專(zhuān)利名稱(chēng)：類(lèi)胡蘿卜素發(fā)酵生產(chǎn)法的制作方法
迄今為止，已報(bào)道過(guò)有600種以上不同的類(lèi)胡蘿卜素是從細(xì)菌、酵母、真菌和植物中發(fā)現(xiàn)的。能產(chǎn)生胡蘿卜素的生物體，但目前僅有其中兩種。β-胡蘿卜素和蝦黃素已在工業(yè)上以微生物生產(chǎn)并用于食品和飼料工業(yè)。β-胡蘿卜素是從藻類(lèi)獲取的，而蝦黃素是由采用傳統(tǒng)突變技術(shù)產(chǎn)生的Pfaffia菌株生產(chǎn)的。但是，Pfaffia發(fā)酵存在發(fā)酵周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，而從藻類(lèi)回收則很麻煩。因此，人們希望開(kāi)發(fā)各種有較好工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的生產(chǎn)體系，例如可加以控制提高產(chǎn)率，和/或縮短發(fā)酵時(shí)間。WO 91/13078和EP 393690已分別介紹過(guò)使用生物合成基因型草生歐文氏桿菌(Erwinia herbicola)和噬夏孢歐文氏桿菌(Erwinia uredovora)的兩種這樣的體系。而且，已克隆過(guò)海生細(xì)菌土壤桿菌金黃菌(Agrobacterium aurantiacum)和產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)菌株P(guān)C-1(crtW)[Misawa 1995，Biochem.Biophys.Res.Com.209 867-876][Misawa，1995，Bacteriology177，6575-6584]，和來(lái)自綠藻血紅球菌Pluvialis(Haematococ-cus pluvialis)(bkt)[Lotan，1995 FEBS Letters 364，125-128][Kajiwara，1995，Plant Mol.Biol.29 343-352]的三種β-胡蘿卜素酮酶基因(β-胡蘿卜素β-4-加氧酶)。攜帶E.herbicola[Hundle.1994，MGG 245，406-416]或E.uredovora產(chǎn)胡蘿卜素基因(crtE，crtB，crtY和crtI)，并與A.aurantiacum[Misawa，1995]的crtW基因或H.pluvialis[Lotan，1995][Kajiwara，1995]的bkt基因互補(bǔ)的大腸桿菌(E.Coli)，導(dǎo)致了雞油菌黃質(zhì)(canthaxan-thin)(β，β-胡蘿卜素-4，4′-二酮)的積聚，該物質(zhì)源自以中間體海膽烯酮(β，β-胡蘿卜素-4-酮)進(jìn)行的β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)換。將上述基因(crtW或bkt)分別導(dǎo)入到除宿有上述類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因，還宿有E.uredovora crtZ基因[kajiwara，1995][Misawa，1995]的E.coli細(xì)胞中，結(jié)果兩種情況下均引起蝦黃素(3，3′-二羥基-β，β-胡蘿卜素-4，4′-二酮)積聚。以bkt基因所得結(jié)果與其它人(Lotan 1995)所作研究形成鮮明對(duì)比，Latan使用的是相同實(shí)驗(yàn)方案，不同的是，他將H.pluvialis bkt基因?qū)肟珊铣捎衩S質(zhì)(β，β-胡蘿卜素-3，3′-二醇)，宿有E.herbicola(一種與上述E.uredovora密切相關(guān)的菌株)的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因的E.coli宿主中，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有蝦黃素產(chǎn)生。
然而，迄今為止，并未發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因與已知crtW基因有功能活性結(jié)合作用，更重要的是需要繼續(xù)探索更為優(yōu)化的發(fā)酵體系，供工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。
因此本發(fā)明的目的是提供含有一種或多種選自下述一類(lèi)DNA順序的DNA順序a)編碼黃桿菌屬R1534種(Flavobacterium SP.R 1534)的GGPP合成酶的DNA順序(crtE)，或基本上與其同源的DNA順序；b)編碼黃桿菌屬R1534種的八氫蕃茄紅素前體(prephytoene)合成酶的DNA順序(crtB)，或基本上與其同源的DNA順序；c)編碼黃桿菌屬R1534種的八氫蕃茄紅素脫氫酶的DNA順序(crtI)，或基本上與其同源的DNA順序；
d)編碼黃桿菌屬R1534種的蕃茄紅素環(huán)化酶的DNA順序(crtY)，或基本上與其同源的DNA順序；e)編碼黃桿菌屬R1534種的β-胡蘿卜素羥化酶的DNA順序(crtZ)，或基本上與其同源的DNA順序。
本發(fā)明的目的也提供含此類(lèi)DNA順序的載體，優(yōu)選表達(dá)型載體。此外，本發(fā)明的目的還提供由此類(lèi)DNA順序或載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，優(yōu)選原核細(xì)胞，更優(yōu)選E.Coli(大腸桿菌)或Bacillus(芽胞桿菌)菌株。屬真核細(xì)胞的此種轉(zhuǎn)化細(xì)胞(優(yōu)選酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞)也屬本發(fā)明的目的。最后，本發(fā)明也涉及在適宜的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)此類(lèi)細(xì)胞、制備所需類(lèi)胡蘿卜素及類(lèi)胡蘿卜素混合物的方法，及從此類(lèi)細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離出所需類(lèi)胡蘿卜素及其混合物的方法，而如果只有一種類(lèi)胡蘿卜素是所需時(shí)，則可用本領(lǐng)域已知技術(shù)，將其與可能存在的其它類(lèi)胡蘿卜素分離開(kāi)。本發(fā)明還提供其特征在于將此種方法所得類(lèi)胡蘿卜素或類(lèi)胡蘿卜素混合物加入食品或飼料中，配制食品或飼料組合物的方法。
此外，含下述DNA順序的DNA順序是本發(fā)明的目的a)編碼黃桿菌屬R1534種的GGPP含酶的DNA順序(crtE)，或基本上與其同源的DNA順序；和b)編碼黃桿菌屬R1534種的八氫蕃茄紅素前體合酶的DNA順序(crtB)，或與其基本上同源的DNA順序；和c)編碼黃桿菌屬R1534種的八氫蕃茄紅素脫氫酶的DNA順序(crtI)或基本上與其同源的DNA順序。
本發(fā)明的目的也提供包含此類(lèi)DNA順序的載體，優(yōu)選表達(dá)型載體。此外，本發(fā)明的目的還提供由此類(lèi)DNA順序或載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，優(yōu)選原核細(xì)胞，更優(yōu)選E.coli或Bacillus菌株。屬真核細(xì)胞的此類(lèi)轉(zhuǎn)化細(xì)胞(優(yōu)選酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞)也是本發(fā)明的目的。最后，本發(fā)明也涉及在適宜的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)此類(lèi)細(xì)胞，制備所需類(lèi)胡蘿卜素及類(lèi)胡蘿卜素混合物的方法及從此類(lèi)細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離出所需類(lèi)胡蘿卜素及類(lèi)胡蘿卜素混合物的方法，而如果只有一種類(lèi)胡蘿卜素是所期望的，則可用本領(lǐng)域已知方法將其與可能存在的其它類(lèi)胡蘿卜素分開(kāi)。優(yōu)選此種方法用于制備蕃茄紅素，并優(yōu)選該方法用于制備食品及飼料組合物，其特征在于將此種方法所得類(lèi)胡蘿卜素，優(yōu)選蕃茄紅素或類(lèi)胡蘿卜素混合物，優(yōu)選含蕃茄紅素的混合物加入食品或飼料中。
此外，含下述DNA順序的DNA順序也是本發(fā)明的目的a)編碼黃桿菌屬R1534種的GGPP合酶的DNA順序(crtE)，或與其基本上同源的DNA順序；和b)編碼黃桿菌屬R1534種的八氫蕃茄紅素前體合酶的DNA順序(crtB)，或與其基本上同源的DNA順序；和c)編碼黃桿菌屬R1534種的八氫蕃茄紅素脫氫酶的DNA順序(crtI)，或與其基本上同源的DNA順序；和d)編碼黃桿菌屬R1534種的蕃茄紅素環(huán)化酶的DNA順序(crtY)，或基本上與其同源的DNA順序；本發(fā)明的目的也提供含此類(lèi)DNA順序的載體，優(yōu)選表達(dá)型載體。此外本發(fā)明的目的還提供由此類(lèi)DNA或載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，優(yōu)選原核細(xì)胞，更優(yōu)選E.coli或Bacillus菌株。屬真核細(xì)胞的此種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，優(yōu)選酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞，也屬本發(fā)明的目的。最后，本發(fā)明也涉及在適宜的條件下培養(yǎng)此類(lèi)細(xì)胞制備所需類(lèi)胡蘿卜素或類(lèi)胡蘿卜素混合物的方法，及從此類(lèi)細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離所需類(lèi)胡蘿卜素及其混合物的方法，而如果只有一種類(lèi)胡蘿卜素是所期望的，則可用本領(lǐng)域已知方法將其與可能存在的其它類(lèi)胡蘿卜素分離開(kāi)。優(yōu)選此方法用于制備β-胡蘿卜素，并優(yōu)選用于制備食品及飼料組合物，其特征在于用該方法所得類(lèi)胡蘿卜素，優(yōu)選β-胡蘿卜素或類(lèi)胡蘿卜素混合物，優(yōu)選含β-胡蘿卜素的混合物加入食品或飼料中。
而且，本發(fā)明提供由上述含a)-d)亞順序的DNA順序轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，或由含該DNA順序及含編碼產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)菌株P(guān)C-1的β-胡蘿卜素β4-加氧酶的第二DNA順序(crtW)(或與其基本上同源的DNA順序)的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，或由含編碼產(chǎn)堿桿菌菌株P(guān)C-1的β-胡蘿卜素β4-加氧酶DNA順序(crtW)(或與其基本上同源的DNA順序)的第二載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；并提供在適宜條件下培養(yǎng)該細(xì)胞制備所需類(lèi)胡蘿卜素及其混合物的方法；及從該細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離所需類(lèi)胡蘿卜素或其混合物的方法，如果只有一種類(lèi)胡蘿卜素是所需的，則可用本領(lǐng)域已知技術(shù)將其與可能存在的其它類(lèi)胡蘿卜素分離開(kāi)。優(yōu)選此方法用于制備海膽烯酮，并優(yōu)選用于制備食品或飼料組合物的方法，其特征在于，將用所述方法所得類(lèi)胡蘿卜素，優(yōu)選海膽烯酮或類(lèi)胡蘿卜素混合物，優(yōu)選含海膽烯酮的混合物加入到食品或飼料中。
此外本發(fā)明的目的是提供含上述亞順序a)-d)的DNA順序，和編碼產(chǎn)堿桿菌菌株P(guān)C-1的β-胡蘿卜素β4-加氧酶的DNA順序(crtW)(或本質(zhì)上與其同源的DNA順序)，和含該DNA順序的載體，優(yōu)選表達(dá)型載體。而且，本發(fā)明的目的還提供由所述DNA順序或載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，優(yōu)選原核細(xì)胞，更優(yōu)選E.coli或Bacillus菌株。屬真核細(xì)胞的此種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，優(yōu)選酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞，也是本發(fā)明的目的。最后本發(fā)明涉及在適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞制備所需類(lèi)胡蘿卜素或其混合物的方法，以及從所述細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離出所需類(lèi)胡蘿卜素或其混合物的方法，假如只有一種類(lèi)胡蘿卜素是所需的，則可通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)將其與可能同時(shí)存在的其它類(lèi)胡蘿卜素分離開(kāi)，尤其是制備海膽烯酮或雞油菌黃質(zhì)的方法，和制備食品和飼料組合物的方法，其特征在于，將以此方法所得類(lèi)胡蘿卜素，優(yōu)選海膽烯酮或雞油菌黃質(zhì)或類(lèi)胡蘿卜素混合物，優(yōu)選含海膽烯酮或雞油菌黃質(zhì)的混合物加入食品或飼料中。
另外，含下述DNA順序的DNA順序也是本發(fā)明的目的a)編碼黃桿菌屬R1534種的GGPP合酶的DNA順序(crtE)，或與其基本上同源的DNA順序；和b)編碼黃桿菌屬R1534種的八氫蕃茄紅素前體合酶的DNA順序(crtB)，或與其基本上同源的DNA順序；和c)編碼黃桿菌屬R1534種的八氫蕃茄紅素脫氫酶的DNA順序(crtI)，或與其基本上同源的DNA順序；和d)編碼黃桿菌屬R1534種的蕃茄紅素環(huán)化酶的DNA順序(crtY)，或與其基本上同源的DNA順序；和e)編碼黃桿菌屬R1534種的β-胡蘿卜素羥化酶的DNA順序(crtZ)，或與其基本上同源的DNA順序。
本發(fā)明的目的也提供含此種DNA順序的載體，優(yōu)選表達(dá)型載體。此外本發(fā)明的目的還提供由此種DNA順序或載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，優(yōu)選原核細(xì)胞，更優(yōu)選E.coli或Bacillus菌株。屬真核細(xì)胞的此種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，優(yōu)選酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞亦是本發(fā)明的目的。最后，本發(fā)明也涉及在適當(dāng)條件下培養(yǎng)此種細(xì)胞，制備所需類(lèi)胡蘿卜素或其混合物的方法，涉及從此種細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離所需類(lèi)胡蘿卜素或其混合物的方法，如果只有一種類(lèi)胡蘿卜素是所需的，則可用本領(lǐng)域已知方法將其與可能同時(shí)存在的其它類(lèi)胡蘿卜素分開(kāi)。優(yōu)選此種方法用于制備玉米黃質(zhì)，并優(yōu)選用于食品或飼料組合物的制備，其特征在于，將以此種方法所得類(lèi)胡蘿卜素，優(yōu)選玉米黃質(zhì)或類(lèi)胡蘿卜素混合物，優(yōu)選含玉米黃質(zhì)的混合物加入食品或飼料中。
此外，本發(fā)明的目的是含上述亞順序a)-e)，具附加有編碼產(chǎn)堿桿菌菌株P(guān)C-1的β-胡蘿卜素β4-加氧酶的DNA順序(crtW)(或與其本質(zhì)上同源的DNA順序)的DNA順序，并提供含該DNA順序的載體，優(yōu)選表達(dá)型載體。此外，本發(fā)明的目的還提供由該DNA順序或載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，優(yōu)選原核細(xì)胞，更優(yōu)選E.coli或Bacillus菌株。屬真核細(xì)胞的此種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，也在本發(fā)明目的之列。最后本發(fā)明也涉及在適宜條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，制備所需類(lèi)胡蘿卜素或其混合物的方法，及從該細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離所需類(lèi)胡蘿卜素及其混合物的方法，如果只有一種類(lèi)胡蘿卜素是所需的，則可用本領(lǐng)域已知方法，將其與可能同時(shí)存在的其它類(lèi)胡蘿卜素分開(kāi)。優(yōu)選該方法用于制備玉米黃質(zhì)，阿東黃質(zhì)(adonixanthin)，或蝦黃素，并優(yōu)選用于制備食品或飼料組合物，其特征在于將以該方法制備出的類(lèi)胡蘿卜素，優(yōu)選玉米黃質(zhì)，阿東黃質(zhì)或蝦黃素或類(lèi)胡蘿卜素混合物，優(yōu)選含玉米黃質(zhì)、阿東黃質(zhì)或蝦黃素的混合物加入食品或飼料中。
本發(fā)明的目的也包括由含上述亞順序a)-e)的DNA順序轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，或由含該順序并含編碼產(chǎn)堿桿菌菌株P(guān)C-1的β-胡蘿卜素β-加氧酶的第二DNA順序(crtW)(或與其本質(zhì)上同源的DNA順序)的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，或由含編碼產(chǎn)堿桿菌菌株P(guān)C-1的β-胡蘿卜素β4-加氧酶的DNA順序(crtW)(或與其本質(zhì)上同源的DNA順序)的第二載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。還涉及在適宜條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，制備所需類(lèi)胡蘿卜素或其混合物的方法，及從該細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離所需類(lèi)胡蘿卜素及其混合物的方法，如果只有一種類(lèi)胡卜素是所需的，則可用本領(lǐng)域已知技術(shù)，將其與可能同時(shí)存在的其它類(lèi)胡蘿卜素分離開(kāi)。優(yōu)選該方法用于制備玉米黃質(zhì)或阿東黃質(zhì)，并優(yōu)選用于制備食品或飼料組合物，其特征在于，將經(jīng)此法所得類(lèi)胡蘿卜素，優(yōu)選玉米黃質(zhì)或阿東黃質(zhì)，或類(lèi)胡蘿卜素混合物，優(yōu)選含玉米黃質(zhì)或阿東黃質(zhì)的混合物加入食品或飼料中。
本文所提及的短語(yǔ)“基本上同源的DNA順序”，當(dāng)相對(duì)于crtE編碼DNA順序而言時(shí)，是指與黃桿菌屬R1534種的crtE編碼的氨基酸順序相比，所述DNA順序編碼的氨基酸順序表現(xiàn)出有45％以上，優(yōu)選60％以上，更優(yōu)選75％以上，最優(yōu)選90％以上的氨基酸與之相同，同時(shí)，若由黃桿菌屬R1534種的crtE編碼酶時(shí)，所述多肽氨基酸順序表現(xiàn)出與之相同類(lèi)型的酶活性；同樣，當(dāng)相對(duì)于crtB而言時(shí)，所謂“基本上同源”意味著有60％以上，優(yōu)選70％以上，更優(yōu)選80％以上，最優(yōu)選90％以上相同；而相對(duì)于crtI而言，意指70％以上，優(yōu)選80％以上，最優(yōu)選90％以上相同；相對(duì)于crtY而言，意指55％，優(yōu)選70％，更優(yōu)選80％，最優(yōu)選90％相同；相對(duì)于crtZ而言，意指60％以上，優(yōu)選70％，更優(yōu)選80％，最優(yōu)選90％相同；相對(duì)于crtW而言，意指60％以上，優(yōu)選70％，更優(yōu)選80％，最優(yōu)選90％相同?；旧吓ccrtW同源的順序是已知的，例如，土壤桿菌屬金黃菌(Agrobacterium aurantiacum)或綠藻血紅球菌pluvialis(greenalgae Haematococous pluvialis)的β-胡蘿卜素β4-加氧酶(bkt)型。
基因組型DNA、cDNA或合成DNA的DNA順序可由已知技術(shù)制備[例如參見(jiàn)Sambrook等人，Molecular Cloning，Cold Spring HaborLaboratory Press 1989]或如實(shí)施例1，2或7的具體描述。
然后可將來(lái)自此種基因組DNA的本發(fā)明DNA順序克隆，例如采用已知聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法進(jìn)行。該方法的原理可參見(jiàn)如“PCR Pr-otocolsA Guide to Methods and Applications”(Academic Pr-ess，Inc.(1990))。PCR是于體外從不同DNA順序混合物中生產(chǎn)大量有一定長(zhǎng)度和順序的特異DNA的方法。PCR是以所研究的特異DNA片段的酶促擴(kuò)增為基礎(chǔ)的，被對(duì)片段被該順序特異性的，且能與目的順序兩端的相反鏈雜交的二個(gè)寡核苷酸引物所覆蓋。該兩引物的3′端的方面相對(duì)。經(jīng)該模板的反復(fù)循環(huán)熱變性，該引物與其互補(bǔ)順序退火，及以DNA聚合酶使該退火后的引物延伸等步驟，結(jié)果使得PCR引物之間的部分?jǐn)U增。因?yàn)槊總€(gè)引物的延伸產(chǎn)物均能作為另一引物的模板，所以每次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA片段為前一次的兩倍。若使用從嗜熱細(xì)菌Thermus aquaticus分離出的熱穩(wěn)定Taq DNA聚合酶，則可避免使每次熱變性步驟之后必需加入的該聚合酶發(fā)生熱變性作用。這一措施使得只需簡(jiǎn)單改變循環(huán)溫度裝置，便可導(dǎo)致PCR自動(dòng)進(jìn)行。此外，在較高溫度下使引物退火和延伸，可提高擴(kuò)增反應(yīng)的特異性。提高了的特異性，通過(guò)將非目的片段對(duì)該酶和該引物的競(jìng)爭(zhēng)性降至最小，而改善擴(kuò)增產(chǎn)物的總產(chǎn)率。這樣，所研究的特異順序被高度擴(kuò)增，且可采用已知技術(shù)很容易使之與非特異性順序分離，例如以瓊脂糖凝膠分離法，以及可以采用已知技術(shù)，使用載體使之克隆，例如Holten和Graham在Nucleic Acid Res.19，1156(1991)，Kov-alic等人在Nucleic Acid Res.19，4560(1991)，Marchuk等人在Nucleic Acid Res.19，1154(1991)，或Mead等人在Bio/Techno-logy 9，657-663(1991)各文獻(xiàn)中所述。
PCR法中所用寡核苷酸引物可按已知技術(shù)制備，如Sambrook等人(如前而引用的文獻(xiàn))所介紹的方法。
然后可按已知技術(shù)(Sambrook等人前述文獻(xiàn))或?qū)嵤├?或2的詳述，將已擴(kuò)增的DNA順序用于篩選DNA文庫(kù)。
一旦獲得本發(fā)明的完全DNA順序，它們可用作前導(dǎo)，來(lái)確定克隆其它來(lái)源的，基本上同源的DNA順序的新的PCR引物。此外，它們及其同源DNA順序，還可通過(guò)現(xiàn)有已知技術(shù)及Sambrook等人(前述文獻(xiàn))所述，整合入載體中，在適當(dāng)宿主體系中表達(dá)或超表達(dá)編碼多肽(或多種多肽)。但本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知，DNA順序本身也可用來(lái)轉(zhuǎn)化本發(fā)明的適宜宿主體系，得到編碼的多肽的超表達(dá)。適宜的宿主體系例如E.coli，Bacilli(如Bacillus Subtilis)，或Flavobact-er菌株之類(lèi)的細(xì)菌?？梢允褂玫腅.coli是E.coli K12菌株，例如M15[Villarejo等人在J.Bacteriol.120，466-474(1974)一文中描述為DZ 291]、HB 101(ATCC No.33694)，或E.coli SG 13009[Gottesman等人，J.Bacteriol，148，265-273(1981)]。適宜的真核宿主體系有例如Aspergilli(如Aspergillus niger[ATCC 9142])之類(lèi)的真菌，或如Saccharomyces(如Saccharomyces cevevisiae)之類(lèi)的酵母，或Pastoris之類(lèi)的Pichia，所有這些均可從ATCC獲取。
可用于E.coli中表達(dá)的適宜載體已有記載，例如Sambrook等人在前述文獻(xiàn)中，F(xiàn)iers等人在“Procd.8th Int.Biotchnology Sym-posium”[Soc.Franc.de Microbiol.，Paris(Durand等人編)，pp.680-697(1988)]中，Bujard等人在“Methods in Enzymology”[eds.Wu和Grossmann，Academic Press，Inc.Vol.，155，416-433(1987)]中，Stüber等人在“Immunological Methods”[eds.Lefkovits和Pernis，Academic Press，Inc.，Vol.IV，121-152(1990)]中所提及的載體?？捎糜贐acilli中表達(dá)的載體是本領(lǐng)域已知的，并如下述文獻(xiàn)中所介紹的EP 405370，EP 635572，Yansura和Henner的Procd.Nat.Acad.Sci.USA 81，439(1984)，Meth.Enzym.185，199-228(1990)或EP 207459?？稍谡婢斜磉_(dá)的載體亦是本領(lǐng)域已知的，例如EP 420358所述，而在酵母中表達(dá)的載體如EP 183070、EP 183071、EP 248227、EP 263311所述。
當(dāng)該DNA順序于適宜培養(yǎng)基中，在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)之后，類(lèi)胡蘿卜素便可從培養(yǎng)基(假如它們分泌入培養(yǎng)基中)或從宿主生物體中分離出，如果只有一種特異的類(lèi)胡蘿卜素是需要的，并假如必需從同時(shí)存在的其它類(lèi)胡蘿卜素中將其分離開(kāi)來(lái)，則可采用本領(lǐng)域已知技術(shù)(參見(jiàn)例如Carotenoids Vol IAIsolation and Analysis，G.Britton，S.Liaaen-Jensen，H.Pfander；1995，BirkhauserVerlag，Basel)。
本發(fā)明的類(lèi)胡蘿卜素可用于制備食品或飼料。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知其方法。此種食品或飼料組合物還可含一般為此日的常用的，本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)已知的添加劑或組份。
前面對(duì)本發(fā)明作過(guò)總的介紹之后，下面的附圖和實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明加以詳述，但并不能由此構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。


圖1為說(shuō)明黃桿菌屬R1534種形成類(lèi)胡蘿卜素的生物合成途徑，由此闡明由本發(fā)明DNA順序編碼的酶的活性。
圖2為用每一泳道頂部所示的限制性?xún)?nèi)切酶消化，并用探針46F雜交的黃桿菌屬R1534種的基團(tuán)組DNA的Southern印跡圖。箭頭所指為分離出的2.4kb Xho1/PstI片段。
圖3為用ClaI消化，或用ClaI和HindIII雙消化的基因組黃桿菌屬R1534種DNA Southern印跡圖。A，B兩組印跡分別表示以探針A雜交和用探針B雜交的結(jié)果(見(jiàn)實(shí)施例)。標(biāo)明了1.8kb和9.2kb的ClaI/HindIII片段。
圖4為用各泳道頂部所示限制性?xún)?nèi)切酶消化，并用探針C雜交的基因組黃桿菌屬R1534種DNA的Southern印跡圖。由箭頭標(biāo)出分離出的2.8Kb SalI/HindIII片段。
圖5為用各泳道頂部所示限制性?xún)?nèi)切酶消化，并用探針D雜交的基因組黃桿菌屬R1534的DNA的Southern印跡圖。由箭頭標(biāo)明分離出的約3kb BclI/SphI片段。
圖6為從獲得的基因組克隆推斷的黃桿菌屬R1534種之類(lèi)胡蘿卜素生物合成簇組織物理圖。用于篩選的探針位置由各克隆上短線(xiàn)表示。
圖7為橫桿菌屬R1534種類(lèi)胡蘿卜素生物合成簇及其側(cè)接區(qū)域的核苷酸順序。該核苷酸順序從所示第1核苷酸(見(jiàn)圖6中Bam HI位)開(kāi)始編號(hào)。各ORF(orf-5，orf-1，crtE，crtB，crtI，crtY，crtZ和orf-16)的推斷的氨基酸順序由單字母氨基酸代碼表示。箭頭(--→)表示的轉(zhuǎn)錄方向；星號(hào)為中止密碼子。
圖8為分子量為3133道爾頓的黃桿菌屬R1534種的GGPP合成酶(crtE)的蛋白質(zhì)順序。
圖9為分子量為32615道爾頓的黃桿菌屬R1534種的八氫蕃茄紅素前體合成酶(crtB)的蛋白質(zhì)順序。
圖10為分子量為54411道爾頓的黃桿菌屬R1534種的八氫蕃茄紅素脫氫酶(crtI)的蛋白質(zhì)順序。
圖11為分子量為42368道爾頓的黃桿菌屬R1534種的蕃茄紅素環(huán)化酶(crtY)的蛋白質(zhì)順序。
圖12為分子量為19282道爾頓的黃桿菌屬R1534種的β-胡蘿卜素羥化酶(crtZ)的蛋白質(zhì)順序。
圖13含黃桿菌屬R1534種類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因簇缺失的重組質(zhì)粒。
圖14為用于PCR反應(yīng)的引物。用下線(xiàn)畫(huà)出的順序是所標(biāo)明的限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。小寫(xiě)字母表示由突變引入的核苷酸。方框表明在B.Subtilis中識(shí)別的人工RBS。用粗體線(xiàn)印出的字母表示，建立下面基因轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)(ATG)的原始腺嘌呤(見(jiàn)原始操縱子)位置。所有原始黃桿菌屬類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因的ATG均不得不破壞掉，以免與重建的轉(zhuǎn)錄起始位相沖突。箭頭表示所示黃桿菌屬R1534野生型類(lèi)胡蘿卜素基因的起始和結(jié)束。
圖15為用于不同構(gòu)件的接頭。下面劃線(xiàn)的順序是所標(biāo)明的限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別位。小寫(xiě)字母表示由合成引物引入的核苷酸。方框表明B.Subtilis中識(shí)別的人工RBS。箭頭表示所示黃桿菌屬類(lèi)胡蘿卜素基因的起始和結(jié)束。
圖16為質(zhì)粒pBIIKS(+)-克隆59-2，pLyco和pZea4的構(gòu)建。
圖17為質(zhì)粒p602CAR的構(gòu)建。
圖18為質(zhì)粒pBIIKS(+)-CARVEG-E和p602 CARVEG-E的構(gòu)建。
圖19為質(zhì)粒pHP13-2CARZYIB-EINV和pHP13-2PN25ZYIB-EINV的構(gòu)建。
圖20為質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINVMUTRBS2C的構(gòu)建。
圖21為B.Subtilis菌株BS 1012∷ZYIB-EINV4的Northern印跡分析。A組質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4交互整合入B.Subtilism果聚糖-蔗糖酶基因中的示意圖。B組用探針A獲得的Northern印跡(用CAR 51和CAR 76獲得的PCR片段，并與crtZ的3′端及crtY的5′端雜交)。C組用探針B獲得的Northern印跡(從質(zhì)粒pBIIKS(+)-crtE/2分離出的Bam HI-Xhol片段，并與crtE基因的5′部分雜交)。
圖22為三種轉(zhuǎn)化的Bacillus Subtilis菌株BS1012∷SFCO，BS1012∷SFCOCATI和BA1012∷SFCONEOI的整合位點(diǎn)示意圖。只有當(dāng)這些菌株具有可擴(kuò)增結(jié)構(gòu)時(shí)，才能實(shí)現(xiàn)合成黃桿菌屬類(lèi)胡蘿卜素操縱子(SFCO)的擴(kuò)增作用。探針A用于測(cè)定整合的SFCO的拷貝數(shù)。該圖還示出紅霉素抗性基因(ermAM)、氯霉素抗性基因(cat)，新霉素抗性基因(neo)，B.subtilis的cryT基因中止子(cryT)、果聚糖-蔗糖酶基因(sac-B5′和sac-B3′)，pXI12的質(zhì)粒順序(pXI12)，起源于veg啟動(dòng)子復(fù)合物位點(diǎn)I的啟動(dòng)子(PvegI)。
圖23為質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO和pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CCAT的構(gòu)建。
圖24為質(zhì)粒pZea4的完整核苷酸順序。
圖25為產(chǎn)堿桿菌PC-1的合成crtW基因。轉(zhuǎn)譯的蛋白順序示于雙股鏈DNA順序之上。用于PCR合成的12個(gè)寡核苷酸(crtW1-crtW12)以下面劃線(xiàn)表示出來(lái)。
圖26為質(zhì)粒pBIIKS-crtEBIYZW的構(gòu)建。攜帶合成crtW基因的pALTER-Ex2-crtW的HindIII-PmlI片段被克隆進(jìn)HindIII和MluI(平頭)位點(diǎn)。PvegI和Ptac是用于兩操縱子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。該質(zhì)粒的ColE1復(fù)制起始點(diǎn)與pALTER-Ex2構(gòu)件中存在的p15A起始點(diǎn)相似。
圖27為實(shí)施例7構(gòu)建的所有質(zhì)粒相關(guān)插入段。瓦解的基因用11表示。限制性位點(diǎn)S＝SacI、X＝XbaI、H＝HindIII，N＝NsiI、Hp＝HpaI、Nd＝Ndel。
圖28為由本發(fā)明方法從β-胡蘿卜素獲得的各種反應(yīng)產(chǎn)物(類(lèi)胡蘿卜素)。
實(shí)施例1所用原料和一般方法細(xì)菌菌株和質(zhì)粒黃桿菌屬R1534種野生型(ATCC 21588)是用于克隆的基因的DNA來(lái)源。黃桿菌屬R1534種野生型DNA的部分基因組文庫(kù)被構(gòu)建入pBluescriptII+(KS)或(SK)載體中(Stratagene，La Jolla，USA)，并轉(zhuǎn)化入E.coli XL-1 blue(stratagene)或JM109。
培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件轉(zhuǎn)化的E.coli于37℃，在加有用于選擇的100μg氨芐青霉素(Amp)/ml的Luria液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。黃桿菌屬R1534種野生型于27℃，在含1％葡萄糖，1％胰胨(Difco Laborat-ories)，1％酵母提取液(Difco).0.5％MgSO4·7H2O和3％NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
菌落篩選使用下述引物，基本上按照Z(yǔ)on等人[Zon等人，Biotechniques 7，696-698(1989)]的方法采用PCR法對(duì)E.Coli轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選引物#75′-CCTGGATGACGTGCTGGAATATTCC-3′引物#85′-CAAGGCCCAGATCGCAGGCG-3′
基因組DNA將50ml黃桿菌屬R1534種過(guò)夜培養(yǎng)物，于10000g條件下離心處理10分鐘。將所得沉淀用10ml裂解緩沖液(50mMEDTA，0.1M NaCl pH7.5)快速洗滌，再懸浮于補(bǔ)充有10mg溶菌酶的4ml相同緩沖液中，于37℃保溫15分鐘。加入0.3ml N-月桂酰肌氨酸(20％)后，再于37℃繼續(xù)保溫15分鐘，然后用苯酚、苯酚/氯仿和氯仿提取DNA。于室溫下，存在0.3M醋酸鈉(pH5.2)條件下，將該DNA用乙醇沉淀20分鐘，接著于10000g離心處理15分鐘。用70％乙醇漂洗所得沉淀，干燥，并再懸浮于1ml TE(10mM Tr-is，1mM EDTA，pH8.0)中。
用于Southern印跡分析和克隆實(shí)驗(yàn)的所有基因組DNA均以H2O透析48小時(shí)(使用棉膠袋(collodium bag，sartorius，Germany))，然后在0.3M乙酸鈉存在下用乙酸沉淀、并再懸浮于H2O中。
探針標(biāo)記DNA探計(jì)按Sambrook等人前述文獻(xiàn)的隨機(jī)引發(fā)法(random-priming)用(α-32p)dGTP(Amersham)標(biāo)記。
用于篩選微基因文庫(kù)的探針探針46F是使用引物#7和#8，以黃桿菌屬R1534種基因組DNA為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)所得的119bp片段。該探針被認(rèn)為是黃桿菌屬R 1534種八氫蕃茄紅素合成酶(crtB)基因的片段，因?yàn)樗憩F(xiàn)出與來(lái)自其它菌種(如E.uredovora，E.herfi-cola)的八氫蕃茄紅素合成酶基因有顯著的同源性。探針A是起源于克隆85插入段右支的184bp BstXI-PstI片段。探針B是從克隆85插入段左端獲得的397bp XhoI-NotI片段。探針C是從克隆85插入段的右端獲得的536bp BglII-PstI片段。探針D是從克隆59插入段分離出的376bp KpnI-BstyI片段。各探針的定位示于圖6中。
寡核苷酸合成用Applied Biosystems 392 DNA合成儀合成PCR反應(yīng)或測(cè)序用的寡核苷酸。
Southern印跡分析為進(jìn)行雜交試驗(yàn)，將黃桿菌屬R1534種基因組DNA(3μg)用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶消化，并于0.75％瓊脂糖凝膠上電泳。如Sourthern，E.M.所述[Southern，E.M.J.Mol.Biol.98，503(1975)]將其轉(zhuǎn)移到Zeta-探針印跡膜(BIO-RAD)上。預(yù)雜交和雜交是于65℃，在7％SDS、1％BSA(fraction V；Boehring-er)，0.5M Na2HPO4，pH7.2中進(jìn)行的。雜交之后，于室溫下用2×SSC，1％SDS將該膜洗2次，時(shí)間5分鐘，再于65℃用0.1％SSC，0.1％SDS洗二次15分鐘。
DNA順序分析使用Sequenase Kit(USA Biochemical)，采用雙脫氧鍵中止技術(shù)[Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467(1977)]進(jìn)行順序測(cè)定。使用Genetics Computer，Inc.的GCG順序分析軟件包(Version 8.0)將兩股鏈完全測(cè)序及進(jìn)行順序分析[Devereux等人，Nucleic Acids，Res.12，387-395(1984)]。
分析類(lèi)胡蘿卜素將攜帶各種質(zhì)粒構(gòu)建體的E.Coli XL-1或JM109細(xì)胞(200-400ml)，加在補(bǔ)充有100μg氨芐青霉素/ml的LB中，在振蕩燒瓶中，于37℃和220rpm振動(dòng)條件下，生長(zhǎng)如本文所示的時(shí)間，通常24-60小時(shí)。
使用旋轉(zhuǎn)勻漿器(Polytron，Kinematica AG，CH-Luzern)，用足量丙酮提取這些微生物中的類(lèi)胡蘿卜素。用融結(jié)玻璃抽濾器將該勻漿過(guò)濾入圓底燒瓶中。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，用水泵抽真空，于50℃將該濾液蒸發(fā)。為檢測(cè)玉米黃質(zhì)，將殘?jiān)芙庥谡淹?丙酮(86∶14)中，然后用標(biāo)準(zhǔn)相HPLC，按Weber，S.所述[Weber，S.inAnalytical Methods for Vitamins and Carotenoids in Feed，keller，H.E.，Editor，83-85(1988)]進(jìn)行分析。為檢測(cè)β-胡蘿卜素和蕃茄紅素，則將蒸發(fā)的提取物溶解于正己烷/丙酮(99∶1)中，并采用HPLC，按Hengartner等人所述[Hengartner et al.Helv.Chin.Acta 75，1848-1865(1992)]進(jìn)行分析。
實(shí)施例2黃桿菌屬R1534種類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因的克隆為鑒定和分離出攜帶類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑基因的DNA片段，本發(fā)明人使用了DNA片段46F(見(jiàn)方法一節(jié))探測(cè)攜帶用不同限制性?xún)?nèi)切酶消化的黃桿菌屬R1534種染色體DNA的Southern印跡(圖2)。與該探針雜交的2.4kb XhoI/PstI片段看來(lái)是最適宜作為起始的片段。將基因組黃桿菌屬R1534種DNA用XhoI/PstI消化，并在1％瓊脂糖凝膠上電泳。根據(jù)共遷移的DNA標(biāo)志，將該凝膠上約2.4kb區(qū)域切下，并分離該DNA。將黃桿菌屬R1534種基因組DNA的XhoI/PstI微基因文庫(kù)構(gòu)建入pBluescriptIISK(+)的XhoI-PstI位點(diǎn)。然后將100個(gè)E.Coli XL1轉(zhuǎn)化子用引物#7和引物#8(與前面獲得119bp片段(46F)所用相同的引物)，借助PCR法進(jìn)行篩選。發(fā)現(xiàn)一個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，稱(chēng)之為克隆85。對(duì)該插入片段的測(cè)序顯示，該順序不僅與八氫蕃茄紅素合成酶(crtB)同源，而且也與歐文氏桿菌屬(Erwinia)的herbicola和uredovora種二者的八氫蕃茄紅素脫氫酶(crtI)同源。采用同樣方法，使用探針A和B可獲得克隆85的左邊和右邊的基因組順序。將黃桿菌屬R1534種基因組DNA用ClaI和HindIII雙消化，并用探針A和B進(jìn)行Southern印跡分析。用探針A，鑒定出了一個(gè)約1.8kb的ClaI/HindIII片段(圖3A)，將其分離出并亞克隆進(jìn)pBluescri-ptIIKS(+)的ClaI/HindIII位點(diǎn)。用探針A篩選E.Coli XL1轉(zhuǎn)化子得到6個(gè)陽(yáng)性克隆。將這些陽(yáng)性克隆之一的插入片段，克隆43-3測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與上述兩種Erwinia屬的crtI基因N-末端和crtY基因C-末端同源。用探針B，檢測(cè)出約9.2kb的ClaI/HindIII片段(圖3B)，將其分離出并亞克隆進(jìn)pBluescriptIIKS(+)。
篩選該轉(zhuǎn)化子得到一個(gè)陽(yáng)性克隆51，對(duì)該插入片段5′和3′端測(cè)序發(fā)現(xiàn)，只有靠近HindIII位點(diǎn)區(qū)表現(xiàn)出與上述Erwinia屬類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因(如crtB基因和crtE基因)有相關(guān)同源性。ClaI位點(diǎn)周?chē)捻樞蛭幢憩F(xiàn)出與類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑已知基因同源。根據(jù)這些信息，并為有利于進(jìn)一步測(cè)序及構(gòu)建工作，該克隆51的4.2kb BamHI/HindIII片段被亞克隆進(jìn)pBluescriptIIKS(+)相應(yīng)位點(diǎn)，得到克隆2。將該克隆插入片段測(cè)序，證實(shí)存在與Erwinia細(xì)菌crtB和crtE基因同源的基因。這些基因被定位在離HindIII位點(diǎn)1.8kb的范圍內(nèi)。該插入段的其余2.4kb與已知的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因無(wú)同源性。
使用探針C與經(jīng)不同限制性?xún)?nèi)切酶消化的黃桿菌屬R1534種基因組DNA雜交，檢測(cè)出ClaI位點(diǎn)下游的其它基因組順序圖47。
將經(jīng)Southern分析鑒定出的2.8kb SalI/HindIII片段分離出，并亞克隆進(jìn)pBluescriptIIKS(+)的HindIII/XhoI位點(diǎn)。用探針A篩選E.Coli XL1轉(zhuǎn)化子得到一個(gè)陽(yáng)性克隆，稱(chēng)之為克隆59。該克隆插入片段證實(shí)為克隆43-3順序，并另外還含與來(lái)自其它已知蕃茄紅素環(huán)化酶的crtY基因N末端同源的順序。為獲得被認(rèn)為是丟失的crtZ基因，將黃桿菌屬R1534種的Sau3AI部分消化基因文庫(kù)構(gòu)建ApB-luescriptIIKS(+)的BamHI位點(diǎn)。用探針D篩選該文庫(kù)，得到幾個(gè)陽(yáng)性克隆。一個(gè)轉(zhuǎn)化子，被命名為克隆6a，有4.9kb插入片段。對(duì)該插入片段測(cè)序得知，除有已知的編碼crtB、crtI和crtY順序之外，還有丟失的crtZ基因。從攜帶R1534 BclI/SphI片段的微基因文庫(kù)中分離出克隆7g(圖5)，并用探針D篩選?？寺?g的插入片段大小為約3kb。
上述覆蓋黃桿菌屬R1534種基因組約14kb的六個(gè)獨(dú)立的克隆插入段匯編入圖6中。
從BamHI位點(diǎn)(位置1)到堿基對(duì)8625的確定的序列示于圖7中?？寺〉腞1534順序的推定蛋白編碼區(qū)使用能借助其密碼子用法與給定密碼子頻度表相似性，來(lái)識(shí)別蛋白編碼區(qū)的GCG軟件包CodonPreference程序，進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，揭示出編碼推定蛋白的8個(gè)開(kāi)放閱讀框架(ORF)編碼分子量大于41382道爾頓的多肽的1-1165部分ORF(ORF-5)；編碼分子量40081道爾頓的多肽的1180-2352的ORF(ORF-1)；編碼分子量為31331道爾頓的多肽的2521-3405(crtE)ORF；編碼分子量為32615道爾頓的多肽的4316-3408(crtB)ORF；編碼分子量為54411道爾頓的多肽的5797-4316(crtI)ORF；編碼分子量為42368道爾頓的多肽的6942-5797(crtY)ORF；編碼分子量為19282道爾頓的多肽的7448-6942(crtZ)(ORF)；和編碼分子量為19368道爾頓的多肽的8315-7770ORF(ORF-16)；ORF-1和crtE與其它幾個(gè)有相反的轉(zhuǎn)錄取向(圖6)。crtI，crtY和crtZ ORF的轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)，根據(jù)與Shine/Delgarno(S/D)[Shine和Dalgarno，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71，1342-1346(1974)]共有順序AGG-6-9N-ATG(圖10)同源的序列的定位，和根據(jù)與E.herbicola和E.uredovora各酶的N末端順序同源性，可以很清楚地確定出。ORF crtB的轉(zhuǎn)譯，很可能從間隔很小的三個(gè)密碼子ATG(4316)、ATG(4241)、和ATG(4211)開(kāi)始。第一個(gè)密碼子即使不具有該三個(gè)密碼子中最好的S/D順序，仍產(chǎn)生與E.herbicola和E.uredovora crtB蛋白N末端最高同源性的轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物，因此是最大可能的轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)。ORF crtE轉(zhuǎn)譯很可能從150bp中發(fā)現(xiàn)的5個(gè)不同起始密碼子開(kāi)始ATG(2389)，ATG(2446)，ATG(2473)，ATG(2497)，AGT(2521)。根據(jù)下面的觀(guān)察，我們確信ATG(2521)是crtE的最大可能轉(zhuǎn)錄起始位，即該ATG密碼子的前面具有所有5個(gè)上述假定的起始位的最好的共有S/D順序；同時(shí)編碼的蛋白推定的N-末端氨基酸順序與E.herbicola和E.uredovora的crtE酶N末端有最多的同源性。crt轉(zhuǎn)譯起始位和基因產(chǎn)物的特征五種類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因的轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)如下所示，可能的核糖體結(jié)合位點(diǎn)由下面劃線(xiàn)表示出?；騝rtZ、crtY、crtI和crtB非常接近，以致于前一個(gè)基因的TGA中止碼與下一基因的ATG重疊。五個(gè)基因中僅有三個(gè)(crtI、crtY和crtZ)與最佳的共有S/D順序相符。方框TGA順序表示前面基因的中止密碼子。 黃桿菌屬R1534種各crt基因的氨基酸順序所有黃桿菌屬R1534種的五個(gè)ORF與其它菌屬的已知類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因同源，集聚于約5.2kb的一段順序內(nèi)(圖7)。GGDP合成酶(crtE)香葉基香葉基焦磷酸合成酶(crtE基因產(chǎn)物)的氨基酸(aa)順序由295個(gè)aa組成，示于圖8。該酶能將焦磷酸法呢酯和焦磷酸異戊烯酯于1′-4位縮合。八氫蕃茄紅素合酶(crtB)該酶催化兩個(gè)酶促反應(yīng)步驟。首先將兩個(gè)香葉基香葉基焦磷酸酯(C20)頭對(duì)頭縮合成C40類(lèi)胡蘿卜素八氫蕃茄紅素前體。第二步將該前體的環(huán)丙基環(huán)重排得到八氫蕃茄紅素。由黃桿菌屬R1534種的crtB基因編碼的303個(gè)aa示于圖9中。八氫蕃茄紅素脫氫酶(crtI)黃桿菌屬R1534種的八氫蕃茄紅素脫氫酶由494個(gè)aa組成，如圖10所示，性能與E.herbicola和E.uredovora的crtI酶相似，經(jīng)四個(gè)脫氫步驟，將無(wú)色類(lèi)胡蘿卜素八氫蕃茄紅素轉(zhuǎn)化為紅色蕃茄紅素。蕃茄紅素環(huán)化酶(crtY)黃桿菌屬R1534種的crtY基因產(chǎn)物能將β-芷香酮環(huán)引入蕃茄紅素兩側(cè)，獲得β-胡蘿卜素。該黃桿菌屬R1534種的蕃茄經(jīng)素環(huán)化酶由382個(gè)aa組成(圖11)。β-胡蘿卜素羥化酶(crtZ)crtZ的基因產(chǎn)物由169個(gè)aa組成(圖12)，能將β-胡蘿卜素羥基化，得到葉黃素玉米黃質(zhì)。推測(cè)的ORF(orf-1，orf-5，orf-16)的酶促功能orf-1就氨基酸水平而言，與來(lái)自各種生物體(如熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、人、大鼠等)的乙酰乙酰-CoA硫解酶有40％以上相同。因此該基因很可能推定為乙酰乙酰-CoA硫解酶(乙?；?CoA乙酰基轉(zhuǎn)移酶)，該酶能將兩分子乙?；?CoA縮合成乙酰乙?；鵆oA。乙酰乙?；?CoA通過(guò)HMG-CoA合成酶與第三個(gè)乙?；?CoA縮合，形成β-羥基-β-甲基戊二?；?CoA(HMG-CoA)。該化合物是除能產(chǎn)生甾醇外還產(chǎn)生各種具有不同細(xì)胞功能的類(lèi)異戊二烯的甲羥戊酸途徑的一部分。在細(xì)菌和植物中，類(lèi)異戊二烯途徑也能合成某些獨(dú)特產(chǎn)物，如類(lèi)胡蘿卜素，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(如植物中的赤霉素，abcissic酸)，以及植物抗毒素之類(lèi)的次級(jí)代射產(chǎn)物[Riou等人，Gene 148，293-297(1994)]。
orf-5與來(lái)自不同鍵霉菌屬(如S.violaceoruber，S.cinnamo-nensis)的polykitide合成酶的氨基酸順序有約30％的低同源性。這些抗生素合成酶(polyketide合成酶)被分成兩類(lèi)。I類(lèi)是多功能大蛋白，而II類(lèi)是由參與polyketide合成次級(jí)反應(yīng)的幾個(gè)蛋白組成的多蛋白復(fù)合物[Bibb等人，Gene 142，31-39(1994)]。
由orf-16編碼的推定蛋白，氨基酸與可溶性Anabaena cylin-drica氫化酶亞基有42％相同。ORF(crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ)對(duì)類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑酶促活性的功能分配不同ORF基因產(chǎn)物的生物化學(xué)功用，可以通過(guò)分析用黃桿菌屬細(xì)菌基因簇的缺失突變(不是所有的crt基因全部表達(dá))轉(zhuǎn)化的E.Coli宿主菌株中，類(lèi)胡蘿卜素的聚積情況來(lái)確定(圖13)。
構(gòu)建三種不同的質(zhì)粒pLyco，p59-2和pZea4。質(zhì)粒p59-2系通過(guò)將克隆2的HindIII/BamHI片段亞克隆進(jìn)克隆59的HindIII/Bam-HI位點(diǎn)而獲得。p59-2攜帶crtE、crtB、crtI和crtY基因的ORF，應(yīng)產(chǎn)生β-胡蘿卜素。pLyco由p59-2質(zhì)粒缺失編碼crtY基因的約一半(N末端)的KpnI/KpnI片段而獲得。用pLyco轉(zhuǎn)化E.Coli因而含有被切斷的非功能性crtY基因，應(yīng)產(chǎn)生蕃茄紅素，即β-胡蘿卜素前體。pZea4系通過(guò)將p59-2的AscI-SpeI片段，它含crtE，crtB，crtI和crtY基因的大部分，與克隆6a的AscI/XbaI片段，它含有完整的crtY基因和crtZ基因的順序，相連接而構(gòu)建的。因此pZea4[其完全順序見(jiàn)圖24；核苷酸1-683來(lái)自pBluesciptIIKS(+)，核苷酸684-8961來(lái)自黃桿菌屬R1534野生型基因組，核苷酸8962-11233來(lái)自pBluescriptIIKS(+)]具有玉米黃質(zhì)生物合成途徑的所有5個(gè)ORF。該質(zhì)粒pZea4已于1995年5月25日貯藏于DSM-Deuts-che Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(Germany)，入藏號(hào)DSM 10012。因此用該后一質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli細(xì)胞應(yīng)產(chǎn)生玉米黃質(zhì)。為檢測(cè)該類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)生，將轉(zhuǎn)化子在振動(dòng)燒瓶中生長(zhǎng)48小時(shí)，然后按方法一節(jié)所述進(jìn)行類(lèi)胡蘿卜素分析。圖13匯集了上述質(zhì)粒的不同插入段，及檢測(cè)出的主要類(lèi)胡蘿卜素。
正如所預(yù)期的、攜代pLyco的E.coli細(xì)胞產(chǎn)生蕃茄紅素，而攜代p59-2的E.coli細(xì)胞產(chǎn)生β-胡蘿卜素(所有E，9-Z，13-Z)，而攜代pZea4構(gòu)建體的細(xì)胞產(chǎn)生玉米黃質(zhì)。這證實(shí)了合成玉米黃質(zhì)或其前體(八氫蕃茄紅素、蕃茄紅素、β-胡蘿卜素)的黃桿菌屬R1534五種的所有必需基因均被克隆。
實(shí)施例3用于類(lèi)胡蘿卜素合成酶表達(dá)的原料和方法細(xì)菌菌株和質(zhì)粒使用載體pBluescriptIIKS(+)或(-)(Str-atagene，La Jolla，USA)和pUC18[Vieira和Messing，Gene 19，259-268(1982)；Norrander等人，Gene 26，101-106(1983)]在不同E.coli菌株，如XL-1 blue(Stratagene)，TG1或JM 109中進(jìn)行克隆。在所有B.Subtilis轉(zhuǎn)化中，使用菌株1012。質(zhì)粒pHP13[Haima等人，Mol.Gen.Genet.209，335-342(1987)]，和質(zhì)粒p602/22[LeGrice，S.F.J.in Gene Expression Technology，Go-eddel，D.V.Editor，201-214(1990)]是能在B.Subtilis和E.Coli細(xì)胞中復(fù)制的革蘭氏(+)/(-)穿梭載體。質(zhì)粒p205含克隆進(jìn)pUS18的SmaI位點(diǎn)的VegI啟動(dòng)子。質(zhì)粒pXI12是B.Subtilis中基因組成型表達(dá)的整合載體[Haiker等人，in 7th Int.Symposium onthe Genetics of Industrial Microorganisms，June 26-July 1，1994，Mongreal，Quebec，Canada(1994)]。
質(zhì)粒pBEST501[Itaya等人，Nucleic Acids Res.17(11)，4410(1989)]含來(lái)源于S.aureus的質(zhì)粒pUB110(GenBank entryM19465)的新霉素抗性基因盒[Mckenzie等人，Plasmid 15，93-103(1986)；Mckenzie等人，Plasmid 17，83-84(1987)]。當(dāng)其以單拷貝形式存在于B.Subtilis基因組中時(shí)，該新霉素抗性基因表現(xiàn)出選擇標(biāo)志的作用。質(zhì)粒pC194(ATCC 37034)(GenBank entryL08860)來(lái)源于S.aureus[Horinouchi和Weisblaum，J.Bacteriol.150，815-825(1982)]，并含氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。
培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件E.coli于37℃，在加有選擇用的100μg氨芐青霉素(Amp)/ml的Luria液體培養(yǎng)基(LB)中生長(zhǎng)。B.Subtilis細(xì)胞則在補(bǔ)充有紅霉素(1μg/ml)，或新霉素(5-180μg/ml)，或者氯霉素(10-80μg/ml)的VY培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
轉(zhuǎn)化E.coli的轉(zhuǎn)化，是使用BIO-RAD基因脈沖發(fā)生器(Herc-ules，CA，USA)進(jìn)行電穿孔來(lái)完成的，所用參數(shù)為(200Ω，250μFD，2.5V)。B.Subtilis的轉(zhuǎn)化則基本上是根據(jù)Cutting和VanderHron在Molecular Biological Method for Bacillus[Harwood，C.R.and Cutting，S.M.，Editor，John Wiley & SonsChiches-ter.England，61-74(1990)]一書(shū)中的標(biāo)準(zhǔn)程序方法2.8進(jìn)行的。
菌落篩選按Zon等人前述文獻(xiàn)所述進(jìn)行細(xì)菌菌落篩選。
寡核苷酸合成PCR反應(yīng)或測(cè)序所用的寡核苷酸用AppliedBiosystems 392 DNA合成儀合成。
PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)使用U1Tma DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)，或Pfu Vent聚合酶(New England Biolabs)，按制造商的說(shuō)明來(lái)進(jìn)行。典型的50μl PCR反應(yīng)包括100ng模板DNA，每一種引物為10PM，所有4種dNTP(最終濃度300μM)，MgCl2(若使用U1Tma聚合酶時(shí)；最終濃度2mM)，1×U1Tma反應(yīng)緩沖液，或1×Pfu緩沖液(由制造商提供)。將除DNA聚合酶外的所有反應(yīng)組份于95℃保溫2分鐘，按各部分(見(jiàn)下面)所述進(jìn)行循環(huán)步驟。所有反應(yīng)均通過(guò)在第一循環(huán)的72℃延伸步驟期間加入聚合酶，而進(jìn)行熱啟動(dòng)。PCR反應(yīng)結(jié)束時(shí)，取一個(gè)等分試樣在1％瓊脂糖凝膠上分析，然后用苯酚/氯仿提取。用1/10的3M乙酸鈉溶液和二倍體積乙醇，沉淀水相中的擴(kuò)增片段。于12000rpm離心處理5分鐘后，將所得沉淀再懸浮于足量水中(一般為40μl)，然后用所示限制性?xún)?nèi)切酶消化。消化之后將混合物于1％低熔點(diǎn)瓊脂糖上分離。將預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物從瓊脂糖上切下，當(dāng)片段400bp以上時(shí)，用玻璃珠法(GENECLEAN KIT，Bio 101，Vis-ta CA，USA)提純，而當(dāng)片段短于400bp時(shí)，則直接從該凝膠上離心析出，如Heery等人[Heery等人，TIBS6(6)，173(1990)]所述。
基因擴(kuò)增及定點(diǎn)誘變所用寡聚體構(gòu)建不同質(zhì)粒而進(jìn)行的所有PCR反應(yīng)如下面所述。所用所有引物匯集于圖14中。
引物#100和#101被用于擴(kuò)增完全crtE基因的PCR反應(yīng)，所述完全crtE基因在該基因轉(zhuǎn)錄起始位上游有一個(gè)SpeI限制位點(diǎn)和一個(gè)人工核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)。在該擴(kuò)增片段的3′端，引入兩個(gè)獨(dú)特的限制位點(diǎn)，即AvrII和SmaI位點(diǎn)，以利于進(jìn)一步的克隆。該P(yáng)CR反應(yīng)是以U1Tma聚合酶進(jìn)行的，使用下述擴(kuò)增條件進(jìn)行以95℃，1分鐘/60℃，45秒/72℃，1分鐘的模式循環(huán)5次；和以95℃，1分鐘/72℃，1分鐘的模式循環(huán)20次。質(zhì)粒pBIIKS(+)-克隆2用作模板DNA。最終PCR產(chǎn)物用SpeI和SmaI消化，并用GENECLEAN KIT分離。該片段大小約為910bp。
引物#104和#105用于擴(kuò)增crtZ基因的從轉(zhuǎn)譯起始點(diǎn)到位于基因編碼順序中的SalI限制位點(diǎn)的PCR反應(yīng)。在crtZ基因的5′端引入EcoRI，合成的RBS和NdeI位點(diǎn)。該P(yáng)CR反應(yīng)條件如上所述。質(zhì)粒pBIIKS(+)-克隆6a用作模核DNA，將PCR終產(chǎn)物用EcoRI和SalI消化。用GENECLEAN KIT分離出約480bP的片段。
引物MUT1和MUT5用于擴(kuò)增完全crtY基因。在5′端存在包括SalI位點(diǎn)的crtZ基因的后23個(gè)核苷酸，接著是crtY基因轉(zhuǎn)譯起始位前面的人工RBS。該人工建立的RBS的包括有PmlI限制位點(diǎn)。該擴(kuò)增片段的3′端含crtI基因的22個(gè)核苷酸，在其前面有含MunI限制位點(diǎn)的所建立的人工RBS。該P(yáng)CR反應(yīng)所用條件同上，使用下述循環(huán)模式95℃，45秒/60℃，45秒/72℃，75秒循環(huán)5次；接著95℃，45秒/66℃，45秒/72℃，75秒循環(huán)22次。質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4用作Pfu Vent聚合酶的模板。將1225bP的PCR產(chǎn)物切成平頭，并克隆進(jìn)pUC18的SmaI位點(diǎn)(使用Sure-Clone Kit(Pharmacia)，并遵廠(chǎng)商說(shuō)明)。
質(zhì)粒MUT2和MUT6被用于完全crtI基因擴(kuò)增。在5′端存在crtY基因的后23個(gè)核苷酸，接著是領(lǐng)前于crtI基因轉(zhuǎn)譯起始位的人工RBS。該新建立的RBS包括MunI限制位點(diǎn)。該擴(kuò)增片段的3′端，包括含BamHI限制位點(diǎn)的crtB基因上游的人工RBS。該P(yáng)CR反應(yīng)所用條件基本上同上，包括下述循環(huán)模式95℃，30秒/60℃，30秒/72℃，75秒循環(huán)5次，接著以95℃，30秒/66℃，30秒/72℃，75秒模式循環(huán)25次。質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4用作Pfu Vent聚合酶的模板。為進(jìn)行更進(jìn)一步的克隆步驟，用MunI和BamHI消化該1541bp的PCR產(chǎn)物。
引物MUT3和CAR17被用于crtB基因N末端擴(kuò)增。在5′端存在crtI基因的后28個(gè)核苷酸，接著是crtB基因轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)前面的人工RBS。該所建立的RBS包括一個(gè)BamHI限制位點(diǎn)。該擴(kuò)增片段，稱(chēng)為PCR-F，也含位于crtB基因N末端的HindIII限制位點(diǎn)。該P(yáng)CR反應(yīng)所用條件如本文別處所述，包括下述循環(huán)模式95℃，30秒/58℃，30秒/72℃，20秒循環(huán)5次；接著以95℃，30秒/60℃，30秒/72℃，20秒模式循環(huán)25次。質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4用作Pfu Vent聚合酶的模板。將該約160bp的PCR產(chǎn)物用BamHI和HindIII消化。氯霉素抗性基因(cat)擴(kuò)增所用的寡聚體引物CAT3和CAT4用于pC194(ATCC 37034)[Horinouchi和Weisblum前述文獻(xiàn)了，一種S.aureus中發(fā)現(xiàn)的R質(zhì)粒的氯霉素抗性基因的擴(kuò)增。所用PCR反應(yīng)條件如前所述，包括下述循環(huán)模式95℃，60秒/50℃，60秒/72℃，2分鐘循環(huán)5次，接著以95℃，60秒/60℃，60秒/72℃，2分鐘循環(huán)20次。質(zhì)粒pC198用作pfu Vent聚合酶的模板。將該約1050bp的PCR產(chǎn)物用ECORI和AatII消化。
用于產(chǎn)生接頭的寡聚體將兩相應(yīng)引物各90ng加入Eppendorf管中獲得接頭。將該混合物快速真空干燥，將所得殘?jiān)賾腋∮?X連接緩沖液(Ligation butter)(Boehringer，Mannheim，Germany)中。將該液于50℃保溫3分鐘，然后冷卻至室溫，使該引物適當(dāng)雜交。這時(shí)該接頭準(zhǔn)備好連接進(jìn)適當(dāng)位點(diǎn)。所有用于產(chǎn)生接頭的寡聚體如圖15所示。
引物CS1和CS2用于形成含下述限制位點(diǎn)HindIII、AflII、ScaI、XbaI和EcoRI的接頭。
引物MUT7和MUT8用于形成含限制位點(diǎn)SalI、AvrII、PmlI、MluI、MunI、BamHI、SphI和HindIII的接頭。
引物MUT9和MUT10用于引入crtY上游的人工RBS。
引物MUT11和MUT12用于引入crtE上游的人工RBS。
分離RNA根據(jù)Maes和Messens[Nucleic Acids Res.20(16).4374(1992)]所述方法，從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B.Subtilis制備總RNA。
Northern印跡分析為進(jìn)行雜交試驗(yàn)，將多至30μg B.Subti-lis RNA在1×MOPS和0.66M甲醛中的1％瓊脂糖凝膠上電泳。將其轉(zhuǎn)移至Zeta-Probe印跡膜(BIO-RAD)上，UV交聯(lián)，預(yù)雜交和雜交按Farrell，J.R.E.[RNA Methodologies.A Laboratory Guide forisolation and characterization.San Diego，USA，AcademicPress(1993)]所述進(jìn)行。洗滌條件如下2×SSPE/0.1％SDS中2×20分鐘，接著在0.1％SSPE/0.1％SDS(于65℃)中1×20分鐘。然后用磷成像儀(Phosphorimager，Malecular Dynamics)或用放射自顯影儀在X射線(xiàn)膜上(Kodak)進(jìn)行Northirn印跡分析。
分離基因組DNAB.Subtilis基因組DNA是根據(jù)[13]文獻(xiàn)所述標(biāo)準(zhǔn)程序法2.6，從25ml過(guò)夜培養(yǎng)物中分離的。
Southern印跡分析為進(jìn)行雜交試驗(yàn)，將B.Subtilis基因組DNA(3μg)用適當(dāng)限制性?xún)?nèi)切酶消化，并在0.75％瓊脂糖凝膠上電泳。按Southern，E.M.前述文獻(xiàn)方法將其轉(zhuǎn)移至Zeta-Probe印跡膜(BIO-RAD)上。預(yù)雜交和雜交是在7％SDS，1％BSA(fraction V，Boehringer)、0.5M Na2HPO4中，pH7.2，65℃條件下進(jìn)行。雜交之后，將該膜在2×SSC，1％SDS中，室溫下洗兩次，時(shí)間5分鐘；再用0.1％SSC，0.1％SDS，65℃15分鐘洗兩次。用磷成像儀(Mole-cular Dynamics)或用放射自顯影儀在X射線(xiàn)膜(Kodak)上進(jìn)行Sou-thern印跡分析。
DNA順序分析使用Sequenase Kit Version 1.0(United St-ates Biochemical)采用雙脫氧鏈中止技術(shù)(Sanger等人前述文獻(xiàn))測(cè)定順序。使用Genetics Computer，Inc.[Devereux等人前述文獻(xiàn)]的GCG順序分析軟件包(Version 8.0)進(jìn)行順序分析。
B.Subtilis中的基因擴(kuò)增為擴(kuò)增B.Subtilis轉(zhuǎn)化體中SFCO拷貝數(shù)，將單個(gè)菌落接種入補(bǔ)充有1.5％葡萄糖和0.02mg氯霉素或新霉素/ml(取決于哪種抗生素抗性基因存在于擴(kuò)增結(jié)構(gòu)中，見(jiàn)結(jié)果和討論)的15ml VY培養(yǎng)基中。第二天將750μl該培養(yǎng)物接種于含1.5％葡萄糖13ml VY培養(yǎng)基中，對(duì)于cat抗性的突變種補(bǔ)充(60，80，120和150μg/ml)對(duì)于新霉素抗性突變種，補(bǔ)充160μg/ml和180μg/ml。將培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)夜，第二天，將50μl不同的稀釋液(1∶20，1∶400，1∶8000，1∶160000)分別鋪于帶有適當(dāng)抗生素濃度的VY瓊脂平板上。然后分析大的單個(gè)菌落，測(cè)定拷貝數(shù)，和類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)量。
分析類(lèi)胡蘿卜素使E.Coli或B.Subtilis轉(zhuǎn)化體(200-400ml)在37℃，分別在補(bǔ)充有抗生素的LB培養(yǎng)基或VY培養(yǎng)基中生長(zhǎng)文中指定的時(shí)間，通常為24至72小時(shí)，生長(zhǎng)是在振蕩燒瓶中，于220rpm條件下進(jìn)行的。
使用旋轉(zhuǎn)勻漿器(Polytron，Kinematica AG，CH-Luzern)，以足夠體積的丙酮提取該微生物中產(chǎn)生的類(lèi)胡蘿卜素。用融結(jié)玻璃抽濾器將該勻漿液過(guò)濾入圓底燒瓶中。用水泵抽真空，50℃下，將該濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)。為檢測(cè)玉米黃質(zhì)，將殘留物溶于正己烷/丙酮(86∶14)中，然后按Weber，S.前述文獻(xiàn)，將其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)相HPLC分析。為檢測(cè)β-胡蘿卜素和蕃茄紅素，將蒸發(fā)的提取物溶于正己烷/丙酮(99∶1)中，按Hengartner等人前述文獻(xiàn)進(jìn)行HPLC分析。
實(shí)施例4E.Coli中類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)生黃桿菌屬細(xì)菌的類(lèi)胡蘿卜素生物合成簇不同開(kāi)放閱讀框架(ORF)的基因產(chǎn)物的生物化學(xué)功用，可通過(guò)分析E.Coli宿主菌株中類(lèi)胡蘿卜素的積聚情況來(lái)闡明，這些菌株是用攜帶有缺失的黃桿菌屬細(xì)菌基因簇的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的(從而缺少某些crt基因產(chǎn)物)。E.Coli中相似的功能檢測(cè)已有其它研究者介紹過(guò)[Misawa等前述文獻(xiàn)；Perry等人，J.Bacteriol.，168，607-612(1986)；Hundle等人，Molecularand General Genetics 245(4)，406-416(1994)]。從三種基因組分離物pBIIKS(+)-克隆2，pBIIKS(+)-克隆59和pBIIKS(+)-克隆6a構(gòu)建三種不同粒質(zhì)pLyco，pBIIKS(+)-克隆59-2和pZea4(見(jiàn)圖16)。
質(zhì)粒pBIIKS(+)-克隆59-2是通過(guò)將pBIIKS(+)-克隆2的HindIII/BamHI片段亞克隆進(jìn)pBIIKS(+)-克隆59的HindIII/BamHI位點(diǎn)而得。所得質(zhì)粒pBIIKS(+)-克隆59-2攜帶crtE、crtB、crtI和crtY基因的完全ORF，應(yīng)產(chǎn)生β-胡蘿卜素。pLyco是通過(guò)由質(zhì)粒pBIIKS(+)-克隆59-2缺失編碼crtY基因的約一半(N末端)的KpnI/KpnI片段而得。因此用pLyco轉(zhuǎn)化的E.Coli，因而帶有截?cái)嗟姆枪δ苄詂rtY基因，應(yīng)產(chǎn)生蕃茄紅素，即β-胡蘿卜素前體。將含crtE、crtB、crtI，和大部分crtY基因的pBIIKS(+)-克隆59-2的AscI-SpeI片段，與含CrtZ基因和構(gòu)成上述截?cái)嗟腸rtY基因成一完整基因的其余順序的克隆6a的AscI/XbaI片段相連接而構(gòu)建pZea4。因此pZea4因而含有玉米黃質(zhì)生物合成途徑的所有5種ORF。因此用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.Coli細(xì)胞應(yīng)產(chǎn)生玉米黃質(zhì)。為檢測(cè)類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)生，將轉(zhuǎn)化體于振蕩燒瓶中生長(zhǎng)43小時(shí)。然后按方法一節(jié)所述進(jìn)行類(lèi)胡蘿卜素分析。圖16匯集上述質(zhì)粒的構(gòu)造。
正如所預(yù)期的，攜帶pLyco的E.Coli細(xì)胞產(chǎn)生蕃茄紅質(zhì)，攜代pBIIKS(+)-克隆50-2的細(xì)胞產(chǎn)生β-胡蘿卜素(所有E.9-Z，13-Z)，而有pZea4構(gòu)建體的細(xì)胞則產(chǎn)生玉米黃質(zhì)。這證實(shí)我們已克隆了所有用于合成玉米黃質(zhì)或其前體(八氫蕃茄紅素、蕃茄紅素、β-胡蘿卜素)的黃桿菌屬R1534種的全部必需基因。所獲產(chǎn)物水平如表1所示。質(zhì)粒 宿主 玉米黃質(zhì)β-胡蘿卜素蕃茄紅素pLycoE.coli JM109 ND ND 0.05％pBIIKS(+) ″ ND 0.03％ ND-clone59-2pZea4 ″ 0.033％ 0.0009％ ND表1攜帶質(zhì)粒pLyco，pBIIKS(+)-克隆59-2和pZea4的E.coli轉(zhuǎn)化體，振蕩燒瓶中培養(yǎng)43小時(shí)后的類(lèi)胡蘿卜素含量。該值表示類(lèi)胡蘿卜素占干細(xì)胞總質(zhì)量(200ml)的百分?jǐn)?shù)，ND＝未檢測(cè)出。
實(shí)施例5B.Subtilis中類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)生于B.Subtilis中產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的第1方法中，我們將黃桿菌屬細(xì)菌的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因克隆進(jìn)革蘭氏(+)/(-)穿梭載體p602/22[一種p602/20的衍生物，是LeGrice，S.F.J.前述文獻(xiàn)]。最終構(gòu)建體p602-CARVEG-E的組裝是從pZea4(缺失654-3028)的PvuII-AvrII片段，和來(lái)自質(zhì)粒pBIIKS(+)-克隆6a的AvrII-EcoRI片段連接于載體p602/22的EcoRI和ScaI位點(diǎn)的三重連接開(kāi)始的。質(zhì)粒pZea4(缺失654-3028)是用SacI和EspI消化pZea4而得。凸端和凹端均用Klenow酶切成平頭并再連接。構(gòu)建體pZea4(缺失654-3028)缺乏crtE基因上游的大部分順序，該部分是去物合成類(lèi)胡蘿卜素非必需的。質(zhì)粒p602-CAR有黃桿菌屬R1534基因組DNA的約6.7kb，除含所有5種類(lèi)胡蘿卜素基因(約4.9kb)外，還含有位于crt2轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)上游的1.2kb基因組DNA，和crtE轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的200bp。crtZ、crtY、crtI和crtB基因克隆進(jìn)PN25/O啟動(dòng)子(一種可調(diào)節(jié)的E.coli噬菌體T5啟動(dòng)子衍生物)下游，它與lac操縱子元件融合(該元件在B.subtilis是有功能的，見(jiàn)LeGrice，S.F.J.前述文獻(xiàn))。很明顯，p602CAR構(gòu)建體中，PN25/O啟動(dòng)子和crtZ轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間大于1200bp的這段距離并不是最佳的，將在下面步驟中加以改善。p602 CAR構(gòu)造簡(jiǎn)圖示于圖17。為確保crtE基因在B.subtilis中轉(zhuǎn)錄，將VegI啟動(dòng)子[Moran等人，Mol.Gen.Genet.186，339-346(1982)；LeGrice等人，Mol.Gen.Genet.204，229-236(1986)]引入該基因上游，得到質(zhì)粒構(gòu)建體p602-CARVEG-E。該VegI啟動(dòng)子，來(lái)源于LeGrice等人前述文獻(xiàn)所介紹的Veg啟動(dòng)子復(fù)合物的SiteI，表現(xiàn)出在E.coli中具有功能[Moran等人前述文獻(xiàn)]。為獲得該新構(gòu)建體，用SalI和HindIII消化質(zhì)粒p602 CAR，將含完全crtE基因和大部分crtB編碼順序的片段亞克隆進(jìn)質(zhì)粒p205的XhoI和HindIII位點(diǎn)。所得質(zhì)粒p205 CAR在PvegI啟動(dòng)子的下游含有該crtE基因。為再構(gòu)建黃桿菌屬細(xì)菌類(lèi)胡蘿卜素基因簇，分離出下述三個(gè)片段p205 CAR的PmeI/HindIII片段，p602 CAR的HincII/XbaI片段和EcoRI/HindIII片段，并連接到pBluescriptIIKS(+)的EcoRI和XbaI位點(diǎn)，結(jié)果得到構(gòu)建體pBIIKS(+)-CARVEG-E。分離出該后一質(zhì)粒的EcoRI-XbaI片段，連接到p602/22的EcoRI和XbaI位點(diǎn)，得到相似于p602 CAR的，但含有PvegI啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的crtE基因的質(zhì)粒。得到質(zhì)粒p602 CARVEG-E的所有構(gòu)建步驟匯總于圖18。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli TG1細(xì)胞合成玉米黃質(zhì)。相反，用同樣物建體轉(zhuǎn)化的B.subtilis菌株1012不產(chǎn)生任何類(lèi)胡蘿卜素。對(duì)幾種玉米黃質(zhì)陰性B.subtilis轉(zhuǎn)化子的分析均發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)化質(zhì)粒已發(fā)生嚴(yán)重缺失現(xiàn)象。該不穩(wěn)定性可能是由于該構(gòu)建體過(guò)大所致。
為了獲得在B.subtilis中穩(wěn)定的質(zhì)粒，將類(lèi)胡蘿卜素基因克隆進(jìn)Haima等人前述文獻(xiàn)中構(gòu)建的革蘭氏(+)/(-)穿梭載體pHP13。所述穩(wěn)定性問(wèn)題設(shè)想可通過(guò)下述方法得以消除1)減小攜帶類(lèi)胡蘿卜素基因的克隆插入段的大小，2)倒轉(zhuǎn)crtE基因取向，這樣為表達(dá)所有五種基因只需1個(gè)啟動(dòng)子，而不像前述構(gòu)建體一樣需要2個(gè)。而且，從用此種攜帶合成黃桿菌屬細(xì)菌類(lèi)胡蘿卜素操縱子(SECO)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的能力，可判斷一種設(shè)計(jì)方案是否可行。圖19歸納了所有構(gòu)建步驟，及為得到最終構(gòu)建體pHP13-2PN-ZYIB-EINV所制造的中間質(zhì)粒。簡(jiǎn)言之，為便于下述構(gòu)建法，將以引物CS1和CS2獲得的合成接頭，引入穿梭載體pHP13的HindIII和EcoRI位點(diǎn)之間，制成pHP13-2載體。將p602 CARVEG-E的AflII-XbaI片段亞克隆進(jìn)pHP13-2的AflII和XbaI位點(diǎn)構(gòu)建中間構(gòu)建體pHP13-2CARVEG-E。下一步為倒轉(zhuǎn)crtE基因，即除去含原始crtE基因的XbaI和AvrII片段，而用質(zhì)粒pBIIKS(+)-PCRRBScrtE的XbaI-AvrII片段替代。所得質(zhì)粒稱(chēng)之為pHP13-2CARZYIB-EINV，代表具功能性SFCO的第一構(gòu)建體。上面提到的中間構(gòu)建體pBIIKS(+)-PCRRBScrtE，通過(guò)用SpeI和SmaI消化以引物#100和#101產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，并連接于pBluescriptIIKS(+)的SpeI和SmaI位點(diǎn)而得。為使得crtZ轉(zhuǎn)錄起始位靠近啟動(dòng)子PN25/O，制成三連接體，即連接pHP13-2CARZYIB-EINV的BamHI-SalI片段(含5種類(lèi)胡蘿卜素基因的4種)，含PN25/O啟動(dòng)子的同樣質(zhì)粒的BamHI-EcoRI片段，和pBIIKS(+)-PCRRBScrtZ的EcoRI-SalI片段(含由合成RBS領(lǐng)先的大部分crtZ基因)。上述質(zhì)粒pBIIKS(+)-PCRRBScrtZ，通過(guò)用EcoRI和SalI消化以引物#104和#105擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，并連接于pBluescript-IISK(+)的EcoRI和SalI位點(diǎn)而成。所得載體pHP13-2PN25ZYIB-EINV中，SFCO由噬菌體T5啟動(dòng)子PN25/O驅(qū)動(dòng)，應(yīng)當(dāng)為組成型表達(dá)，因?yàn)樵摌?gòu)建體中不存在功能性L(fǎng)ac阻遏物[Peschke and Beuk，J.Mol.Biol.186，547-555(1985)]。用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的E.coli TG1細(xì)胞產(chǎn)生玉米黃質(zhì)。但若該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)B.subtilis中，則檢測(cè)不到有類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)生。將這些轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行質(zhì)粒分析表明，存在引起不穩(wěn)定問(wèn)題的嚴(yán)重缺失現(xiàn)象，這和前面所研究的質(zhì)粒相似。
實(shí)施例6染色體整合構(gòu)建體由于從前面的構(gòu)建體所觀(guān)察到的不穩(wěn)定現(xiàn)象，我們決定使用整合/表達(dá)載體pXI12，將黃桿菌屬細(xì)菌的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因整合入B.subtilis的基因組。整合進(jìn)B.subtilis基因組的果聚糖-蔗糖酶基因(sacB)后，該載體可使整個(gè)操縱子得到組成型表達(dá)。該組成型表達(dá)由VegI啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)，并引起中等水平表達(dá)。含有合成黃桿菌屬類(lèi)胡蘿卜素操縱子(SFCO)的質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4的構(gòu)建過(guò)程如下將pBIISK(+)-PCRRBScrtZ的NdeI-HincII片段克隆進(jìn)pXI12的NdeI和SmaI位點(diǎn)，所得質(zhì)粒稱(chēng)之為pXI12-PCRcrtZ。接著，將pHP13-2PN25ZYIB-EINV的BstEII-PmeI片段連接到pXI12-PCRcrtZ的BstEII-PmeI片段上(見(jiàn)圖20)。借助Campbell型反應(yīng)或借助交互重組，可使以所得構(gòu)建體pXI12-ZYIB-EINV4轉(zhuǎn)化的B.Su-btilis整合CAR基因。進(jìn)一步分析含有類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因交互重組進(jìn)果聚糖-蔗糖酶基因的一種轉(zhuǎn)化子BS1012∷ZYIB-EINV4(圖21)。即使該菌株不合成類(lèi)胡蘿卜素，由Northern印跡分析RNA表明，當(dāng)用探針A雜交時(shí)，存在5.4kb和4.2kb特異性多順?lè)醋觤PNA(見(jiàn)圖21，B組)。較大的RNA有所預(yù)料的信息尺寸，而較短mRNA的來(lái)源不清楚。該Northern印跡與探針B雜交后僅檢測(cè)出大的mRNA片段，表明在crtB基因末端轉(zhuǎn)錄的提前中止。該位置中止信號(hào)的存在說(shuō)明了問(wèn)題，因?yàn)辄S桿菌屬R1534種基因組的原始操縱子編排方式中，crtE和crtB基因互相面對(duì)面排列。借助此種構(gòu)形，crtB 5′端的轉(zhuǎn)錄中止信號(hào)起了作用，以避免合成反意義鏈RNA(該鏈可干擾crtE基因mRNA的轉(zhuǎn)錄)。因?yàn)橄鄬?duì)于野生型來(lái)說(shuō)，該區(qū)域已經(jīng)大大改變，構(gòu)成該中止子的順序也可能改變使其成為有“漏縫”的中止子。使用抗類(lèi)胡蘿卜素途徑中，不同crt酶的抗血清進(jìn)行的western印跡分析表明，核糖體結(jié)合位點(diǎn)可能與胡蘿卜素合成失效有關(guān)。引入的5種基因中，只有crtZ的基因產(chǎn)物β-胡蘿卜素羥化酶可檢測(cè)出。這是由RBS位點(diǎn)領(lǐng)先的，源自pXI12載體，已知在B.subtilis具有功能的唯一基因。McLaughlin等人[J.Bid.Chem.256，11283-11291(1981)]已經(jīng)提出，mRNA的Shine-Dalgarno順序[Shineand Dalagarno前述文獻(xiàn)]和16S rRNA之間的堿基對(duì)相互作用(使核糖體選擇適當(dāng)?shù)钠鹗柬樞?，在革蘭氏陽(yáng)性生物體(B.Subtilis)中，比在革蘭氏陰性生物體(E.coli)中，要穩(wěn)定得多。為獲得高穩(wěn)定性復(fù)合物，將各基因crtY、crtI、crtB和crtE前面的，革蘭氏陰性黃桿菌屬細(xì)菌的RBS位點(diǎn)，用按互補(bǔ)于B.Subtilis 16S rRNA 3′端設(shè)計(jì)的合成RBS(見(jiàn)表2)交換。該交換應(yīng)使得不同類(lèi)胡蘿卜素基因在B.Subtilis中能有效地引發(fā)轉(zhuǎn)譯。該策略被選擇用來(lái)構(gòu)建含匯集于圖20中的所有四個(gè)變化位點(diǎn)的質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C。為有利于在pBluescriptIIKS(+)中進(jìn)一步的克隆步驟，使用用引物MUT7和MUT8獲得的接頭引入另外的限制位點(diǎn)，于所述載體的SalI和HindIII位點(diǎn)之間克隆。所得新的構(gòu)建體pBIIKS(+)-LINKER78有下述限制位點(diǎn)引入AvrII、pmlI、MulI、MunI、BamHI和SphI。被選用的建立不同類(lèi)胡蘿卜素基因上游的合成RBS的一般方法，是使用PCR與誘變相組合的技術(shù)，其中，使用攜帶經(jīng)修飾的RBS位點(diǎn)的指定的引物，或使用帶有該順序的合成接頭，再構(gòu)建基因。通過(guò)用引物MUT2和MUT6擴(kuò)增crtI基因，使crtI和crtB基因前面的RBS重建，該方法包括適當(dāng)改變的RBS位點(diǎn)。獲得的PCR-I片段用MunI和BamHI消化，并連接于pBIIKS(+)-LINKER78的MunI和BamHI位點(diǎn)。所得的中間構(gòu)建體被命名為pBIIKS(+)-LINKER78PCRI。crtB基因前面的RBS的重建是使用攜帶改變了的crtB上游的RBS位點(diǎn)的引物MUT3，和引物CAR17所獲得的小PCR片段來(lái)完成的。用BamHI和HindIII消化該擴(kuò)增的PCR-F片段，并亞克隆進(jìn)pBIIKS(+)-LINKER78的BamHI和HindIII位點(diǎn)，得到構(gòu)建體pBIIKS(+)-LINKER78PCRF。用BamHI和SapI切下pBIIKS(+)-LINKER78PCRI的PCR-I片段，連接到pBIIKS(+)-LINKER78PCRF的BamHI和SapI位點(diǎn)。所得質(zhì)粒pBIIKS(+)-LINKER78PCRFI帶有與PCR-F片段融合的PCR-I片段。將該構(gòu)建體用SalI和PmlI切割，并引入由引物MUT9和MUT10退火所獲得的合成接頭。該后一步驟有利于將要進(jìn)行的上述構(gòu)建體中原始黃桿黃屬RBS的替換。所得質(zhì)粒命名為pBIIKS(+)-LINKER78PCRFIA。crtY和crtI基因前面的合成RBS的組裝是使用MUT1和MUT5引物通過(guò)PCR反應(yīng)進(jìn)行的。該擴(kuò)增的片段PCR-G被載成平頭末端，然后克隆進(jìn)pUC18的SmaI位點(diǎn)，得到構(gòu)建體pUC18-PCR-G。接著于PCR-A和PCR-I片段之間克隆PCR-G片段。為此目的，用MunI和PmlI消化使該P(yáng)CR-G從pUC18-PCR-G中分離出來(lái)，并連接到pBIIKS(+)-LINKER78PCRFIA的MunI和PmlI位點(diǎn)。該構(gòu)建體包含所有4個(gè)片段，PCR-F、PCR-I、PCR-G和PCR-A，相互緊挨著組裝起來(lái)，并含4個(gè)人工RBS位點(diǎn)中的3個(gè)(crtY、crtI、crtB)?；騝rtY、crtI和crtB基因前面的黃桿菌屬RBS由合成的RBS替換，是通過(guò)用質(zhì)粒pBIIKS(+)-LINKER78PCRFIGA的HindIII-SalI片段代替質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4的HindIII-SalI片段來(lái)完成的。該所得質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBSC隨后轉(zhuǎn)化入E.coli TG1細(xì)胞和B.Subt-ilis 1012細(xì)胞。用這些細(xì)胞能產(chǎn)生玉米黃質(zhì)，證實(shí)其中PCR擴(kuò)增的基因具有功能。獲得的該B.Subtilis菌株命名為BS1012∷SFCO1。被交換的最后的黃桿菌屬RBS是crtE基因前面RBS。使用以引物MUT11和MUT12獲得的接頭來(lái)進(jìn)行。從pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS中用NdeI和SpeI除去野生型RBS，并將上面的接頭插入。構(gòu)建體pXI12-ZYIBEINV4MUTRBS2C中所有黃桿菌屬RBS構(gòu)由具有共有順序AAAGGAGG-7-8N-ATG的合成RBS代替(見(jiàn)表2)。用該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的E.coliTG1細(xì)胞表明，該最后一種RBS替換，不與產(chǎn)生玉米黃質(zhì)的能力相干擾。
表2mRNA 核苷酸順序crtZ AAAGGAGGGUUUCAUAUGAGCcrtY AAAGGAGGACACGUGAUGAGCcrtI AAAGGAGGCAAUUGAGAUGAGUcrtB AAAGGAGGAUCCAAUCAUGACCcrtE AAAGGAGGGUUUCUUAUGACGB.subtilis 16S rRNA 3′-UCUUUCCUCCACUAGE.coli 16S rRNA 3′-AUUCCUCCACUAG表2構(gòu)建體pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C，構(gòu)建體pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CCAT，和構(gòu)建體pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO的合成核糖體結(jié)合位點(diǎn)的核苷酸順序。各類(lèi)胡蘿卜素基因前面的、互補(bǔ)于B.Subtilis的16S rRNA 3′端的Shine-Dalgarno順序之核苷酸，用粗體字表示。E.coli的16S rRNA 3′端也列入，用以比較。底下劃線(xiàn)的AUG是所述基因的轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)。通過(guò)測(cè)序分析可以確證含所引入的合成RBS的所有區(qū)域。用質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2轉(zhuǎn)化B.subtilis細(xì)胞，挑選含有通過(guò)交互重組，整合入染色體果聚糖-蔗糖酶基因的SFCO的轉(zhuǎn)化子。該菌株命名為BS1012∷SFCO2。對(duì)該菌株類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)生進(jìn)行分析表明，其產(chǎn)生的玉米黃質(zhì)的量，是以得到該B.subtilis轉(zhuǎn)化子所用質(zhì)粒去轉(zhuǎn)化E.coli所產(chǎn)生之玉米黃質(zhì)的約40％。將BS1012∷SFCO1菌株與其E.coli同類(lèi)菌株進(jìn)行比較，觀(guān)察到相似情況(30％)。雖然E.coli細(xì)胞含的類(lèi)胡蘿卡素基因多18倍，而產(chǎn)生的類(lèi)胡蘿卜素量?jī)H高2-3倍。更為懸殊的是攜帶pZea4構(gòu)建體約200拷貝的E.coli，和攜帶質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C 18拷貝的E.coli之間，所觀(guān)察到的類(lèi)胡蘿卜素含量的差異。前一轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的玉米黃質(zhì)比后一轉(zhuǎn)化子要多48倍。該差異看來(lái)并不僅僅是由于該兩轉(zhuǎn)化子中存在的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因相差約11倍造成的，或許還由于所構(gòu)建的SFCO的次優(yōu)化效能所致，該SFCO中，野生型產(chǎn)菌桿屬操縱子的重疊基因被分出而引入合成RBS。這可能引起重建合成操縱子的較低轉(zhuǎn)譯效率(例如，由于消除了野生型操縱子存在的假定轉(zhuǎn)譯雙倍效應(yīng)(put-ative translational coupling effect)所致)。
為提高類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量，制得兩種新的構(gòu)建體，pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO和pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CCAT，在SFCO整合入染色體果聚糖-蔗糖酶位點(diǎn)后，產(chǎn)生帶有可擴(kuò)增結(jié)構(gòu)[如Janniere等人，在Gene 40，47-55(1985)中所述]的菌株。質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO。于1995年5月25保藏于DSM-Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen Und ZellkulturenGmbH(Germany)，保藏號(hào)DSM10013。該可擴(kuò)增結(jié)構(gòu)，當(dāng)與抗性標(biāo)志(例如氯霉素、新霉素、四環(huán)素)連接時(shí)，可每條染色體擴(kuò)增20-50拷貝。該可擴(kuò)增結(jié)構(gòu)由SFCO，抗性基因，和pXI12順序(由Sac-B3′基因直接重復(fù)側(cè)接)組成(見(jiàn)圖22)。帶增加SFCO拷貝數(shù)的菌株，現(xiàn)可借助挑選抗生素抗性水平提高的轉(zhuǎn)化子而獲得。為構(gòu)建質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO用PstI和SmaI從質(zhì)粒pBEST501中分離出新霉素抗性基因，亞克隆進(jìn)pUC18載體的PstI和EcoO1091位點(diǎn)。所得構(gòu)建體稱(chēng)之為pUC18-Neo。為得到最終構(gòu)建體，用含新霉素抗性基因的pUC18-Neo的SmaI-AatII片段替換質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C的PmeI-AatII片段。質(zhì)粒pXI12-ZYIB-EINV4M-UTRBS2CCAT按下面方法獲得借助使用引物對(duì)Cat3和Cat4的PCR反應(yīng)分離出pC194中的氯霉素抗性基因。用EcoRI和AatII消化該片段，并亞克隆進(jìn)pUC18的EcoRI和AatII位點(diǎn)。所得質(zhì)粒稱(chēng)之為pUC18-CAT。用攜帶氯霉素抗性基因的pUC18-CAT的EcoRI-AatII片段替換pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C的PmeI-AatII片段，獲得最終載體。圖23綜述了獲得上述構(gòu)建體的不同步驟。將該二質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入B.Subtilis菌株1012，挑選出從Campbell型整合得到的轉(zhuǎn)化子。挑選出BC1012∷SFCONEO1和BS1012∷SFCOCAT1兩個(gè)菌株進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。將該兩菌株的各個(gè)菌落，如方法一節(jié)所述在不同抗生素濃度中，各自分別生長(zhǎng)擴(kuò)增。對(duì)攜帶cat基因的菌株來(lái)說(shuō)，氯霉素濃度為60、80、120和150μg/ml。對(duì)攜帶neo基因的菌株來(lái)說(shuō)，新霉素濃度為160和180μg/ml。兩菌株中，僅獲得具SFCO最小擴(kuò)增的菌株。而從BS1012∷SFCONEO1菌株產(chǎn)生的子代菌株中，對(duì)較高新霉素濃度的抗性與染色體中SFCO數(shù)增加有關(guān)，并且由這些細(xì)胞產(chǎn)生較高水平類(lèi)胡蘿卜素。從BS1012∷SFCOCAT1菌株獲得的子代菌株都得到不同結(jié)果。在這些菌株中，將濃高提高到多層150μg氯霉素/ml，正如所預(yù)期的，在染色體中得到較高數(shù)量SFCO拷貝。
實(shí)施例7構(gòu)建含CrtW的質(zhì)粒并用于生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素基于聚合酶鏈反應(yīng)的基因合成編碼產(chǎn)堿桿菌菌株P(guān)C-1的β-胡蘿卜素β-4-加氧酶的人工CrtW基因的核苷酸順序，使用GCGWisconsin順序分析軟件包(Version 8.0，Genetics ComputerGroup，Madison，WI，USA)的逆轉(zhuǎn)譯程序，和E.coli密碼子頻度參考表(由Bach Translate Program提供)，來(lái)逆轉(zhuǎn)譯Misawa(1995)提出的氨基酸順序而獲得。該由726個(gè)核苷酸組成的合成基因基本上按(Ye，1992)所述方法構(gòu)建。合成所需的12個(gè)寡核苷酸(crtW1-crtW12)順序如圖25所示。簡(jiǎn)言之，設(shè)計(jì)具有15-20個(gè)堿基的短重疊的長(zhǎng)的寡核苷酸，用作寡核苷酸延伸的引物。四次循環(huán)之后，應(yīng)存在幾個(gè)全長(zhǎng)變基因拷貝，然后通過(guò)兩末端寡核酸crtW15和crtW26擴(kuò)增。該兩短寡核苷酸的順序是正向引物(forward primer)crtW15(5′-TATATCTAGAcatatgTCCGGTCGTAAA CCGG-3′)和反向引物(rev-erse primer)crtW26(5′-TATAgaattccacgtg TCA AGCACGACCACCGG-TTTTACG-3)，其中與DNA模板匹配的順序由下面劃線(xiàn)表示。小寫(xiě)字母表示為以后克隆進(jìn)pALTER-EX2表達(dá)載體而引入的限制位點(diǎn)(對(duì)于正向引物為NdeI、對(duì)于反向引物為EcoRI和PmlI)。
聚合酶鏈反應(yīng)將所有12個(gè)長(zhǎng)寡核苷酸(crtW1-crtW12；各為7nM)和兩個(gè)末端引物(crtW15和crtW26；各為0.1mM)混合在一起，并加入含ExpandTMHigh Fidelity聚合酶(Boehringer，Mann-heim)(3.5單位)，和dNTP(所有4種，各100mM)的PCR反應(yīng)混合物中。按下述模式，該P(yáng)CR反應(yīng)進(jìn)行30次循環(huán)94℃，1分鐘/50℃，2分鐘/72℃，3分鐘。于1％瓊脂糖凝膠上分離該P(yáng)CR反應(yīng)產(chǎn)物，切下約700bp的譜帶，使用玻璃珠法提純(Geneclean Kit，Bio101，Vis-ta，CA，USA)。然后將該片段克隆進(jìn)質(zhì)粒pUC18的SmaI位點(diǎn)(使用Sure-Clone Kit，Pharmacia，Uppsala，Sweden)。采用Sequena-se Kit Version 1.0(United States Biochemical，Cleveland，OH，USA)測(cè)序來(lái)證實(shí)所生成的crtW合成基因順序。發(fā)現(xiàn)用該法構(gòu)建的crtW基因包含很少錯(cuò)誤，采用定點(diǎn)誘變法將其校正。
構(gòu)建質(zhì)粒質(zhì)粒pBIIKS(+)-CARVEG-E(見(jiàn)實(shí)施例5，圖26)含克隆進(jìn)攜帶B.subtilis Veg啟動(dòng)子[Legrice，1986，#806]位點(diǎn)I的修飾pBluescriptII KS(+)載體(Stratagene，La，Jolla.USA)的革蘭氏陰性黃桿菌屬細(xì)菌菌株R1534野生型(ATCC21588)[Pasamont-es，1995#732]的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因(crtE、crtB、crtY、crtI和crtZ)。該組成型啟動(dòng)子已表明在E.coli中具有功能。攜帶質(zhì)粒pBIIKS(+)-CARVEG-E的E.coli菌株TG1的轉(zhuǎn)化子合成玉米黃質(zhì)。通過(guò)克隆合成crtW基因的NdeI-EcoRI限制片段入質(zhì)粒pALT-ER-Ex2(Promega，Madison，WI)的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建質(zhì)粒pALTER-Ex2-crtW。質(zhì)粒pALTER-Ex2是具有復(fù)制p15a起始點(diǎn)的低拷貝質(zhì)粒該起始點(diǎn)使其與colE1載體維持在同一宿主中?？寺ALTER-Ex2-crtW的HindIII-PmlI片段入HindIII和切成平頭末端的MluI位點(diǎn)(由Klenow酸補(bǔ)平反應(yīng)獲得，如Sambrook所述(1989#505))，而獲得質(zhì)粒pBIIKS-crtEBIYZW(圖26)。通過(guò)缺失285bp NSiI-NSiI片段而使crtZ基因失活，接著進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)中并再連接，得到質(zhì)粒pB-IIKS-crtEBIY[ΔZ]W。攜帶非功能性crtW和crtZ的質(zhì)粒pBIIKScr-tEBIY[ΔZW]，通過(guò)用NdeI和HpaI消化質(zhì)粒pBIIKS-crtEBIY[ΔZ]W，在用Klenow酶在該位點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)平反應(yīng)后，進(jìn)行該質(zhì)粒自身再連接而構(gòu)建成。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coli，由于β-胡蘿卜素積聚而呈桔黃色。正如上面所介紹的一樣，質(zhì)粒pBIIKS-crtEBIYZ[ΔW]帶有通過(guò)缺失質(zhì)粒pBIIKS-crtEBIYZW的NdeI-HpaI片段所獲得的被載斷的crtW基因。質(zhì)粒pALTER-Ex2-crtEBIY[ΔZW]和pALTER-Ex2-crtEBIYZ[ΔW]，通過(guò)分別從pBIIKS-crtEBIY[ΔZW]和pBII-KS-crtEBIYZ[ΔW]中分離出BamHI-XbaI片段，并將其克隆入pAL-TER-Ex2的BamHI和XbaI位點(diǎn)而獲得。質(zhì)粒pBIIKS-crtW是通過(guò)用NsiI和SacI消化pBIIKS-crtEBIYZW，并在用Klenow酶消除DNA懸垂物之后使質(zhì)粒自身再連接而獲得。圖27匯集了本文中所用的所有質(zhì)粒的相關(guān)插入段。
類(lèi)胡蘿卜素分析在補(bǔ)充有抗生素(氨芐青霉素100μg/ml，四環(huán)素12.5μg/ml)的Luria液體培養(yǎng)基中，將攜帶有不同質(zhì)粒構(gòu)建體的E.coli TG-1轉(zhuǎn)化子于振蕩燒瓶中，在37℃，220rpm振蕩條件下生長(zhǎng)20小時(shí)。用丙酮從細(xì)胞中提取出類(lèi)胡蘿卜素。真空除去丙酮，殘?jiān)偃芙庥诩妆街?。在Hewlett-Parkard Series 1050儀器上，將該有色溶液進(jìn)行高效液體色譜(HPLC)分析。類(lèi)胡蘿卜素于硅柱Nucleosil Si-100，200x4mm，3m上分離開(kāi)。溶液體系包括兩種溶劑己烷(A)和己烷/THF 1∶1(B)。在15分鐘內(nèi)施用13-50％(B)的線(xiàn)性梯度液洗脫。流速為1.5ml/min。借助光二極管系統(tǒng)檢測(cè)器于450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)峰值。各類(lèi)胡蘿卜素，通過(guò)將其吸收光譜和典型保留時(shí)間，與化學(xué)純各種類(lèi)胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較而鑒定出，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品由化學(xué)合成，并經(jīng)NMR，MS和UV光譜表明其特征。將用除攜代黃桿菌屬細(xì)菌菌株R1534的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因外，還帶有產(chǎn)堿桿菌PC-1[Misawa，1995#670]編碼β-胡蘿卜素酮酶的crtW基因的質(zhì)粒pBIIKS-crtEBIYZW轉(zhuǎn)化的E.coli細(xì)胞中分離出的色素，進(jìn)行HPLC分析，得到下述經(jīng)鑒定為β-隱黃質(zhì)、蝦黃素、阿東黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)的各主要峰，該鑒定根據(jù)保留時(shí)間、及其吸收光譜與化學(xué)純類(lèi)胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)樣品相比較而得。攜帶pB-IIKS-crtEBIYZW的E.coli轉(zhuǎn)化子中積聚的色素的相對(duì)量(面積百分比)示于表3中[其中“CRX”為隱黃質(zhì)；“ASX”為蝦黃素；“ADX”為阿東黃質(zhì)；“ZXN”為玉米黃質(zhì)；“ECM”為海膽烯酮；“MECH”為3-羥海膽烯酮“CXN”為雞油菌黃質(zhì)]。所有鑒定出的類(lèi)胡蘿卜素峰總面積∑被定義為100％。表3中所列數(shù)字代表每種轉(zhuǎn)化子的4份獨(dú)立培養(yǎng)物之平均值。攜帶同樣基因在兩種質(zhì)粒上，即pBIIKS-crtEBIYZ[ΔW]和pALTER-Ex2-crtW上的E.coli轉(zhuǎn)化子，與前面結(jié)果相比，表現(xiàn)出阿東黃質(zhì)顯著較低，并完全無(wú)蝦黃素色素(表3)，而玉米黃質(zhì)相對(duì)量(％)卻增加了。與在同樣質(zhì)粒(pBIIKS-crtEBI-YZΔW)上攜帶所有crt基因的轉(zhuǎn)化子相比，海膽烯酮，羥基海膽烯酮和雞油菌黃質(zhì)水平保持不變。質(zhì)粒pBIIKS-crtEBIYZ[ΔW]是攜帶黃桿菌屬細(xì)菌菌株R1534的功能性基因crtE、crtB、crtY、crtI、cryZ，并攜帶被截?cái)嗟?，無(wú)功能的crtW基因的高拷貝質(zhì)粒，而crtW基因的功能性拷貝位于低拷貝質(zhì)粒pALTER-Ex2-crtW上。為分析與crtZ相對(duì)而言，crtW基因的超表達(dá)效應(yīng)，將E.coli細(xì)胞用攜帶crtW基因的高拷貝質(zhì)粒pBIIKS-crtW和編碼黃桿菌屬質(zhì)粒pBIIKS-crt基因的低拷貝構(gòu)建體pALIER-Ex2-crtEBIYX[ΔW]共轉(zhuǎn)化。用HPLC分析這些轉(zhuǎn)化子的色素產(chǎn)物，檢測(cè)到存在有β-胡蘿卜素、隱黃質(zhì)、蝦黃素、阿東黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、3-羥海膽烯酮、和痕量海膽烯酮和雞油菌黃質(zhì)(表3)。
由帶有crtW基因的低拷貝質(zhì)粒pALTER-Ex2-crtW和帶有crtE、crtB、crtY和crtI基因的高拷貝質(zhì)粒pBIIKS-crtEBIY[ΔZW]所得到的轉(zhuǎn)化子僅表達(dá)少量雞油菌黃質(zhì)(6％)，但有高水平海膽烯酮(94％)，而在高拷貝質(zhì)粒pBIIKS-crtW上攜代crtW基因，且在低拷貝質(zhì)粒構(gòu)建體pALTER-Ex2-crtEBIY[ΔZW]上攜帶其它c(diǎn)rt基因的細(xì)胞分別產(chǎn)生78.6％的海膽烯酮和21.4％的雞油菌黃質(zhì)(表3)。
表3質(zhì)粒 CRX ASX ADX ZXN ECH HECH CXNpBIIKS-crtEBIYZW 1.1 2.0 44.2 52.4 ＜1 ＜1＜1pBIIKS-crtEBIYZ[ΔW]+pALTER-Ex2-crtW 2.2 - 25.4 72.4 ＜1 ＜1＜1pBIIKS-crtEBIY[ΔZ]W - - - - 66.5 - 33.5pBIIKS-crtEBIY[ΔZW] - - - - 94- 6+pBIIKS-crtW
權(quán)利要求
1.一種含有選自下組一種或多種DNA順序的DNA順序a)編碼黃桿菌屬R1534種GGPP合成酶的DNA順序(crtE)，或與其基本上同源的DNA順序；b)編碼黃桿菌屬R1534種八氫蕃茄紅素前體合成酶的DNA順序(crtB)，或與其基本上同源的DNA順序；c)編碼黃桿菌屬R1534種八氫蕃茄紅素脫氫酶的DNA順序(crtI)，或與其基本上同源的DNA順序；d)編碼黃桿菌屬R1534種蕃茄紅素環(huán)化酶的DNA順序(crtY)，或與其基本上同源的DNA順序；e)編碼黃桿菌屬R1534種β-胡蘿卜素羥化酶的DNA順序(crtZ)，或與其基本上同源的DNA順序。
2.權(quán)利要求1的DNA順序，含下述DNA順序a)編碼黃桿菌屬R1534種GGPP合成酶的DNA順序(crtE)或與其基本上同源的DNA順序；和b)編碼黃桿菌屬R1534種八氫蕃茄紅素前體合成酶的DNA順序(crtB)，或與其基本上同源的DNA順序；和c)編碼黃桿菌屬R1534種八氫蕃茄紅素脫氫酶的DNA順序(crtI)，或與其基本上同源的DNA順序。
3.權(quán)利要求1的DNA順序，包含下述DNA順序a)編碼黃桿菌屬R1534種的GGPP合成酶的DNA順序(crtE)，或與其基本上同源的DNA順序；和b)編碼黃桿菌屬R1534種八氫蕃茄紅素前體合成酶的DNA順序(crtB)，或與其基本上同源的DNA順序；和c)編碼黃桿菌屬R1534種八氫蕃茄紅素脫氫酶的DNA順序(crtI)，或與其基本上同源的DNA順序；和d)編碼黃桿菌屬R1534種蕃茄紅素環(huán)化酶的DNA順序(crtY)，或與其基本上同源的DNA順序；
4.權(quán)利要求1的DNA順序，包含下述DNA順序a)編碼黃桿菌屬R1534種的GGPP合成酶的DNA順序(crtE)，或與其基本上同源的DNA順序；和b)編碼黃桿菌屬R1534種八氫蕃茄紅素前體合成酶的DNA順序(crtB)，或與其基本上同源的DNA順序；和c)編碼黃桿菌屬R1534種八氫蕃茄紅素脫氫酶的DNA順序(crtI)，或與其基本上同源的DNA順序；和d)編碼黃桿菌屬R1534種的蕃茄紅素環(huán)化酶的DNA順序(crtY)，或與其基本上同源的DNA順序；和e)編碼黃桿菌屬R1534種β-胡蘿卜素羥化酶的DNA順序(crtZ)，或與其基本上同源的DNA順序。
5.權(quán)利要求4的DNA順序，其中除含有權(quán)利要求4指定的DNA順序外，還含有編碼產(chǎn)堿桿菌菌株P(guān)C-1β-胡蘿卜素β4-加氧酶的DNA順序(crtW)，或與其基本上同源的順序。
6.如權(quán)利要求3的DNA順序，除含有權(quán)利要求3指定的DNA順序外，還含有編碼產(chǎn)堿桿菌菌株P(guān)C-1β-胡蘿卜素β4-加氧酶的DNA順序(crtW)，或與其基本上同源的DNA順序。
7.含權(quán)利要求1DNA順序的載體。
8.含權(quán)利要求2DNA順序的載體。
9.含權(quán)利要求3DNA順序的載體。
10.含權(quán)利要求4DNA順序的載體。
11.含權(quán)利要求5DNA順序的載體。
12.含權(quán)利要求6DNA順序的載體。
13.由權(quán)利要求1DNA順序或由權(quán)利要求7載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
14.由權(quán)利要求2DNA順序或由權(quán)利要求8載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
15.由權(quán)利要求3DNA順序或由權(quán)利要求9載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
16.由權(quán)利要求4DNA順序，或由權(quán)利要求10載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
17.由權(quán)利要求5DNA順序或由權(quán)利要求11載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
18.由權(quán)利要求6DNA順序或由權(quán)利要求12載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
19.由權(quán)利要求4DNA順序，或由權(quán)利要求10載體和編碼產(chǎn)堿桿菌菌株P(guān)C-1的β-胡蘿卜素β4-加氧酶的第二DNA順序(crtW)或與其基本上同源的DNA順序，或由含編碼產(chǎn)堿桿菌菌株P(guān)C-1的β-胡蘿卜素β4-加氧酶的DNA順序(crtW)或與其基本上同源的DNA順序的第二載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
20.由權(quán)利要求3DNA順序，或由權(quán)利要求9載體和編碼產(chǎn)堿桿菌菌株P(guān)C-1的β-胡蘿卜素β4-加氧酶的第二DNA順序(crtW)或與其基本上同源的DNA順序，或由含編碼產(chǎn)堿桿菌菌株P(guān)C-1的β-胡蘿卜素β4加氧酶的DNA順序(crtW)或與其基本上同源的DNA順序的第二載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
21.權(quán)利要求13-20任意一項(xiàng)的細(xì)胞，其中該細(xì)胞為原核細(xì)胞。
22.權(quán)利要求21的細(xì)胞，該細(xì)胞是大腸桿菌。
23.權(quán)利要求21的細(xì)胞，該細(xì)胞為芽孢桿菌屬菌株。
24.權(quán)利要求13-20任意一項(xiàng)的細(xì)胞，該細(xì)胞為真核細(xì)胞。
25.權(quán)利要求24的細(xì)胞，該細(xì)胞為酵母細(xì)胞。
26.權(quán)利要求24的細(xì)胞，該細(xì)胞為真菌細(xì)胞。
27.一種制備所需類(lèi)胡蘿卜素或其混合物的方法，該方法是在適宜的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求13-26任意一項(xiàng)的細(xì)胞，并從該細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離出所需類(lèi)胡蘿卜素或其混合物，如果只有一種類(lèi)胡蘿卜素是所需的，則采用本領(lǐng)域已知方法，將其從可能存在的其它類(lèi)胡蘿卜素中分離出來(lái)。
28.權(quán)利要求27的方法，通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求14的細(xì)胞制備蕃茄紅素。
29.權(quán)利要求27的方法，通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求15的細(xì)胞制備β-胡蘿卜素。
30.權(quán)利要求27的方法，通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求18或20的細(xì)胞，制備海膽烯酮。
31.權(quán)利要求27的方法，通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求18的細(xì)胞，制備雞油菌黃質(zhì)。
32.權(quán)利要求27的方法，通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求17或19的細(xì)胞，制備玉米黃質(zhì)。
33.權(quán)利要求27的方法，通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求17或19的細(xì)胞，制備阿東黃質(zhì)。
34.權(quán)利要求27的方法，通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求17的細(xì)胞，制備蝦黃素。
35.一種制備食品或飼料組合物的方法，其特征在于將經(jīng)權(quán)利要求27-34任意一項(xiàng)的方法所得類(lèi)胡蘿卜素或其混合物，加入食品或飼料中。
全文摘要
本發(fā)明涉及類(lèi)胡蘿卜素的發(fā)酵生產(chǎn)方法。本發(fā)明提供了編碼黃桿菌素R1534種類(lèi)胡蘿卜素生物合成酶途徑中酶的DNA順序，含有該DNA順序的載體，以及由該DNA順序和/或該載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并提供了用這些細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的方法。
文檔編號(hào)C12P23/00GK1141952SQ9610811
公開(kāi)日1997年2月5日 申請(qǐng)日期1996年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月9日
發(fā)明者漢斯-彼得·霍曼, 戶(hù)斯·帕薩蒙特斯, 米歇爾·特西爾, 阿道弗斯·馮盧恩 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司