(xì)胞胚形成的誘導(dǎo)和促進(jìn)階段能夠發(fā)生;在適宜的間隔時(shí)間內(nèi)，原始誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基也可用含適宜的生長素濃度的新鮮植物組織培養(yǎng)基所代替，其中的液體植物組織培養(yǎng)基可以是與起始使用的合適的但不同的液體植物組織培養(yǎng)基相同或不相同。因此，只要培養(yǎng)基是液體并且在合適的生長素濃度下它們能用于誘導(dǎo)和/或促進(jìn)PEM形成，可以認(rèn)為實(shí)際使用的植物組織培養(yǎng)基或培養(yǎng)基的類型對(duì)本發(fā)明而言并不關(guān)鍵。
也可容易了解，必需的生長素濃度因不同植物種類而變化，也可因不同植物品種而變化。用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法可測(cè)定對(duì)已給定的品種產(chǎn)生最佳效果的生長素的類型和濃度。根據(jù)植物品種，使用生長素混合物或許有利。適用于本發(fā)明的方法的生長素或類似生長素的化合物的例子包括吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸及其混合物。將生長素保持在這樣的濃度，以促使PEMs的成長和形成。
根據(jù)PEM的數(shù)量或生物量以及所用的植物種類，生長素濃度優(yōu)選保持在大約0.1mg/l到大約30mg/l的濃度。合適的生長素混合物可包括適宜濃度的NAA和2，4-D。根據(jù)所用植物的種類，萘乙酸(NAA)的有效生長素濃度大體在大約0～20mg/l的范圍內(nèi)，2，4-D的有效生長素濃度在大約0.1mg/l到大約10mg/l的范圍內(nèi)。例如，仙客來屬PEMs不需要NAA的存在但需要存在2，4-D，且起始濃度大約為5～10mg/l;已發(fā)現(xiàn)番茄屬PEMs需要起始濃度為20mg/l的NAA和起始濃度為1mg/l的2，4-D。
根據(jù)植物品種和所使用的植物組織培養(yǎng)基，向含生長素的培養(yǎng)基中加入非植物毒害量的細(xì)胞分裂素可能有利于促進(jìn)生長素的吸收。
本發(fā)明也提供了在懸浮液培養(yǎng)基中獲得具有基本相同的倍性水平的體細(xì)胞胚的方法，它包括ⅰ)在液體植物組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)外植體材料，該液體植物組織培養(yǎng)基含有足以促進(jìn)誘導(dǎo)原胚形成群(PEM)形成的有效量的生長素或生長素混合物。
ⅱ)在含合適生長素的液體植物組織培養(yǎng)基中使ⅰ)中獲得的PEMs數(shù)量加倍。
ⅲ)收集在ⅱ)中獲得的PEMs并將其置于基本無生長素的液體培養(yǎng)基中;和ⅳ)收集由ⅲ)中產(chǎn)生的PEMs衍生出的胚。
以上已經(jīng)討論了本方法的步驟1和步驟2，可按(例如)下述步驟實(shí)施將外植體材料置于諸如B5或MS等的合適液體培養(yǎng)基中，根據(jù)所用的植物種類，該培養(yǎng)基可含有濃度大約為0.1mg/l到約30mg/l的生長素或生長素混合物，這樣的濃度能有效地誘導(dǎo)PEM形成。將外植體材料以大約0.01g鮮重/升到大約100g鮮重/升培養(yǎng)物，優(yōu)選從1.0g鮮重/升到大約10g鮮重/升的適當(dāng)密度培養(yǎng)幾個(gè)星期，其間有PEMs出現(xiàn)。根據(jù)所用的植物種類，該時(shí)間階段可從大約2周到大約14周或更多，典型的是從大約4周到大約8周。通常，(例如)通過稀釋培養(yǎng)基或替代培養(yǎng)基從原始外植體材料培養(yǎng)物中分離出獲得的PEMs并在相同的或相似的新鮮液體培養(yǎng)基中進(jìn)一步培養(yǎng)。
對(duì)于那些需要誘導(dǎo)PEM形成的材料，在相同或相似的環(huán)境條件下，獲得的PEMs能夠立即進(jìn)入生長或增殖階段。為了方便起見，在這里將這個(gè)階段稱為增殖階段，因?yàn)閷?duì)PEM數(shù)量或PEM生物量的增加可以進(jìn)行控制并且可以看見這種生長。
在觀察到誘導(dǎo)PEM形成之后，監(jiān)控液體植物組織培養(yǎng)基以使生長素濃度保持在足以促進(jìn)PEM生長和增殖而無顯著PEM發(fā)育的水平上。增殖階段包括在按一定規(guī)律稀釋的所選擇的液體植物組織培養(yǎng)基上再培養(yǎng)，這樣可將生長素水平控制于在合適的時(shí)間間隔內(nèi)足以促進(jìn)PEM增殖。另一方面，可將PEMs從原始外植體材料培養(yǎng)物中分離并將它置于含有生長素的植物組織培養(yǎng)基中，并通過用分批補(bǔ)料或連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的方法簡(jiǎn)單地使之繁殖到所需要的PEM生物量。通常，該過程包括在一段時(shí)間內(nèi)保持生長素濃度在大約0.1mg/l的水平之上。依據(jù)需要將多少PEMs轉(zhuǎn)化為真正的體細(xì)胞胚，可以年為單位測(cè)量增殖階段的時(shí)間期間，然而，通常依據(jù)所需要的PEM生物質(zhì)的量，以月或星期為單位測(cè)量增殖階段的時(shí)間，如大約2-3星期。一旦處于增殖階段，PEMs可在任何時(shí)刻收集，以便置于基本無生長素的植物組織培養(yǎng)基中，在該培養(yǎng)基中PEMs進(jìn)可一步發(fā)育成為真正的體細(xì)胞胚。這還涉及這里描述的篩選，即選擇某一特定尺寸的PEM部分，它可通過合適大小的篩(如一個(gè)150μm孔徑的篩)但可被一個(gè)更小孔徑的篩(如一個(gè)100mm孔徑的篩)阻擋住。
補(bǔ)充適當(dāng)?shù)奶寄芰吭?，方便地補(bǔ)充可溶性碳水化合物，如蔗糖、葡萄糖或棉子糖于液體植物組織培養(yǎng)基中，可對(duì)PEM的形成和增殖產(chǎn)生有利的影響。
典型的碳水化合物濃度在每升植物組織培養(yǎng)基中在15克到90克的范圍內(nèi)，優(yōu)選為20克至60克。
增殖階段可以在燒瓶或在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，生物反應(yīng)器在本領(lǐng)域內(nèi)已知，用于培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液以生產(chǎn)次級(jí)細(xì)胞代謝物。然而，迄今尚沒有描述將生物反應(yīng)器用于PEM培養(yǎng)。我們發(fā)現(xiàn)可以用生物反應(yīng)器在相對(duì)較短的時(shí)間間隔中生產(chǎn)大量的PEMs。
為了方便起見，將從PEM懸浮培養(yǎng)物中得到的聚集的細(xì)胞團(tuán)接種于合適的生物反應(yīng)器中的合適培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有足夠量的合適的碳能源，例如，依據(jù)所用的PEM種類，選用濃度為約15克/升至約90克/升或更高，優(yōu)選約20克/升至約60克/升的蔗糖、葡萄糖和棉子糖。Preil W.和Beck A.[(1991)Acta Horticulturae 289，Plant Technology∶179-192頁]描述了在使用振動(dòng)混合器的生物反應(yīng)器中進(jìn)行的體細(xì)胞胚形成，但是，該項(xiàng)研究結(jié)果沒有指明在PEMs發(fā)育為體細(xì)胞胚前完成PEM的形成和繁殖。已發(fā)現(xiàn)在生物反應(yīng)器中進(jìn)行的PEM懸浮培養(yǎng)中使用振動(dòng)混合器可以顯著提高PEMs的生命周期，有助于增加PEM生物量，減少PEM生物量的損失，并阻止PEM成團(tuán)。在振動(dòng)混合器上安裝有一個(gè)穿孔的混合板或攪拌盤(可分別從Applikon BV、The Netherlands and Chemap AG(瑞士)獲得)，并且該混合板或攪拌盤定位于生物反應(yīng)器的固定平臺(tái)上并使之基本上在固定平臺(tái)上振動(dòng)，使用該混合器可以在不顯著損失PEM生物量的情況下混合或攪拌PEM懸浮培養(yǎng)物。
優(yōu)選的是，該振動(dòng)混合器在基本垂直的平面上振動(dòng)。在本發(fā)明方法中使用的振動(dòng)混合器的典型的操作頻率為50Hz;在較實(shí)用的情況下振幅為約±6mm或更少。一旦獲得能產(chǎn)生所需量體細(xì)胞胚的PEM生物量，可將PEMs置于基本上不含生長素的液體植物組織培養(yǎng)基中，PEMs能在該培養(yǎng)基中發(fā)育為體細(xì)胞胚。
通氣對(duì)PEM懸浮培養(yǎng)是有利的?？梢员绢I(lǐng)域內(nèi)已知的方式進(jìn)行通氣。如果使用一個(gè)振動(dòng)混合器，(例如)可使用一個(gè)多孔的噴射裝置將空氣噴射到振動(dòng)混合反應(yīng)器中。
根據(jù)上面所述及實(shí)例可以看出，對(duì)于各種參數(shù)，如生長素的類型和濃度、細(xì)胞分裂素的存在、能量(碳水化合物)來源、攪拌或振動(dòng)頻率、氧供應(yīng)、光強(qiáng)度和波長的最佳條件將依據(jù)所使用的植物材料而變化。通過使用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法(如實(shí)施例中所描述)可以測(cè)定這些最佳條件。
根據(jù)本發(fā)明得到體細(xì)胞胚的方法的接下來的步驟ⅲ)和ⅳ)可如下進(jìn)行通過將PEMs置于無生長素的植物組織培養(yǎng)基中可以促使PEM發(fā)育為體細(xì)胞胚。存活的PEMs具有發(fā)育為體細(xì)胞胚的能力。在轉(zhuǎn)移到無生長素的培養(yǎng)基中以前，最好將PEMs過篩，例如，通過一個(gè)尼龍網(wǎng)，以選擇能最有效地產(chǎn)生所需體細(xì)胞胚的PEM尺寸部分。非活性PEM的含量太高將抑制體細(xì)胞胚的形成。通常，使用含有至少5%，優(yōu)選至少10%，更優(yōu)選至少15%的存活PEMs的PEMs是合乎要求的。利用標(biāo)準(zhǔn)的篩選試驗(yàn)可以測(cè)定該最適尺寸部分。
通過使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的(例如)過篩或任何其他的尺寸分選方法可以收集選定尺寸的PEMs。熟練的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到所需尺寸的PEMs(即有高存活PEMs含量的PEM部分)的具體尺寸將隨種類不同而變化，如下文所詳述。
通過將PEM通過一個(gè)過濾裝置(如已知孔徑的網(wǎng)篩)，例如一種尼龍網(wǎng)篩，以獲得在給定的尺寸范圍內(nèi)的PEMs，采用這一方法獲得了篩分的PEMs部分。依據(jù)不同的植物種類，PEMs的直徑可以是高至約1mm的任何尺寸，但是，PEMs的聚集塊可以大至直徑為5mm。總的來說，單個(gè)PEMs的所需尺寸為μm數(shù)量級(jí)。已發(fā)現(xiàn)對(duì)于由PEMs衍生出單個(gè)體細(xì)胞胚而言，PEMs的尺寸是關(guān)鍵的。優(yōu)選的是，收集到的PEM部分在合適的條件下，其中每一個(gè)PEM都能產(chǎn)生一個(gè)體細(xì)胞胚。當(dāng)然，特定的存活的、篩分的PEM部分的尺寸隨不同的植物種類而變化。例如，對(duì)于黃瓜最有用的PEM部分中PEMs的大小為約100μm至約150μm;而對(duì)于仙客來屬則為約150μm至約300μm。優(yōu)選的情況，PEM部分中每一個(gè)PEM能產(chǎn)生至少一個(gè)體細(xì)胞胚，優(yōu)選的是產(chǎn)生一個(gè)單個(gè)的體細(xì)胞胚。
基本上不含生長素的液體植物組織培養(yǎng)基是一種能使PEMs發(fā)育為體細(xì)胞胚的培養(yǎng)基。因此，考慮到所使用的基本上不含生長素的液體植物組織培養(yǎng)基是一種耗盡了生長素的植物組織培養(yǎng)基，其中可以含有殘留量的生長素，但如果含生長素，該生長素量基本上不干擾PEMs發(fā)育為體細(xì)胞胚，或者是一種不含生長素的植物組織培養(yǎng)基。自然，熟練的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，依據(jù)所需要的體細(xì)胞胚的多少，可將基本上不含生長素的植物組織培養(yǎng)基置于燒瓶或合適的生物反應(yīng)器中，例如安裝有振動(dòng)混合器的生物反應(yīng)器。然后利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法可將獲得的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)化為植物。因此，通過監(jiān)控PEM生物量，可以獲得銷售量的大量的體細(xì)胞胚。
實(shí)用的無生長素的培養(yǎng)基包括一種濃度為15克/升至90克/升，優(yōu)選為20克/升到60克/升的可溶性碳水化合物能源。合適的碳水化合物能源包括蔗糖、葡萄糖和棉子糖。
根據(jù)顧客的要求，銷售量的體細(xì)胞胚的數(shù)量范圍為幾百(例如500)至幾百萬(例如3，000，000)或更多。例如，如果需要約200，000株植物，可使PEM持續(xù)增殖，直到PEM生物量達(dá)到基本上能產(chǎn)生約200，000體細(xì)胞胚。然后將這些PEMs置于無生長素的液體植物組織培養(yǎng)基中與之接觸，在該培養(yǎng)基中PEMs發(fā)育為體細(xì)胞胚。
一旦在基本上無生長素的植物組織培養(yǎng)基中發(fā)育成真正的體細(xì)胞胚，可利用本領(lǐng)域內(nèi)普遍采用的技術(shù)從無生長素的植物組織培養(yǎng)基中分離出這些胚，并使之轉(zhuǎn)化為植物。
在商業(yè)上銷售前，可簡(jiǎn)便地將體細(xì)胞胚與無活性的PEMs分離開?？捎帽绢I(lǐng)域已知的技術(shù)完成這一過程。通常無活性的PEMs比體細(xì)胞胚小。例如可通過篩分或細(xì)胞分選的手工操作法將體細(xì)胞胚分離出來。
在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了成批量的體細(xì)胞胚，其中含有基本上都具有相同倍性水平的體細(xì)胞胚。根據(jù)商業(yè)上的需要，批量的體細(xì)胞胚可以包括幾百至幾萬個(gè)胚或更多。優(yōu)選的是批量的體細(xì)胞胚包括基本為二倍體的體細(xì)胞胚或基本為四倍體的體細(xì)胞胚。一批體細(xì)胞胚簡(jiǎn)單地是一種從中排出了液體培養(yǎng)基的體細(xì)胞胚懸浮體，其中體細(xì)胞胚被置于合適的容器中。容器的周圍環(huán)境有較高的相對(duì)濕度，例如100%，并維持于約0℃以上、最高到15℃的合適低溫下。以這種方式貯存的體細(xì)胞胚可保持約4天。另一種方法，可將體細(xì)胞胚經(jīng)過脫水干燥過程、冷凍、成粒、包裹于凝膠中等等。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了與胡蘿卜屬不同的體細(xì)胞胚懸浮培養(yǎng)物，該縣浮培養(yǎng)物包括具有基本上相同倍性水平的體細(xì)胞胚。優(yōu)選的體細(xì)胞胚是二倍體或四倍體。該體細(xì)胞胚源于雙子葉或單子葉外植體材料。
現(xiàn)在通過下面的實(shí)施例舉例說明本發(fā)明。專業(yè)人員將明白這些實(shí)施例并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 仙客來屬細(xì)胞培養(yǎng)物胚形成的開始及由此形成的體細(xì)胞胚用70%乙醇將仙客來屬“ConcertoScarlet”品種(Sluis和Groot)的種子進(jìn)行表面滅菌(2分鐘)，再用1.5%的次氯酸鈉溶液表面滅菌(45分鐘)，然后用無菌水徹底洗滌(3×)。使種子在濕紙上于23℃萌發(fā)2-4星期，并以露出來的塊莖作為外植體材料。在旋轉(zhuǎn)搖床(G10回旋搖床New Brunswick Scientific，Edison，N.j.VSA)上，在100rpm的轉(zhuǎn)速、黑暗、23℃的條件下，將三個(gè)塊莖于10ml的B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基(可從Duchefa Biochemie BV，Haarlem，The Netherlands購買)中培養(yǎng)，在該B5培養(yǎng)基中添加了20g/l蔗糖、10mg/l2，4-D、100mg/l肌醇、1.0mg/l煙酸、1.0mg/l鹽酸吡哆素、10mg/l鹽酸硫胺素。在7天后，用新鮮培養(yǎng)基替換上述培養(yǎng)基。再培養(yǎng)7天后，用新鮮培養(yǎng)基將該培養(yǎng)物稀釋(5×)至體積為50ml。再培養(yǎng)7天后，從塊莖外植體材料中分離出中央木髓，該部分包括從稀釋的培養(yǎng)物獲得的塊莖外植體材料的維管束和中柱鞘，將塊莖的其余部分除去，將上述分離出的材料再培養(yǎng)于補(bǔ)充了20g/l蔗糖、100mg/l肌醇、1.0mg/l煙酸、1.0mg/l鹽酸吡哆素、10mg/l鹽酸硫胺素、5mg/l2，4-D以及1mg/l激動(dòng)素的25mlB5基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。將再培養(yǎng)物每周稀釋2倍，共稀釋4周。在約4周時(shí)出現(xiàn)了原胚形成群。按如上所述進(jìn)一步再培養(yǎng)2周的時(shí)間以繁殖PEM。通過進(jìn)一步在補(bǔ)充了20g/l蔗糖、100mg/l肌醇、1.0mg/l煙酸、1.0mg/l鹽酸吡哆素、10mg/l鹽酸硫胺素的無生長素和細(xì)胞激動(dòng)素的B5培養(yǎng)基上培養(yǎng)，PEMs能發(fā)育為存活的、真正的體細(xì)胞胚。
實(shí)施例2仙客來屬細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物胚形成的開始及由此形成的體細(xì)胞胚用70%乙醇將仙客來屬種子(品種Concerto Scharlaken Othello，Zaadunie BV)表面滅菌(2分鐘)，再用1%次氯酸鈉溶液表面滅菌(45分鐘)，并用無菌水徹底洗滌(3×)。在23℃、黑暗條件下使種子在濕紙上萌發(fā)2-5星期。將露出來的塊莖用作為外植體材料，并切成2-8段。根據(jù)De Laat A.A.M.等(1987)Plant Breeding 99∶303-307頁描述的方法檢測(cè)該外植體材料的倍性水平，并發(fā)現(xiàn)是二倍體。
在位于旋轉(zhuǎn)搖床(100rpm)上的50ml燒瓶中，在黑暗和23℃的條件下，將來自三個(gè)塊莖的外植體材料培養(yǎng)于補(bǔ)充了20g/l蔗糖、5mg/l2，4-二氯苯氧基乙酸以及1mg/l的激動(dòng)素的10mlB5基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Duchefa Biochemie BV，Haarlem，荷蘭)中。所有燒瓶都用鋁箔覆蓋。在培養(yǎng)一周后，在250ml燒瓶中，用補(bǔ)充了20g/l蔗糖、5mg/l2，4-D、100mg/l肌醇、1.0mg/l煙酸、1.0mg/l、鹽酸吡哆素、10mg/l鹽酸硫胺素以及1mg/l激動(dòng)素的B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基將該培養(yǎng)物稀釋5倍至體積為50ml。再培養(yǎng)2周后，該培養(yǎng)物含有PEMs，并用寬嘴吸管將該P(yáng)EMs與培養(yǎng)物的其余部分分離開，并分開進(jìn)行培養(yǎng)。通過肉眼觀察鑒別到PEMs為細(xì)胞團(tuán)塊，它基本上由小而圓的胞質(zhì)細(xì)胞組成。在這個(gè)階段，鑒別到的PEMs或者為單個(gè)的細(xì)胞團(tuán)，或者為相互粘附在一起的許多細(xì)胞團(tuán)塊。在250ml燒瓶中，利用一個(gè)寬嘴吸管，每隔兩周將1ml聚集的細(xì)胞接種于B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基中至終體積為50ml，從而再培養(yǎng)該培養(yǎng)物，其中的B5培養(yǎng)基中補(bǔ)充了20g/l蔗糖、5mg/l2，4-D、100mg/l肌醇、1.0mg/l煙酸、1.0mg/l鹽酸吡哆素、10mg/l鹽酸硫胺素以及1mg/l激動(dòng)素。通過將培養(yǎng)物樣品在700xg離心2分鐘而測(cè)得聚集的細(xì)胞團(tuán)量(PCV)，即離心后的總細(xì)胞量PCV起始和PCV最后。使用Schlegel，H.G.(1981)Allgemeine Microbiologie，Thieme，Stuttgart，190頁的公式，根據(jù)測(cè)得的PCV起始和PCV最后計(jì)算，通常胚形成細(xì)胞系生長約4-6天的倍增時(shí)間。將以該方法獲得的胚形成細(xì)胞系維持至少45周，并且它在遺傳上是穩(wěn)定的，即倍性水平為二倍體，與原始外植體材料的倍性相同。
分別用孔徑為250μm和100μm的尼龍網(wǎng)篩將PEM培養(yǎng)物過篩而選擇PEMs。在再次培養(yǎng)8天后，得到最高量的PEMs/ml。該部分能進(jìn)行最佳的胚發(fā)育過程，并且每個(gè)PEM培養(yǎng)物的PCV得到最大量的胚。所篩選到的PEMs的量的范圍通常為1000到5.000PEMs/mlPCV。
在過篩后，洗滌PEMs并接種于發(fā)育培養(yǎng)基，即補(bǔ)充了濃度為174mM的蔗糖或葡萄糖的MS或B5培養(yǎng)基。將25至50PEMs/ml培養(yǎng)于用鋁箔和nescofilm(Bando Chemieals Ind.LTD，日本)封口的一個(gè)燒瓶中。在3-4周后，形成了類似于合子胚的魚雷狀胚。使用該方法可生產(chǎn)250，000個(gè)胚。使用如DeLaat A.M.M.(上文)描述的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析技術(shù)分析胚培養(yǎng)物的隨機(jī)樣品，估測(cè)500個(gè)體細(xì)胞胚的DNA含量。發(fā)現(xiàn)所有的胚都是二倍體。
仙客來胚的轉(zhuǎn)變(即萌發(fā))包括塊莖形成接著形成不定根，并且這種轉(zhuǎn)變可通過將胚培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中而誘導(dǎo)，所述液體培養(yǎng)基是分別含有約116mM或58mM的葡萄糖或蔗糖的MS或B5培養(yǎng)基。塊莖形成的定義是從塊莖或類似塊莖結(jié)構(gòu)的下胚軸進(jìn)行發(fā)育?？稍谝后w培養(yǎng)基或在諸如珍珠石、無菌土等的固體培養(yǎng)基中進(jìn)一步發(fā)育生長出將形成第一片葉的子葉。
在無菌條件(存在一種碳源)或非無菌條件(未加入碳源)下將轉(zhuǎn)變后的胚直接播種于珍珠石或盆載土壤中，并且在黑暗、18℃至20℃的條件下培養(yǎng)2-4星期后有子葉形成。采用較高的約90%的相對(duì)濕度。在無菌條件下，約90%以上的胚轉(zhuǎn)變到子葉期。一旦出現(xiàn)子葉，便將得到的小植株置于光照條件下并鍛煉植株的耐寒性，然后轉(zhuǎn)移到溫室中。
實(shí)施例3 蕃茄細(xì)胞培養(yǎng)物胚形成的開始用70%乙醇將蕃茄“Manhattan”品種(Sluis和Groot)的種子進(jìn)行表面滅菌(2分鐘)，并再用1.5%的次氯酸鈉溶液表面滅菌15分鐘，然后用無菌水徹底沖洗(3×)。將種子在浸濕的紙上，在23℃下萌發(fā)3天以上。收集完整幼苗，并將每個(gè)幼苗切成4段，然后將之用作為外植體材料。以這種方式剪切10個(gè)幼苗，并在一個(gè)旋轉(zhuǎn)搖床上，在23℃、100rpm、以及16小時(shí)光照階段和8小時(shí)黑暗階段的循環(huán)條件下，將幼苗段在15ml液體基礎(chǔ)B5培養(yǎng)基(可從Duchefa Biochemie BV，Haarlem，荷蘭購買)中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充了20g/l的蔗糖、20mg/lNAA、1mg/l2，4-D、1mg/l激動(dòng)素、100mg/l肌醇、1mg/l煙酸、1mg/l鹽酸吡哆素以及10mg/l鹽酸硫胺素。使用本領(lǐng)域已知的HPLC技術(shù)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中的生長素濃度。一旦生長素濃度降至0.1mg/l以下(大約在7天后出現(xiàn))，即向其中加入15ml新鮮B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基(可從DuchefaBiochemie BV，Haarlem，荷蘭購得)以將培養(yǎng)液體積補(bǔ)充至30ml，該B5培養(yǎng)基補(bǔ)充了20g/l蔗糖、20mg/lNAA、1mg/l2，4-D、1mg/l激動(dòng)素、100mg/l肌醇、1mg/l煙酸、1mg/l鹽酸吡哆素以及10mg/l鹽酸硫胺素。每隔4-7天，通過使外植體材料和細(xì)胞沉降15分鐘，并通過移走15ml使用過的培養(yǎng)基，再添加15ml新鮮培養(yǎng)基，使該培養(yǎng)物重新返鮮，從而將該培養(yǎng)物進(jìn)行再培養(yǎng)。在外植體材料開始培養(yǎng)后約4-7周，觀察到原胚形成群(PEMs)。通過按如上所述進(jìn)一步再培養(yǎng)2周的時(shí)間以增殖PEMs。進(jìn)一步將PEMs再培養(yǎng)于無生長素并按前面所述添加營養(yǎng)物，但未添加NAA、Z，4-D和激動(dòng)素的B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，觀察到真正的體細(xì)胞胚形成。
實(shí)施例4蕃茄細(xì)胞培養(yǎng)物胚形成的開始用70%乙醇將蕃茄種的“Majorca”品種(Sluis和Groot)的種子進(jìn)行表面滅菌(2分鐘)，再用1.5%的次氯酸鈉溶液表面滅菌15分鐘，然后用無菌水徹底沖洗(3×)。在23℃、黑暗條件下，使種子在浸濕的紙上萌發(fā)7天。采集子葉，將其剪成片段，以用作為外植體材料。將3個(gè)幼苗的6個(gè)子葉按這種方式剪切，并在旋轉(zhuǎn)搖床上，在100rpm、23℃、黑暗中將上述葉片培養(yǎng)于15ml液體培養(yǎng)基A(見表1)，在A中補(bǔ)充了4mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素。在14天后，加入35ml如上所述的含激素的新鮮培養(yǎng)基A(見表1)。每隔14天，將培養(yǎng)物稀釋(2×)于添加了如上所述激素的新鮮培養(yǎng)基A(見表1)中而進(jìn)行再培養(yǎng)。在外植體材料開始培養(yǎng)約4周后，觀察到PEMs。通過按如上所述方法進(jìn)一步進(jìn)行再培養(yǎng)而增殖PEMs。
表1 培養(yǎng)基A的組成大量元素g/lNH4NO31.20(NH4)2SO40.66KH2PO40.55KNO31.01MgCl2·6H2O 0.30CaCl20.22檸檬酸 0.5蔗糖 20微量元素 2ml貯備液/l維生素Gamborg B5(1mg/l)1ml貯備液/l
用KOH(1M)將pH調(diào)至5.8微量元素(貯備液)g/lFeSO4·7H2O 6.9CuSO4·5H2O 0.65CoCl2·6H2O 0.12MnCl2·4H2O 2.97NaMoO4·2H2O 0.24KI 0.041HBO31.5ZnSO4·7H2O 4.3NiSO4·6H2O 0.39檸檬酸 2pH=2.3g24維生素Gamborg B5(Duchefa); 貯備液補(bǔ)充:
肌醇 100g/l煙酸 lg/l鹽酸硫胺素 lg/l實(shí)施例5 黃瓜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物胚形成的開始及由此形成的體細(xì)胞胚用70%乙醇溶液將黃瓜“Pandorex”品種(Sluis和Groot)的種子進(jìn)行表面滅菌(2分鐘)，再用1.5%的次氯酸鈉溶液表面滅菌(45分鐘)，然后用無菌水徹底沖洗(3×)。在23℃將黃瓜種子在浸濕的紙上萌發(fā)2天。將從種子產(chǎn)生的胚根用作為外植體材料。在旋轉(zhuǎn)搖床上，在100rpm、23℃、黑暗條件下，將15個(gè)胚根培養(yǎng)于10ml添加了20g/l蔗糖、2mg/l2，4-D以及1mg/l激動(dòng)素以及維生素的MS基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(可從DuchefaBiochemie，BV，Haarlem，荷蘭購買)。利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的HPLC技術(shù)，監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中的生長素濃度。在生長素濃度降至＜0.1mg/l(約在5天后)時(shí)，將該培養(yǎng)物于添加了維生素的基礎(chǔ)液體MS培養(yǎng)基(可從Duchefa Biochemie，BV，Haarlem，荷蘭購買)中稀釋5倍至50ml，該培養(yǎng)基中添加了20g/l蔗糖、2mg/l2;4-D以及1mg/l激動(dòng)素。通過第二周一次用添加有維生素的MS基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(可從DuchefaBiochemie，BV，Haarlem，荷蘭購買)稀釋該培養(yǎng)物(2×)而將該培養(yǎng)物再培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中添加了20g/l蔗糖、2mg/l2，4-D以及1mg/l激動(dòng)素。8周后出現(xiàn)原胚形成群。
然后通過每隔2周將0.4ml聚集的細(xì)胞團(tuán)接種于添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素的50ml培養(yǎng)基A(見表1)中而進(jìn)一步再培養(yǎng)PEM培養(yǎng)物。按照Schlegel公式(如上文)測(cè)定的黃瓜細(xì)胞系的倍增時(shí)間約為2.7天。通過分別用孔徑為150μm和100μm的尼龍網(wǎng)篩選該培養(yǎng)物而選擇尺寸為100-150μm之間的PEMs。該100-150μm部分的PEM培養(yǎng)物的每個(gè)PCV能產(chǎn)生最高量的單個(gè)體細(xì)胞胚。從該細(xì)胞系得到的PEMs是二倍體或四倍體。按照用DeLaat A.A.A等人的方法(上文)測(cè)得的結(jié)果，在二年以上的時(shí)間內(nèi)，在添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素的液體培養(yǎng)基A上二倍體細(xì)胞與四倍體細(xì)胞的比例保持不變。PEMs產(chǎn)生二倍體植株，也產(chǎn)生四倍體植株。不僅在PEMs，也在植株中反映出上述測(cè)得的二倍體與四倍體的比例。
通過在添加了20克蔗糖和5μM ABA的無生長素和細(xì)胞激動(dòng)素的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)PEMs而將PEMs發(fā)育為真正的體細(xì)胞胚。
實(shí)施例6 處理黃瓜胚形成細(xì)胞系以獲得100%二倍體或100%四倍體的懸浮培養(yǎng)物實(shí)施例5中的懸浮液由二倍體和四倍體PEMs組成，可以發(fā)育為有相同倍性水平的胚。
從由實(shí)施例5的方法開始培養(yǎng)得到的13周齡的細(xì)胞懸浮液中逐個(gè)挑選出直徑約為2mm的單個(gè)PEMs。按照De Laat等人(1987)Plant Breeding 99，303-307頁所述方法測(cè)量各個(gè)PEMs的倍性水平。結(jié)果顯示PEMs或者是100%二倍體，或者是100%四倍體。進(jìn)一步在如實(shí)施例5所述的MS基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基中將單個(gè)PEMs培養(yǎng)15周的時(shí)間(即每二周一次地進(jìn)行再培養(yǎng))，用De Laat等人的方法(上文)測(cè)得由此產(chǎn)生的細(xì)胞系由100%二倍體或100%四倍體組成。二倍體PEMs產(chǎn)生二倍體胚和二倍體植株。四倍體PEMs產(chǎn)生四倍體胚和四倍體植株。
實(shí)施例7 處理黃瓜胚形成細(xì)胞以獲得100%二倍體或100%四倍體的懸浮培養(yǎng)物在無菌條件下使用實(shí)施例3的方法，培養(yǎng)黃瓜“Pandorex”品種(Sluis和Groot)植株。將大小約為1cm的子房用作為外植體。按照De Laat等人的方法(上文)檢測(cè)倍性水平，結(jié)果表明該外植體全部是二倍體。將大約一半的果實(shí)切成厚約0.5mm的薄片，并在旋轉(zhuǎn)搖床上，在100rpm、23℃、黑暗條件下，將上述薄片培養(yǎng)于10ml加有維生素的MS基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(可從Duchefa Biochemie，BV，Haarlem，荷蘭購買)中，該培養(yǎng)基中添加了20g/l蔗糖、2mg/l2，4-D以及1mg/l激動(dòng)素。利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的HPLC技術(shù)監(jiān)測(cè)該培養(yǎng)基中生長素的濃度。在約5天后，生長素濃度降至＜0.1mg/l時(shí)，用添加了維生素的MS基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(可從Duchefa Biochemie，BV，Haarlem，荷蘭購買)將該培養(yǎng)物稀釋(5×)至50ml，該培養(yǎng)基中還添加了20g/l蔗糖、2mg/l2，4-D以及1mg/l激動(dòng)素。通過每二周一次將該培養(yǎng)物用按如上所述添加了營養(yǎng)物的MS培養(yǎng)基稀釋(2×)，從而再培養(yǎng)該培養(yǎng)物。
8周后出現(xiàn)原胚形成群體。按實(shí)施例5所述方法將該P(yáng)EM培養(yǎng)物培養(yǎng)于添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素的培養(yǎng)基A(表1)中。將0.4ml聚集細(xì)胞團(tuán)接種于添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素的50ml培養(yǎng)基A中。用Schlegel公式(見上文)測(cè)得在培養(yǎng)基A(表1)中黃瓜細(xì)胞系的倍增時(shí)間約為2.7天。按照De Laat等人的方法(上文)測(cè)定PEM懸浮液的倍性水平，并發(fā)現(xiàn)是二倍體。通過用尼龍網(wǎng)篩篩選培養(yǎng)物而挑選出尺寸為100-150μm的PEMs。通過將選擇出的PEMs在不含生長素和細(xì)胞激動(dòng)素并添加了20g/l蔗糖的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)而使PEMs發(fā)育為真正的體細(xì)胞胚。利用該方法，在四周內(nèi)從該培養(yǎng)物制備了200，000個(gè)胚。使用DeLaat等人的方法(上文)發(fā)現(xiàn)隨機(jī)選出的500個(gè)體細(xì)胞胚的倍性水平幾乎都是二倍體。
實(shí)施例8 穩(wěn)定PEM懸浮液的倍性水平的維持在添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素的培養(yǎng)基A(表1)中培養(yǎng)黃瓜PEM懸浮液。在再培養(yǎng)期間，在每一個(gè)再培養(yǎng)步驟中都將大量元素和微量元素維持于超過PEM所需量以上，以便在再培養(yǎng)期間(即2周)不會(huì)出現(xiàn)缺乏這些元素的現(xiàn)象。以同樣方式維持生長素水平(即10mg/l2，4-D)。在再培養(yǎng)開始時(shí)向培養(yǎng)基中加入激動(dòng)素(即0.5mg/l)并在4天時(shí)內(nèi)使其在培養(yǎng)基中耗盡。使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的HPLC技術(shù)監(jiān)測(cè)整個(gè)時(shí)間內(nèi)生長素的濃度，以確保該懸浮液的發(fā)育階段固定在PEM水平上。在添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素的培養(yǎng)基A(表1)中將胚形成二倍體PEM懸浮液維持至2年，并顯示出穩(wěn)定的倍性水平。將胚形成的四倍體PEM懸浮液維持6個(gè)月，顯示有穩(wěn)定的倍性水平。直至胚發(fā)育開始，始終維持于該倍性水平。
實(shí)施例9 糖甜菜PEM懸浮培養(yǎng)物胚形成的開始以及由此形成的體細(xì)胞胚用70%乙醇溶液將糖甜菜種子(Hilleshog AB，瑞典)表面滅菌(2分鐘)，再用1.5%次氯酸鈉溶液表面滅菌(45分鐘)，然后用無菌水徹底沖洗(3×)。使糖甜菜種子在23℃、濕紙上萌發(fā)7至14天。將萌發(fā)種子的子葉用作為外植體材料。在旋轉(zhuǎn)搖床上，在100rpm、黑暗、23℃條件下，將6個(gè)子葉培養(yǎng)于添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素的10ml液體培養(yǎng)基A(表10)中。在1或2周后，用補(bǔ)充了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素的液體培養(yǎng)基A(表1)將該培養(yǎng)物稀釋5倍至50ml。每二周一次用按如上所述添加營養(yǎng)物的培養(yǎng)基A(表1)稀釋該培養(yǎng)物或用按如上所述添加營養(yǎng)物的新鮮培養(yǎng)基A替代該培養(yǎng)基而將該培養(yǎng)物進(jìn)行再培養(yǎng)。在4至6周后，在外植體組織上出現(xiàn)體細(xì)胞胚。從外植體中挑選出胚，并分別進(jìn)行培養(yǎng)。4周后，培養(yǎng)的胚產(chǎn)生PEMs。通過補(bǔ)充添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素的表1中的培養(yǎng)基A而進(jìn)一步再培養(yǎng)該P(yáng)EM培養(yǎng)物。
通過首先用孔徑為500μm的尼龍網(wǎng)，再用孔徑為100μm的尼龍網(wǎng)篩選PEM懸浮液而收集PEMs，通常100-500μm大小的PEM部分主要產(chǎn)生單個(gè)的體細(xì)胞胚。將該P(yáng)EMs培養(yǎng)于無生長素和細(xì)胞激動(dòng)素并按如上所述方式添加了營養(yǎng)物的培養(yǎng)基A中并發(fā)育為真正的體細(xì)胞胚。
實(shí)施例10 辣椒PEM懸浮培養(yǎng)物胚形成的開始用70%乙醇溶液將辣椒(Sluisen Groot的Gedeon品種)種子進(jìn)行表面滅菌(2分鐘)并再用1.5×次氯酸鈉溶液表面滅菌(45分鐘)，然后用無菌水徹底沖洗(3×)。使辣椒種子在23℃、濕紙上萌發(fā)7-14天。用已萌發(fā)種子的子葉作為外植體材料。在旋轉(zhuǎn)搖床上，在100rpm、黑暗、23℃的條件下，將6片子葉培養(yǎng)于補(bǔ)充了10mg/l2，4-D的10ml液體培養(yǎng)基A(表1)中。在二周后將該培養(yǎng)物稀釋5倍至50ml。通過每二周一次按如上所述稀釋培養(yǎng)物(2×)或用補(bǔ)充了10mg/l2，4-D的新鮮液體培養(yǎng)基A(表1)代替該培養(yǎng)基而再培養(yǎng)該培養(yǎng)物。在2-4周后，在外植體的切口邊緣出現(xiàn)了胚。從外植體上拿走胚，并將胚從培養(yǎng)物中移走，再培養(yǎng)于補(bǔ)充了4mg/l2，4-D和0.5mg/l玉米素的液體培養(yǎng)基A(表1)。4周后出現(xiàn)原胚形成群。通過按如上所述進(jìn)一步再培養(yǎng)而增殖PEMs。按實(shí)施例5所述將懸浮液過篩而收集PEMs。100-500μm尺寸的部分主要產(chǎn)生單個(gè)體細(xì)胞胚。將PEMs培養(yǎng)于無生長素和細(xì)胞激動(dòng)素的培養(yǎng)基A(表1)中。
實(shí)施例11堇菜PEM懸浮培養(yǎng)物胚形成的開始以及由此形成的體細(xì)胞胚用70%乙醇溶液將堇菜(Sluisen Groot的Deltaviolet品種)種子表面滅菌(2分鐘)再用1.5%的次氯酸鈉溶液表面滅菌(30分鐘)，然后用無菌水徹底沖洗(3×)。使堇菜種子在濕紙上于23℃萌發(fā)7至14天。將已萌發(fā)種子的子葉用作為外植體材料。在一個(gè)旋轉(zhuǎn)搖床上，在100rpm、23℃和黑暗條件下，將6片子葉培養(yǎng)于添加了4mg/l2，4-D和0.1mg/l激動(dòng)素的10ml液體培養(yǎng)基A(表1)中。在二周后用添加了4mg/l2，4-D和0.1mg/l激動(dòng)素的液體培養(yǎng)基A(表1)稀釋(5×)該培養(yǎng)物至50ml。通過每二周一次稀釋該培養(yǎng)物(2×)或用添加了4mg/l2，4-D和0.1mg/l激動(dòng)素的新鮮液體培養(yǎng)基A(表1)替代該培養(yǎng)基而再培養(yǎng)該培養(yǎng)物。在8-10周后，出現(xiàn)了原胚形成群。通過按如上所述方法進(jìn)一步再培養(yǎng)而增殖該P(yáng)EMs。按實(shí)施例5所述方法特培養(yǎng)物過篩而收集PEMs，所不同的是所使用的尼龍網(wǎng)篩孔徑是50μm和250μm。在無生長素和細(xì)胞激動(dòng)素并按如上所述添加營養(yǎng)物的培養(yǎng)基A中培養(yǎng)PEMs并發(fā)育為單個(gè)的體細(xì)胞胚。
實(shí)施例12天竺葵PEM懸浮培養(yǎng)物胚形成的開始用70%乙醇溶液將天竺葵種子(Sluisen Groot的Puisar red品種)進(jìn)行表面滅菌(2分鐘)，再用1.5%的次氯酸鈉溶液表面滅菌(30分鐘)，然后用無菌水徹底沖洗(3×)。使天竺葵種子在濕紙上于23℃萌發(fā)7-14天。以萌發(fā)的種子的子葉用作為外植體材料。在旋轉(zhuǎn)搖床上，在100rpm、23℃溫度、黑暗條件下，將6個(gè)子葉培養(yǎng)于添加了4mg/l2，4-D和0.1mg/l激動(dòng)素的10ml液體培養(yǎng)基A(表ⅰ)中。在一周后，用添加了4mg/l2，4-D和0.1mg/l激動(dòng)素的液體培養(yǎng)基A(表1)將該培養(yǎng)物稀釋5倍至50ml。通過每二周一次用添加了4mg/l2，4-D和0.1mg/l激動(dòng)素的液體培養(yǎng)基A(表1)將該培養(yǎng)液稀釋(2×)或用按如上所述添加了營養(yǎng)物的新鮮培養(yǎng)基A替代該培養(yǎng)基而將培養(yǎng)物進(jìn)行再培養(yǎng)。
在4-6周后出現(xiàn)了原胚形成群。按如上所述方法進(jìn)一步再培養(yǎng)以增殖PEMs。按實(shí)施例5所述篩分懸浮液而收集PEMs，但其中使用的尼龍網(wǎng)的孔徑為250μm和50μm。大小為50-250μm的PEM部分主要產(chǎn)生單個(gè)體細(xì)胞胚。將該P(yáng)EMs培養(yǎng)于不含生長素和細(xì)胞激動(dòng)素的培養(yǎng)基A(表1)中并發(fā)育為單個(gè)的體細(xì)胞胚。
實(shí)施例13在生物反應(yīng)器中擴(kuò)增PEM生物量從按實(shí)施例5所述再培養(yǎng)的黃瓜PEM懸浮培養(yǎng)物中收集4×8mlPCV并接種于4個(gè)生物反應(yīng)器(ApplikonDependable Instruments B.V.)中，其中包括二個(gè)安裝了旋轉(zhuǎn)混合器的2升常規(guī)生物反應(yīng)器以及二個(gè)安裝了振動(dòng)混合器(從Chemap AG購買)的生物反應(yīng)器，每個(gè)反應(yīng)器中含有補(bǔ)充了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素的1升培養(yǎng)基A(表1)。由設(shè)置在振動(dòng)器桿(位置朝向反應(yīng)室底部)末端的一個(gè)孔徑為15μm的多孔噴射裝置將空氣噴到振動(dòng)混合反應(yīng)器中。按本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定其中一個(gè)振動(dòng)混合反應(yīng)器中溶解氧的濃度為40%，另一個(gè)反應(yīng)器中為97%。垂直安裝的振動(dòng)混合器運(yùn)轉(zhuǎn)的頻率為50Hz，最大振幅為±6mm。如此安裝振動(dòng)混合器是為了使振動(dòng)混合器在垂直平面上運(yùn)動(dòng)并且水平方向的運(yùn)動(dòng)保持于最小程度。攪拌盤安裝于振動(dòng)桿的末端以便使液體按照從反應(yīng)器四周汲取細(xì)胞懸浮液流向底部再往上翻的流動(dòng)回路流動(dòng)。
在常規(guī)的生物反應(yīng)器中，由位于生物反應(yīng)器底部的安裝了一個(gè)15μm的多孔噴嘴的噴射管將空氣噴到反應(yīng)器中。按上面所述測(cè)得溶解氧濃度分別為40%和97%。旋轉(zhuǎn)混合器的攪拌速度保持于約150rpm±50rpm。
在接種6天后測(cè)定倍增時(shí)間，從PEM懸浮液中篩分PEMs并按實(shí)施例5所述測(cè)定PEMs/mlPCV。
使用振動(dòng)混合器可以在每單位體積中產(chǎn)生較大量的PEMs(表2，

圖1)。
表2儀器 倍增時(shí)間 PEMs/ml PCV(天)旋轉(zhuǎn)混合器 2.3 200(40% DO2)(1)旋轉(zhuǎn)混合器 2.7 620(97% DO2)振動(dòng)混合器 2.8 2284(40% DO2)振動(dòng)混合器 3.3 3710(97% DO2)(1)DO2=溶解的氧實(shí)施例14在振動(dòng)混合器中增殖PEM生物量從實(shí)施例3所述的經(jīng)過再培養(yǎng)的黃瓜PEM懸浮培養(yǎng)液中收集2×8ml PCV并接種于二個(gè)振動(dòng)混合反應(yīng)器(Applikon Dependable Instruments B.V.)中，其中包括安裝了可從Chemap A G.購得的振動(dòng)混合器的二個(gè)2升生物反應(yīng)器。一個(gè)生物反應(yīng)器含有補(bǔ)充了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素的1升培養(yǎng)基A(表1)，另一個(gè)反應(yīng)器也含有按如上所述添加營養(yǎng)物(不同的是蔗糖濃度為55g/l)的1升培養(yǎng)基A。由設(shè)置在靠近反應(yīng)室底部的振動(dòng)器桿末端的一個(gè)孔徑為15μm的多孔噴射裝置將空氣噴射到振動(dòng)混合反應(yīng)器中。按本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)出溶解氧的濃度為97%。振動(dòng)混合器以50Hz頻率以及±6mm的最大振幅運(yùn)轉(zhuǎn)。振動(dòng)混合器的定位要能使振動(dòng)在垂直平面上進(jìn)行而側(cè)面或水平方向的運(yùn)動(dòng)則保持最小程度。將攪拌盤固定于振動(dòng)桿的末端，以使液體按照從反應(yīng)容器四周汲取細(xì)胞懸浮液流向底部再向上翻的流動(dòng)回路流動(dòng)。
接種6天后測(cè)定倍增時(shí)間，從PEM懸浮液中篩分出PEMs，并按實(shí)施例5所述測(cè)定PEMs/mlPCV。結(jié)果示于表3中。
表3儀器 倍增時(shí)間 PEMs/ml PCV(天)振動(dòng)混合器 3.3 2284(97%,20g/l 蔗糖)振動(dòng)混合器 2.9 6000(97%,55g/l 蔗糖)實(shí)施例15來自攪拌生物反應(yīng)器與振動(dòng)混合生物反應(yīng)器的PEMs的存活力隨時(shí)間變化的比較從實(shí)施例5所述的經(jīng)再培養(yǎng)的黃瓜PEM懸浮培養(yǎng)物中收集3×8mlPCV，并接種于3個(gè)生物反應(yīng)器(ApplikonDependable Instruments B.V.)，其中包括一個(gè)安裝了旋轉(zhuǎn)混合器并含有添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素的1升培養(yǎng)基A(表1)的常規(guī)的2升生物反應(yīng)器，以及2個(gè)安裝有從Chemap AG購買的振動(dòng)混合器的生物反應(yīng)器，在后兩個(gè)反應(yīng)器中，其中之一含有按前面所述添加營養(yǎng)物的1升培養(yǎng)基A，而另一個(gè)也含有按前面所述添加營養(yǎng)物的1升培養(yǎng)基A，但是其中蔗糖濃度為55g/l。
由設(shè)置在朝向反應(yīng)室底部的振動(dòng)器桿末端的一個(gè)孔徑為15μm的多孔噴射裝置將空氣噴到振動(dòng)混合器反應(yīng)器中。按本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)得振動(dòng)混合器中溶解氧的濃度為97%。振動(dòng)混合器以50Hz的頻率以及±6mm的最大振幅進(jìn)行運(yùn)轉(zhuǎn)。振動(dòng)混合器的定位使得振動(dòng)運(yùn)動(dòng)位于垂直平面上而水平振動(dòng)運(yùn)動(dòng)保持于最小程度。將攪拌盤安裝于振動(dòng)桿的末端以便使液體按照從反應(yīng)器四周汲取細(xì)胞懸浮液流向底部，然后向上翻的流動(dòng)回路進(jìn)行流動(dòng)。
在生物反應(yīng)器的底部由一個(gè)安裝有孔徑15μm的多孔噴嘴的噴射管將空氣噴射到常規(guī)生物反應(yīng)器中。按上面所述測(cè)出溶解氧濃度約為97%濃度。旋轉(zhuǎn)混合器的攪拌速度維持于約定150rpm±50rpm。
PEMs/ml PCV在培養(yǎng)開始時(shí)測(cè)定，倍增時(shí)間在6天和14天時(shí)按實(shí)施例5所述測(cè)定。
結(jié)果表明攪拌型生物反應(yīng)器中PEMs的數(shù)量隨時(shí)間顯著降低，而在振動(dòng)混合器中當(dāng)蔗糖濃度為20g/l時(shí)，整個(gè)時(shí)間內(nèi)PEMs的量幾乎維持不變。還表明在蔗糖濃度為55g/l時(shí)，在6天內(nèi)PEM量增至3倍(表4)。
表4儀器 PEMs/ml PCV0天 6天 14天旋轉(zhuǎn)混合器 2300 800 40(97%,20g/l 蔗糖)振動(dòng)混合器 2300 2300 2280(97%,20g/l 蔗糖)振動(dòng)混合器 2300 6000 6000(97%,55g/l 蔗糖)
實(shí)施例16在生物反應(yīng)器中PEMs發(fā)育為魚雷期的體細(xì)胞胚從實(shí)施例15所述的經(jīng)再培養(yǎng)的黃瓜PEM懸浮培養(yǎng)物(55g/l蔗糖，vb/97%DO2)中收集2×100，000篩分的PEMs，并接種于2個(gè)生物反應(yīng)器(Applikon Dependabie instruments B.V.)中，其中包括一個(gè)安裝有旋轉(zhuǎn)混合器的常規(guī)的2升生物反應(yīng)器，以及一個(gè)安裝有可從Chemap AG購買的振動(dòng)混合器的生物反應(yīng)器，二個(gè)反應(yīng)器各含有1升含20g/l蔗糖，以及濃度為5.0μmABA的MS培養(yǎng)基。由設(shè)置在振動(dòng)桿(定位于反應(yīng)室底附近)的末端的一個(gè)孔徑為15μm的多孔噴射裝置將氧氣噴射到振動(dòng)混合反應(yīng)器中。按照本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)得振動(dòng)混合器中的氧濃度為97%。振動(dòng)混合器以50Hz頻率以及±6mm的最大振幅運(yùn)轉(zhuǎn)。振動(dòng)混合器的定位使得振動(dòng)在垂直平面上進(jìn)行并且水平方向的運(yùn)動(dòng)保持于最小程度。將攪拌盤安裝于振動(dòng)桿的末端，以便使液體按照從反應(yīng)器四周汲取PEMs流向底部再往上翻的流動(dòng)回路流動(dòng)。
在常規(guī)生物反應(yīng)器的底部由安裝了一個(gè)孔徑為15μm的多孔噴頭的噴射管將空氣噴到該反應(yīng)器中。按上面所述測(cè)得溶解氧濃度在起始時(shí)為97%，并在7天后使之降至30%±5%。在第8天，使溶解氧濃度回升至97%，并維持于該水平。旋轉(zhuǎn)混合器的攪拌速度維持于約190rpm±5rpm。
常規(guī)生物反應(yīng)器中PEM發(fā)育為充分生長的有用的魚雷期的體細(xì)胞胚的效率為10-15%。振動(dòng)混合生物反應(yīng)器中PEM發(fā)育為充分生長的有用的魚雷期的體細(xì)胞胚的效率大于20%。有用的魚雷期體細(xì)胞胚是一種產(chǎn)生正常外觀的植株的胚。
實(shí)施例17由體細(xì)胞胚產(chǎn)生的仙客來植株的形態(tài)學(xué)穩(wěn)定性通過將體細(xì)胞胚置于盆栽土壤中而將由實(shí)施例2的F1雜種衍生的仙客來體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)變?yōu)樾≈仓?。在第一片葉形成后，將小植株轉(zhuǎn)移到溫室中并生長至成熟。使植株生長到開花階段。對(duì)開花的植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測(cè)，未觀察到這些植株有異常情況。在植株中也未觀察到由于遺傳不同而產(chǎn)生的體細(xì)胞克隆的變異。
實(shí)施例18由體細(xì)胞胚衍生的黃瓜植株中體細(xì)胞克隆的遺傳變異在Sorbarod plugs(Baumgartner papier，Switzerland)上將由F1雜種植株衍生的實(shí)施例6的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)變?yōu)橹仓辏⑸L至結(jié)果實(shí)植株。利用De Laat A.A.等人的方法(上文)測(cè)定80個(gè)植株的倍性水平。所有植株都有相同的倍性水平并且未觀察到體細(xì)胞克隆遺傳變化的差異。
實(shí)施例19黃瓜體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)變?yōu)橹仓暝谘b備了振動(dòng)混合器的生物反應(yīng)器中，在低光照強(qiáng)度下擴(kuò)增黃瓜PEMs，過篩(100-150μm)，并以每50mlMS培養(yǎng)基5000PEMs的密度接種于Erlenmeyer燒瓶中，其中的MS培養(yǎng)基中補(bǔ)充了20g/l蔗糖以及5μM ABA。將PEMs分成二(2)批，使它們進(jìn)一步在光照和黑暗中發(fā)育為體細(xì)胞胚。
使這二批體細(xì)胞胚均在光照條件下轉(zhuǎn)變?yōu)橹仓?。結(jié)果表明，由黑暗中培養(yǎng)的PEMs衍生的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)變?yōu)橹仓甑男矢哂谠诠庹諚l件下發(fā)育的體細(xì)胞胚的轉(zhuǎn)變效率(表5)。
表5光照條件 總體魚雷狀胚轉(zhuǎn)變?yōu)橹仓甑男?br> %光照 28.6黑暗 62.7實(shí)施例20 PEM凝集體的大小與形成適于轉(zhuǎn)變?yōu)橹仓甑膯蝹€(gè)魚雷狀胚的關(guān)系將上述實(shí)施例5中所述的用添加了10mg/l2，4-D和0.5mg/l激動(dòng)素的培養(yǎng)基獲得的9天齡的PEM懸浮液(PEM濃度為50ml PCV/L)用尼龍篩過篩，并用三個(gè)不同的篩分別過篩三次，以獲得三種尺寸不同的PEM部分100-150μm，150-200μm，以及200μm-250μm。在含有3μm ABA的MS培養(yǎng)基中，在約25-50PEMs/ml的PEM起始濃度下進(jìn)行胚發(fā)育。在發(fā)育9天后，在光學(xué)顯微鏡下估測(cè)培養(yǎng)物中魚雷期胚的數(shù)量。估測(cè)單個(gè)魚雷狀胚的數(shù)目與多體魚雷狀胚的數(shù)目的關(guān)系。魚雷狀胚/PEM的比例為5-15%。尺寸＜100μm的部分不含有PEMs。結(jié)果示于表6。
表6過篩后部分的尺寸 單個(gè)魚雷狀胚占總數(shù)的百分比(μm) %100-150 85150-200 20200-250 5用手工操作法從100-150μm尺寸部分中分離出單個(gè)魚雷狀胚，并使它們轉(zhuǎn)變?yōu)閱蝹€(gè)植株。
權(quán)利要求
1.促使外植體材料形成原胚形成群(PEM)的方法，其中PEMs能夠產(chǎn)生存活的體細(xì)胞胚，其特征在于將非愈傷組織外植體材料置于一種液體植物組織培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有有效量的足以誘導(dǎo)原胚形成群(PEM)形成的生長素或生長素混合物。
2.在懸浮培養(yǎng)物中獲得具有基本上相同的倍性水平的體細(xì)胞胚的方法，該方法包括(ⅰ)將外植體材料培養(yǎng)于一種液體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有有效量的足以促使誘導(dǎo)出原胚形成群(PEM)形成的生長素或生長素混合物;(ⅱ)在一種含有生長素的合適的液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增在(ⅰ)中獲得的PEMs的數(shù)目;(ⅲ)收集(ⅱ)中獲得的PEMs并將它們置于基本上不含生長素的液體培養(yǎng)基中;以及(ⅳ)收集由(ⅲ)中的PEMs產(chǎn)生的體細(xì)胞胚。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，該方法包括在步驟(ⅲ)中使用經(jīng)過尺寸選擇且富含存活的PEMs的PEMs。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的方法，其中的液體培養(yǎng)基進(jìn)一步含有一種濃度在約15g/l和90g/l之間的碳水化合物能源。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中碳水化合物能源的濃度在約20g/l和60g/l之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法，其中碳水化合物能源選自蔗糖、葡萄糖和棉子糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的方法，其中在振動(dòng)混合器中振動(dòng)含有生長素的PEM懸浮物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中振動(dòng)混合器在基本上垂直的平面上振動(dòng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一頂所述的方法，其中的外植體材料是由原生質(zhì)體、莖、葉、花瓣、下胚軸區(qū)、頂端分生組織、合子胚本身、塊莖、維管束、中柱鞘、子房或花藥絲衍生而得。
10.從非胡蘿卜屬植物材料獲得的體細(xì)胞胚懸浮培養(yǎng)物，包括具有基本上相同倍性水平的體細(xì)胞胚。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的體細(xì)胞胚懸浮培養(yǎng)物，含有基本上為二倍體的體細(xì)胞胚。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的體細(xì)胞胚懸浮培養(yǎng)物，含有基本上為四倍體的體細(xì)胞胚。
13.根據(jù)權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的懸浮培養(yǎng)物，其中體細(xì)胞胚由從雙子葉或單子葉外植體材料產(chǎn)生的PEMs衍生而得。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)所述的懸浮培養(yǎng)物。其中體細(xì)胞胚選自仙客來屬、南瓜屬、蕃茄屬、蔥屬、秋海棠屬、甜菜屬、報(bào)春花屬、蕓苔屬、辣椒屬、菊苣屬、扶郎花屬、鳳仙花屬、萵苣屬、稻屬、天竺葵屬、碧冬茄屬、堇菜屬以及玉蜀黍?qū)佟?br> 15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的懸浮培養(yǎng)物，它來自于雙子葉外植體材料。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的懸浮培養(yǎng)物，它選自仙客來屬、南瓜屬、甜菜屬、蕓苔屬、堇菜屬、天竺葵屬以及辣椒屬。
17.含有基本上由二倍體細(xì)胞組成的PEMs的懸浮培養(yǎng)物。
18.具有基本上相同倍性水平的非胡蘿卜屬體細(xì)胞胚。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的體細(xì)胞胚，包含基本上都為二倍體的體細(xì)胞胚或基本上都為四倍體的體細(xì)胞胚。
20.由權(quán)利要求2-19所述的體細(xì)胞胚產(chǎn)生的植株。
全文摘要
體細(xì)胞胚的懸浮培養(yǎng)物以及含有體細(xì)胞胚的原胚形成群(PEMs)的懸浮培養(yǎng)物(該P(yáng)EMs具有基本上相同的倍性水平)，由此產(chǎn)生的植株，以及獲得所述體細(xì)胞胚的方法。
文檔編號(hào)C12N5/04GK1092107SQ9410061
公開日1994年9月14日 申請(qǐng)日期1994年1月14日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月15日
發(fā)明者赫里特·揚(yáng)范霍爾斯特, 馬克·克羅伊格, 維爾特·范德梅爾, 埃里克·波斯特馬, 羅布·阿比斯蒂 申請(qǐng)人:S及G種子有限公司