一種13KDa大米醇溶蛋白的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種大米醇溶蛋白的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大米蛋白具有低過敏性特點，易于被人體消化吸收。并且大米蛋白具有降血脂、降膽固醇、抗氧化、防肥胖功能，特別是最新研究表明大米蛋白具有預(yù)防糖尿病的功效，因而大米蛋白被認(rèn)為是一種具有高開發(fā)價值的植物蛋白資源，受到了全世界研究者們的關(guān)注。
[0003]醇溶蛋白是大米蛋白的主要貯藏蛋白，分子量主要為10、13、161?&，其中，13^^蛋白是大米醇溶蛋白的主要蛋白體，具有重要的有益健康的生理調(diào)控功能。研究表明，大米醇溶蛋白具有較強吸附膽汁酸等功效，能夠有效預(yù)防高血脂等疾病，并且，由于大米醇溶蛋白的低消化性特征，是糖尿病人群首選的優(yōu)良植物性蛋白。但是截至目前為止，由于13KDa大米醇溶蛋白分離較難，純度較難控制，因此，對高純度13KDa大米醇溶蛋白的提取技術(shù)尚屬缺乏。
[0004]已有的提取技術(shù)表明，提取醇溶蛋白的方法常采用乙醇、丙三醇、丁二醇等溶劑，具有提取率較低，雜帶較多，純度較低，浪費流失較多等弊端，難以推進(jìn)功能性大米醇溶蛋白的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是要解決現(xiàn)有醇溶蛋白的提取方法提取率較低，純度較低，無法大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的問題，提供一種13KDa大米醇溶蛋白的提取方法。
[0006]本發(fā)明13KDa大米醇溶蛋白的提取方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0007]—、將大米用粉碎機研磨成米粉；
[0008]二、將米粉用正己烷脫脂3?5次，得脫脂米粉；
[0009]三、將脫脂米粉用洗脫液浸提3?5次，再將沉淀用純水清洗3?5次；
[0010]四、將步驟三清洗后的沉淀用濃度為60% (v/v)的正丙醇溶液浸提，取上清；
[0011]五、將上清用濃度為10%?12% (w/v)的三氯乙酸溶液將蛋白沉淀；
[0012]六、將步驟五的沉淀真空冷凍干燥，即得到13KDa大米醇溶蛋白。
[0013]本發(fā)明的有益效果:
[0014]本發(fā)明采用正丙醇提取、三氯乙酸沉淀，其優(yōu)點在于能夠?qū)⒋竺状既艿鞍椎闹黧w一13KDa大米醇溶蛋白充分提取出來，且無雜帶、純度較高、無污染、無危害，并且不需要調(diào)pH。
[0015]本發(fā)明的方法簡單、快速、高效，能夠提取高純度13KDa大米醇溶蛋白，其提取的大米醇溶蛋白純度可達(dá)90 %?94 %，大米醇溶蛋白提取率達(dá)95 %?97 %。適于大規(guī)模工業(yè)化提取大米醇溶蛋白。
【附圖說明】
[0016]圖1為實施例1中的蛋白電泳圖。
【具體實施方式】
[0017]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0018]【具體實施方式】一:本實施方式13KDa大米醇溶蛋白的提取方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0019]一、將大米用粉碎機研磨成米粉；
[0020]二、將米粉用正己烷脫脂3?5次，得脫脂米粉；
[0021]三、將脫脂米粉用洗脫液浸提3?5次，再將沉淀用純水清洗3?5次；
[0022]四、將步驟三清洗后的沉淀用濃度為60% (v/v)的正丙醇溶液浸提，取上清；
[0023]五、將上清用濃度為10%?12% (w/v)的三氯乙酸溶液將蛋白沉淀；
[0024]六、將步驟五的沉淀真空冷凍干燥，即得到13KDa大米醇溶蛋白。
[0025]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟一中所述米粉的粒徑為70?90目。其它與【具體實施方式】一相同。
[0026]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟二中將米粉用正己烷脫脂的具體方法為:
[0027]A、將米粉與正己烷按照lg:4?6mL的比例混合，室溫攪拌1小時，靜置1小時，然后于4000rpm離心20min后收集沉淀；
[0028]B、重復(fù)步驟A2?4次，將收集的沉淀于30°C晾干，得到脫脂米粉。其它與【具體實施方式】一相同。
[0029]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟三中將脫脂米粉用洗脫液浸提的具體方法為:
[0030]A、將脫脂米粉與洗脫液按照lg: 10?12mL的比例混合，25°C 130rpm振蕩30min，
離心后去掉上清留下沉淀；
[0031]B、重復(fù)步驟A2?4次，得沉淀。其它與【具體實施方式】一相同。
[0032]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:所述洗脫液為50mM且pH6.5的KH2P04-Na0H緩沖液，其中含有0.5MNaCl和lmMEDTA_2Na。其它與【具體實施方式】一相同。
[0033]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟四中將步驟三清洗后的沉淀用體積分?jǐn)?shù)為60%的正丙醇溶液浸提的具體方法為:
[0034]①將步驟三清洗后的沉淀與體積分?jǐn)?shù)為60%正丙醇溶液按照lg: 10?12mL的比例混合，25°C 130rpm振蕩8h，在4°C 10000g離心20min后，收集上清和沉淀；
[0035]②將步驟①中的沉淀與體積分?jǐn)?shù)為60%正丙醇溶液按照lg: 10?12mL的比例混合，25°C 130rpm振蕩8h，在4°C 10000g離心20min后，收集上清和沉淀；
[0036]③將步驟②中的沉淀與體積分?jǐn)?shù)為60%正丙醇溶液按照lg: 10?12mL的比例混合，25°C 130rpm振蕩4h，在4°C 10000g離心20min后收集上清。其它與【具體實施方式】一相同。
[0037]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟五中將上清用質(zhì)量濃度為10%的三氯乙酸溶液將蛋白沉淀的具體方法為:
[0038]將步驟四收集的上清加入濃度為10% (w/v)的三氯乙酸溶液，上清與三氯乙酸溶液的體積比3:10，震蕩混勻后，避光條件下于0?4°C冰浴反應(yīng)靜置15?20min，然后在4°C 10000g條件下離心20min，棄上清留下沉淀。其它與【具體實施方式】一相同。
[0039]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:步驟六中空冷凍干燥的條件為:真空度< 15Pa，冷阱溫度為-60?-50°C，樣品溫度-30?-20°C，凍干時間為20?24h。其它與【具體實施方式】一相同。
[0040]為驗證本發(fā)明的效果，進(jìn)行以下試驗:
[0041]實施例1:
[0042]本實施例13KDa大米醇溶蛋白的提取方法，按以下步驟進(jìn)行:
[0043]—、將大米用粉碎機研磨成米粉，米粉的粒徑為80目。
[0044]二、將米粉用正己烷脫脂3次，得脫脂米粉，具體方法為:
[0045]A、將米粉與正己烷按照lg:5mL的比例混合，室溫攪拌1小時，靜置1小時，然后于4000rpm離心20min后收集沉淀；
[0046]B、將步驟A收集的沉淀與正己烷按照lg:5mL的比例混合，室溫攪拌1小時，靜置1小時，然后于4000rpm離心20min后收集沉淀；
[0047]C、將步驟B收集的沉淀與正己烷按照lg:5mL的比例混合，室溫攪拌1小時，靜置1小時，然后于4000rpm離心20min后收集沉淀；將收集的沉淀于30°C晾干，得到脫脂米粉。
[0048]將脫脂米粉用洗脫液浸提5次，具體方法為:
[0049]A、將脫脂米粉與洗脫液按照lg: llmL的比例混合，25°C 130rpm振蕩30min，離心后去掉上