專利名稱：抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法
技術領域：
本發(fā)明涉及棉花基因工程，尤其是關于一種利用反義RNA技術抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法。
以棉酚為代表的棉花酚性倍半萜毒素(以下簡稱棉毒素)，集中存在于棉花的腺體中，能抑制包括棉鈴蟲在內的害蟲以及棉花致病菌的生長，是棉花復雜的防御系統(tǒng)的重要組成部分。棉毒素均為倍半萜衍生物，其生物合成的前體是杜松烯。棉花的倍半萜環(huán)化酶，(+)-δ-杜松烯合成酶(CAD)，是棉毒素生物合成途徑中的關鍵酶。該酶以法尼基焦磷酸(FPP)為底物，催化形成環(huán)狀的杜松烯，后者再經P450等酶的催化，形成包括棉酚在內的酚性倍半萜衍生物(Chen,X.Y.et al.,Arch.Biochem.Biophys.1995,324(2):255-266)。實驗證明，用黃萎病菌感染棉苗，可誘導杜松烯合成酶基因的表達，導致棉毒素的大量合成與積累。此外，棉花杜松烯合成酶與棉花腺體也直接相關。如果沒有杜松烯合成酶(或其基因不表達)，棉花的腺體就會大大減少，而棉毒素的含量也就相應降低。
棉花的杜松烯合成酶cDNA和基因已經克隆，cDNA克隆cad1-C以及cad1-A已經發(fā)表(Chen,X.Y.et al.,Arch.Biochem.Biophys.1995,324(2):255-266；Chen,X.Y.et al.,J.Nat.Prod.1996,59(10):944-951)。
棉毒素對哺乳動物，包括人，有毒害作用，對單胃動物毒性尤其嚴重。我國年產棉籽約900萬噸。棉籽營養(yǎng)豐富，蛋白與油脂含量高，但由于倍半萜毒素的存在，未經處理的棉籽及其產品不能食用，也難作飼料，造成大量的蛋白和油料資源浪費(劉毓湘，當代世界棉業(yè)，1995.中國農業(yè)出版社，pp238-256)。因此，理想的棉花品種應當是種子無毒素，而其它器官含有正常量的棉毒素。目前已有的低酚棉品種，其整個棉株的棉毒素含量均很低，因而鼠害、病蟲害比較嚴重，難以推廣；而另一方面，一些野生棉屬種植物，如比克棉(Gossypium bickii)，種子無毒素而植株有毒素，但它的種子不具有被稱為棉纖維的表皮毛，常規(guī)育種難以定向地將種子無毒素這一性狀引入栽培棉品種中。所以，運用基因工程的方法結合常規(guī)育種來選育新品種也就十分必要和迫切了。
1983年，在細菌中首次發(fā)現(xiàn)調控基因的轉錄和翻譯的天然存在的反義RNA(Simons,R.W.et al.,Cell.1983,34:683-691)，隨即科學家便開始設計人工的反義RNA來控制細胞內靶基因的表達，從而定向控制某些生物性狀(Green,P.J.et al.,Ann.Rev.Biochem.1986,55:567-597)，這就是反義RNA技術。目前，反義RNA技術已成為分子生物學中一種較重要的方法，不僅被廣泛應用于動、植物基因表達調控的基礎研究中，同時也越來越多應用于腫瘤病、病毒病的治療、農業(yè)上果實保鮮、抗性育種和花卉生產等各個領域。因此，一旦知道某個植物基因的序列，便可以用反義RNA技術抑制這個基因的表達。如果該反義順序為某個組織或器官特異的啟動子驅動，就可以抑制該基因在特定組織或器官中的表達(Shimada,H.et al.,Theor.Appl.Genet.1993,86:665-672)。所以，本發(fā)明利用反義RNA技術，將兩個杜松烯合成酶cDNA的反義順序同時導入棉花中，并結合組織特異啟動子來調控棉毒素代謝途徑中杜松烯合成酶的表達，從而專一抑制棉籽中棉毒素的形成。這項工作在國內外尚未見報導。
本發(fā)明目的是提供一種抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法，即在種子特異啟動子的驅動下，將棉毒素合成途徑中關鍵酶-杜松烯合成酶基因兩個cDNA(cad1-A和cad1-C)的反義順序導入棉花中，這些反義順序在種子中轉錄后產生反義RNA，抑制正常杜松烯合成酶基因的表達，從而使棉籽中的棉毒素含量大幅降低。而其它組織器官中棉毒素含量保持不變。
本發(fā)明提供一種抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法，采用棉花杜松烯合成酶的反義順序，即在種子特異啟動子的驅動下，將棉毒素合成途徑中關鍵酶-杜松烯合成酶基因的cDNA(cad1-A和cad1-C)的反義順序在種子中轉錄，抑制正常杜松烯合成酶基因的表達，從而使種子中的棉毒素含量大幅降低。棉花杜松烯合成酶是棉毒素生物合成途徑中的關鍵酶，與棉花腺體形成也直接相關。如果沒有杜松烯合成酶(或其基因不表達)，棉花的腺體就會大大減少，而棉毒素的含量也就相應降低。如果在特定組織中杜松烯合成酶基因表達下降，杜松烯合成酶含量降低，就會使該組織中棉毒素含量相應降低。鑒于棉花杜松烯合成酶基因和cDNA已經克隆測序，本發(fā)明利用反義RNA技術，并結合種子特異啟動子，將兩個杜松烯合成酶cDNA的反義順序構建轉基因載體，同時導入棉花，使反義順序插入棉花染色體并表達形成反義RNA，抑制種子中棉花杜松烯合成酶基因的表達，從而專一地抑制棉籽中倍半萜毒素的形成。具體內容如下首先獲得cad1-C和cad1-A的反義順序。將棉花杜松烯合成酶cDNA克隆cad1-C(本實驗室克隆并保存)用限制性內切酶EcoRⅠ和EcoRⅤ(購自Promega公司)切開，取出約1kb的DNA片段，接入用同樣酶切開的pBluescriptSK(+)(購自Stratagene公司，以下簡稱pBSK(+))中，形成中間載體Ⅰ，構建過程如圖1所示，將cad1-C的EcoRⅤ和EcoRⅠ酶切片段(淺色部分)，重組到pBSK(+)中。酶切、PCR檢測電泳圖見圖2，鑒定結果表明，EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切后，重組質粒中插入了一條1kb大小的DNA片段(1行)，大小與pcad1-C用相同酶切形成的cad1-C片段(2行)一致，而pBSK(+)(3行)中無此帶。在cad1-C中有多個HindⅢ位點，所以HindⅢ酶切后，pcad1-C會形成1.1kb和3kb的片段(6行)，而在重組質粒中，則只能形成520bp的DNA片段(5行)。另外，以T3和96t1600為引物做PCR，重組質粒(7行)與pcad1-C(8行)均可形成一條大小相同的特異DNA帶，證明cad1-C片段確實插入了pBSK(+)中形成了中間載體Ⅰ。棉花杜松烯合成酶cDNA克隆cad1-A(本實驗室克隆并保存)用EcoRⅠ和EcoRⅤ切開，取出約1.3kb的片段，接入用SmalⅠ和EcoRⅠ切開的中間載體Ⅰ中，形成中間載體Ⅱ。此時在中間載體Ⅱ中，從XbaⅠ到SmaⅠ,cad1-C和cad1-A的DNA片段是反向的。構建過程見圖3，即將cad1-A的EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切片段(淺色部分)，插入已構建好的中間載體Ⅰ的EcoRⅠ和SmaⅠ位點中。酶切、PCR檢測電泳圖見圖4。由于EcoRⅤ和SmaⅠ均為平端，它們連接后，這兩個酶切位點就消失，所以檢測時以BamHⅠ代替EcoRⅤ/SmaⅠ。鑒定結果表明，EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后，重組質粒中插入了一條1.3kb大小的DNA片段(2行)，大小與pcad1-A用EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切形成的cad1-A片段一致(3行)，而中間載體Ⅰ(1行)中無此帶。以BamHⅠ和EcoRⅤ酶切中間載體Ⅱ，形成2.9kb和2.3kbDNA片段(7行)，而pBSK(+)則只形成2.9kbDNA片段(8行)。以T3和93t550為引物做PCR，中間載體Ⅱ(5行)和pcad1-A(6行)均工作，但大小不同。說明cad1-C和cad1-A片段已如圖3插入形成重組質粒中間載體Ⅱ。
構建轉基因載體。構建所用載體pJL123為本實驗室構建并保存，它含有Phaseolin啟動子Pph，終止子Tph，在Pph和Tph之間依次有XbaⅠ,SmaⅠ,EcoRⅠ,KpnⅠ等位點。該載體還含有35S啟動子驅動的GUS報導基因。將中間載體Ⅱ用XbaⅠ和SmaⅠ切開，取XbaⅠ-SmaⅠ片段，接入用同樣酶切開的pLJ123中，形成轉基因載體。該載體含有Pph驅動的cad1-C和cad1-A的cDNA片段的反向序列。構建過程見圖5，即將cad1-c和cad1-A片段(淺色部分)以反向插入pLJ123中Pph和Tph之間，形成轉基因載體。(箭頭示基因原轉錄方向)。酶切、PCR檢測電泳圖見圖6。鑒定結果表明，XbaⅠ和EcoRⅠ酶切，由于pLJ123上有2個EcoRⅠ位點，酶切形成三條帶(1行，其中一條太小看不到)，重組質粒有三個EcoRⅠ位點，酶切形成4條帶(2行)，其中兩條與pLJ123酶切片段一致，而其中兩條應為cad1-C(1kb)和cad1-A(1.3kb)片段，cad1-A片段與XbaⅠ-EcoRⅠ酶切中間載體Ⅱ形成的cad1-A片段相同(3行)。PCR結果也表明cad1-C和cad1-A片段同時插入pLJ123中形成轉基因載體。PCR檢測電泳圖見圖7。以Phaseolin啟動子中正向引物(1400)與cad1-C的正向引物做PCR(1行)，可以擴增出大小為700bp的特異帶，證明啟動子與cad1-C方向相反。而cad1-C的反向引物和cad1-A正向引物做PCR，可以擴增出1.5kb的帶，表明cad1-C和cad1-A的方向相同(4行)。而負對照pLJ123均未擴增出特異條帶(3、5行)，更進一步證明在轉基因載體中，在Pph啟動子驅動下，cad1-C和cad1-A為反向的。
在棉花開花受精后，立即用微注射法將轉基因載體質粒注入子房。棉花品種為協(xié)作9236、石運321和泗棉3號。收回的種子滅菌后，在MS培養(yǎng)基(配方參見文獻Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)上萌發(fā)，取根尖進行GUS染色。GUS染色結果見圖8，轉基因植株根尖被染成藍色，而對照則未被染成藍色。結果證明反義順序已導入棉花中。GUS染色陽性的植株轉入土中繼續(xù)培養(yǎng)。
選取轉基因和未轉基因的棉花，分別提取種子總蛋白，用抗棉花杜松烯合成酶的兔血清作Western blotting分析。轉基因棉花中反義順序轉錄出的反義RNA發(fā)揮調控作用，干擾正常杜松烯合成酶的合成，因此，在轉基因棉花中杜松烯合成酶的含量應明顯減少。Western blotting檢測結果見圖9，可以看到轉基因棉花棉籽中杜松烯合成酶Western blotting的特定條帶比未轉基因的較細、較弱，說明在所采用的幾個棉花品種中，轉基因棉花棉籽中杜松烯合成酶含量均大大低于未轉基因棉花的棉籽。
測定轉基因棉花棉籽中酚性倍半萜含量。反義RNA抑制棉籽中杜松烯合成酶的正常表達，棉毒素代謝途徑就受到影響，不能正常合成棉毒素，因此棉籽中的棉毒素會比未轉基因的棉籽有大幅降低，而棉花其它組織和器官中的棉毒素含量保持不變。結果見圖10。結果表明，轉基因棉花的棉籽比未轉基因棉花棉籽中的棉酚含量明顯下降，下降幅度一般在40％左右。而檢測其它組織和器官時，轉基因與未轉基因棉花的棉酚含量無變化。
本發(fā)明抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法，如果采用其它組織或器官的特異啟動子，就可同樣特異抑制棉花中該組織或器官中棉毒素的形成。
優(yōu)點與效果目前已有的低酚棉品種，整個棉株的棉毒素含量均很低，因而鼠害、病蟲害比較嚴重，難以推廣。而另一方面，一些種子無毒素而植株有毒素的野生棉屬種植物，如比克棉(Gossypium bickii)，不具有被稱為棉纖維的表皮毛，常規(guī)育種難以定向地將種子無毒素這一性狀引入栽培棉品種。
因此，本發(fā)明采用基因工程方法，由已克隆的杜松烯合成酶cDNA獲得其反義順序，在種子特異表達啟動子驅動下，將其反義順序導入棉花，可以產生棉籽低棉毒素的基因工程棉花。這個技術方案具有特異性強和效率高兩個顯著優(yōu)點。特異性強在于反義順序的表達具有組織特異性，特異地抑制棉花種子中的杜松烯合成酶的表達，從而抑制倍半萜毒素合成，克服了過去育種中棉毒素合成調控無組織器官特異性的缺點。效率高是指反義RNA抑制作用的效率較高，本發(fā)明同時導入兩個杜松烯合成酶的反義順序，可以較大程度地抑制杜松烯合成酶的表達。研究結果顯示，轉基因棉籽中的棉毒素含量下降了40％，而棉花其它組織和器官中的棉毒素含量正常，充分說明本發(fā)明的優(yōu)點和可行性。應用本發(fā)明可以獲得棉籽中棉毒素含量大大下降，而棉花其它組織和器官中的棉毒素含量正常的棉花，作為在棉區(qū)推廣種植棉籽低棉毒素的基因工程棉花品種；也可為棉花常規(guī)育種提供棉籽低棉毒素的基因工程棉花材料和棉毒素生物合成基因工程調控研究提供材料，因此，本發(fā)明具有廣泛的應用前景和實用價值。


圖1是中間載體Ⅰ的構建圖。圖2是中間載體Ⅰ的酶切、PCR檢測電泳圖。
圖中1．EcoRⅠ-EcoRⅤ酶切中間載體Ⅰ；2．EcoRⅠ-EcoRⅤ酶切pcad1-C質粒；3．EcoRⅠ-EcoRⅤ酶切pBSK(+)質粒；4．PCR分子量標準；
5．HindⅢ酶切中間載體Ⅰ；6．HindⅢ酶切pcad1-C質粒；7．中間載體Ⅰ的PCR檢測結果(引物為T3,96t1600)；8．pcad1-C質粒的PCR檢測結果(引物為T3,96t1600)。圖3是中間載體Ⅱ的構建圖。圖4是中間載體Ⅱ的酶切、PCR檢測電泳圖。
圖中1．BamHⅠ-EcoRⅠ酶切中間載體Ⅰ；2．EcoRⅠ-EcoRⅤ酶切pcad1-A質粒；3．BamHⅠ-EcoRⅠ酶切中間載體Ⅱ；4．1Kb DNA分子量標準；5．中間載體Ⅱ的PCR檢測結果(引物為T3,93t550)；6．pcad1-A質粒的PCR檢測結果(引物為T3,93t550)；7．BamHⅠ-EcoRⅤ酶切中間載體Ⅱ；8．BamHⅠ-EcoRⅤ酶切pBSK(+)質粒。圖5是轉基因載體的構建圖。圖6是轉基因載體的酶切、PCR檢測電泳圖。
圖中1．XbaⅠ-EcoRⅠ酶切pLJ123質粒；2．XbaⅠ-EcoRⅠ酶切轉基因載體；3．XbaⅠ-EcoRⅠ酶切中間載體Ⅱ；4．1Kb DNA分子量標準；5．轉基因載體的PCR檢測結果(引物為96t1600,9310)；6．對照pLJ123質粒的PCR檢測結果(引物為96t1600,9310)。圖7是轉基因載體的PCR檢測電泳圖。
圖中1．1kb DNA分子量標準；2．轉基因載體的PCR檢測結果(引物為1400,93460)；3．負對照pLJ123的PCR檢測結果(引物為1400,93460)；
4．轉基因載體的PCR檢測結果(引物為9310,96t1600)；5．負對照pLJ123的PCR檢測結果(引物為9310,96t1600)。圖8是轉基因與未轉基因棉花的GUS染色結果圖。
圖中上．未轉基因棉花；下．轉基因棉花。圖9是轉基因棉花的Western blotting檢測結果圖。
圖中1-2．石運321, 1．未轉基因棉花。2．轉基因棉花3-5．泗棉3號，3．未轉基因棉花。4-5．轉基因棉花6-7．協(xié)作9236,6．未轉基因棉花。7．轉基因棉花。圖10是轉基因棉花棉籽中棉酚含量檢測圖。
圖中1-2．石運321, 1．未轉基因棉花。2．轉基因棉花3-5．泗棉3號，3．未轉基因棉花。4-5．轉基因棉花6-7．協(xié)作9236,6．未轉基因棉花。7．轉基因棉花。
實施例1．中間載體Ⅰ的構建提取質粒pcad1-C。質粒的少量提取采用堿裂解法，參考文獻(Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York)。
挑單克隆菌落于1.5ml LB，振搖培養(yǎng)12-16hr。8,000rpm-10,000rpm離心1min收菌，棄去上清液。加入100μl溶液Ⅰ，混勻。加入200μl溶液Ⅱ，上下顛倒混勻。加入150-180μl溶液Ⅲ，溫和混勻，10,000rpm離心5min。取上清液，加入1ml無水冷乙醇，混勻，-20℃放置10min。10,000rpm離心5min，傾去上清液，干燥。加入150RNase/TE(30μg/ml),37℃，放置20-30min。取出，加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，振蕩30s,10,000rpm離心5min。吸上層溶液至新的Eppendorf管中，加入1/10體積的醋酸鈉，再加總體積2-3倍的無水冷乙醇，-20℃放置10min。10,000rpm離心5min，棄上清。加入1ml 70％乙醇沖洗后，干燥。將沉淀溶于30μlTE，紫外定量并電泳檢查。
取1ug上述質粒DNA用EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切1hr。參考文獻(Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York)。
酶切反應系統(tǒng)包括質粒DNA 1μg10×反應緩沖液2μlEooRⅠ1-5UnitEeoRⅤ1-5Unit水to 20μl37℃保溫1-2hr。反應完畢后，電泳檢測。
回收約1Kb的DNA片段(cad1-C片段)，DNA片段回收采用玻璃奶法(北京原平公司試劑盒操作步驟)。
從瓊脂糖凝膠上切下所需DNA片段(體積不超過100μl)，在Eppendorf管中搗碎。加入3倍體積的溶膠液，60℃水浴5min。期間輕搖Eppendoff管數次使膠完全融化。加入10μl玻璃奶，用加樣槍混勻。室溫靜置5min。8,000rpm離心數秒，吸棄上清。加入125μl漂洗液，混勻。離心棄上清。重復第五步兩次。加適量無菌蒸餾水或TE(10-30μl)，混勻。60℃水浴中放置5min。5,000rpm離心數秒，回收上清液備用。
另外提取質粒pBSK(+)(方法同上)，用EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切1hr，回收約3Kb的片段作為載體。取200ngDNA片段與50ng載體連接。
T4DNA連接酶反應按Crouse等的方法(Crouse,G.E.et al.,Methods inEnzvmology,1983.101:78.)進行。
載體DNA 50ng外源片段 200ng10×連接緩沖液2μlT4連接酶 1Unit
加水至總體積20μl,16-18℃保溫12-18hr。
連接產物轉化大腸桿菌。大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉化參考文獻(Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York.)。
從平板上挑取單菌落，接種于5ml LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按2％的量轉接于50ml新鮮LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.3～0.5(約需2-3hr)。冰浴10min后，4℃,5,000rpm離心5min，收集細胞。將細胞懸浮于1/2體積100mmol/L CaCl2中，冰浴20min。4℃,3,000rpm離心3min。將細胞重新懸浮于1/10體積的含15％甘油的100mM CaCl2中，分裝后立即儲存于-70℃。加連接產物(體積≤10μl,DNA≤50ng)于200μl感受態(tài)細胞中，冰浴20-30min。42℃熱激處理90s，冰浴冷卻2min。加入1ml SOC培養(yǎng)基(配方參見文獻Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York),37℃培養(yǎng)45-60min。離心去部分上清，將適量的菌液涂平板，37℃培養(yǎng)12-16hr，可獲轉化菌落。長出單菌落后，接菌經酶切鑒定(結果見圖2)，得到重組質粒，即為中間載體Ⅰ。實施例2．聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA參考文獻(Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York.)。
在亞克隆過程中，本發(fā)明又利用PCR技術進行檢測，確保目的片段以正確的方向與載體連接。本發(fā)明所用引物及其核苷酸順序T3: AATTAACCCTCACTAAAGGG96t1600: TTGGACTGAATCAATGAAG93460:ATGCGACGTATTCAACAAG93t550: AGGAAGCTTCATAAAGTTC9310: GATGAGGCAGGGAACTTCA1400: CATCCATCCATCCAGA
引物由上海生工公司合成，每管5OD260，加無菌雙蒸水溶解至終濃度為20μmol/L。PCR反應體系MgCl2(10×)3μl緩沖液(10×)3μldNTPs(各2.5μM) 3μl5’端引物(20μM)1μl3’端引物(20μM)1μl模板(0.1μg/μl)1μl牛血清白蛋白(10mg/ml) 0.3μlTaq DNA聚合酶(5U/μl) 0.3μl最后加水至30μlPCR參數設置94℃預變性60s；然后94℃變性30s,47℃復性30s，延伸25s，共30個循環(huán)；最后，72℃延伸5min。反應完畢，取5μl電泳觀察，結果見圖2、4、6、7。實施例3．中間載體Ⅱ的構建(cad1-C和cad1-A反義順序的獲得)方法參見實施例1、2。
提取質粒pcad1-A，取1ug質粒DNA用EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切1hr，回收約1.3Kb的DNA片段；另外提取質粒中間載體Ⅰ,SmaⅠ和EcoRⅤ酶切1hr，回收約4Kb的片段作為載體。取200ngDNA片段與50ng載體連接，轉化大腸桿菌。長出單菌落后，接菌經酶切鑒定結果見圖4，得到重組質粒，即為中間載體Ⅱ。實施例4．轉基因載體的構建方法參見實施例1、2。
提取質粒pLJ123，取1μg用SmaⅠ和XbaⅠ切開，回收DNA片段；中間載體Ⅱ1ug用EcoRⅤ和XbaⅠ切開，回收約2.3kb的片段，連接，轉化，鑒定得到重組質粒，即為轉基因載體。酶切、PCR檢測電泳圖結果見圖6和圖7。實施例5．棉花轉基因方法參見文獻(龔蓁蓁等，中國科學(B輯).1988,18(6):612-614)。
大量提取轉基因載體質粒，用PEG純化，溶于無菌水。棉花開花的當天，以微量加樣器吸質粒溶液注射到棉花子房內，每個子房注射約1-5ug質粒DNA。實施例6．轉基因棉花的GUS組織化學染色GUS組織化學染色按文獻(顧紅雅等編著，植物基因與分子操作．北京．北京大學出版社．1995)進行。轉基因后，收回的種子滅菌，在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)。取棉花根尖浸泡于GUS染色液中，37℃溫育4hr以上，加入70％乙醇脫色后觀察。所用緩沖液如下磷酸緩沖液0.2M Na3PO425ml0.2M Na2HPO46.2ml0.2M NaH2PO428ml pH7.0GUS染色液磷酸緩沖液 25ml0.1M K3[Fe(CN)6] 0.25ml0.1M K4[Fe(CN)6] 0.25ml0.5M Na2EDTA1mlddH2O 23.5mlX-GLucururonide 50mg結果見圖8，轉基因棉花根尖被染成藍色，而未轉基因棉花則未被染成藍色。實施例7．轉基因棉花的Western blotting檢測按文獻(Maniatis,T.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,1982,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)進行。
取一粒棉籽，加液氮充分研磨后，加入適量的蛋白提取緩沖液(Tris/HCl50mmol,pH8.0,EDTA 10mmol pH8.0，巰基乙醇1％),4℃,15000rpm，離心10分鐘后，取上清液，按考馬斯亮蘭測定蛋白含量。各取5ug總蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后用Bio-Rad電轉移裝置(美國Bio-Rad公司出品)轉移到硝酸纖維素膜上(4℃,50mA，過夜)。兔抗棉花倍半萜合成酶多克隆抗體以1∶300稀釋使用，第二抗體為堿性磷酸酶聯(lián)羊抗兔單克隆抗體(購自Promega公司)，以1∶2500稀釋使用。顯色劑為BCIP和NBT(購自Promega公司)。結果見圖9，可以看到轉基因棉花棉籽中杜松烯合成酶Western blotting的特定條帶比未轉基因的較細、較弱，說明在所采用的幾個棉花品種中，轉基因棉花棉籽中杜松烯合成酶含量均大大低于未轉基因棉花的棉籽。實施例8．轉基因棉花的棉毒素含量檢測按文獻(Bell,A.A.Phytopathology.1967,57:759-764)進行。
取0.5g-1.0g植物組織，用液氮充分研磨后轉至5ml離心管中，加入4ml70％丙酮萃取1hr，其間不斷搖動。離心后取2ml上清液加入到2ml棉酚顯色液(2N HCl/1％間苯三酚的乙醇溶液)中，50-55℃溫育5min，用紫外分光光度計(UNICAM)測定555nm的光吸收值。結果見圖10。轉基因棉花的棉籽比未轉基因棉花棉籽中的棉酚含量明顯下降，下降幅度一般在40％左右。而檢測其它組織和器官時，轉基因與未轉基因棉花的棉酚含量無變化。
權利要求
1．一種抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法，其特征在于該方法采用棉花杜松烯合成酶的反義順序。
2．如權利要求1所述的基因工程方法，其特征在于在種子特異啟動子的驅動下，將所述棉花杜松烯合成酶基因cDNA的反義順序導入棉花，產生抑制正常杜松烯合成酶基因表達的反義RNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抑制棉籽中棉毒素形成的基因工程方法,即在種子特異啟動子的驅動下,將杜松烯合成酶基因兩個cDNA(cad1-A和cad1-C)的反義順序導入棉花中,這些反義順序在種子中轉錄后產生反義RNA,抑制正常杜松烯合成酶基因的表達,從而獲得棉籽中的棉毒素含量大幅降低、而其它組織器官中棉毒素含量保持不變的基因工程棉花。該技術方案具有特異性強和效率高的顯著優(yōu)點,在理論研究和實踐生產中具有廣泛的應用前景和實用價值。
文檔編號C12N15/82GK1231338SQ9812287
公開日1999年10月13日 申請日期1998年12月25日 優(yōu)先權日1998年12月25日
發(fā)明者陳曉亞, 周向軍, 賈軍偉, 林芝萍 申請人:中國科學院上海植物生理研究所