專利名稱：L-亮氨酸增進聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)擴增效果的方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增的方法，尤其是一種 L-亮氨酸增進聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增效果的方法及用途。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，又稱體外酶促基因擴增，是一種在體外模擬DNA體內(nèi)復(fù)制的基因擴增技術(shù)，該技術(shù)由K. Mullis于1985年發(fā)明，能在耐熱DNA聚合酶的作用及特異性引物的引導(dǎo)下，在很短的時間里就能在一個試管內(nèi)實現(xiàn)只有在生物體細胞分裂增殖時才出現(xiàn)的基因的大量復(fù)制，一般來說，在數(shù)小時內(nèi)就可以將目的基因擴增至百萬倍。在過去的20多年的時間里，PCR技術(shù)在不斷進步和發(fā)展中逐漸成熟，形成了一整套完整的技術(shù)體系。常規(guī)PCR技術(shù)操作簡便，成功率很高，因而其在遺傳學(xué)、微生物學(xué)、乃至整個生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中都得到了廣泛應(yīng)用。但是PCR技術(shù)仍存在著不可避免的缺點， 如擴增的副反應(yīng)多，擴增產(chǎn)物的產(chǎn)量少，保真度不高等。但對PCR反應(yīng)影響最大的是擴增過程中的副反應(yīng)的發(fā)生，這種情況輕則帶來在PCR產(chǎn)物中出現(xiàn)少量非目的產(chǎn)物，電泳圖上表現(xiàn)為明顯的非目的帶和少量拖尾現(xiàn)象的出現(xiàn)，重則帶來大量的非目的產(chǎn)物出現(xiàn)，在電泳圖上表現(xiàn)為干擾很嚴重的拖尾和大量的彌散，導(dǎo)致主帶模糊或根本無主帶，整個擴增失效。雖然近年來一個又一個功能強大的引物設(shè)計軟件被開發(fā)出來，但高特異性引物只是提高PCR 反應(yīng)效率的一個方面，對反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進行優(yōu)化組合則是解決這一問題的主要方面。根據(jù)多年來各國科學(xué)家的研究成果我們發(fā)現(xiàn)，通過向PCR反應(yīng)體系中添加一定量的添加劑可以在不同程度上減少或消除副反應(yīng)的發(fā)生。這些添加劑包括DMSO，Betain, BSA，甘油，Tween-20, NP-40,甲酰胺等。但這些添加劑都有各自的局限性，在各種不同的情況下效果差異很大，給應(yīng)用帶來不便，因此開發(fā)更多更新的PCR反應(yīng)優(yōu)化劑是發(fā)展PCR技術(shù)過程中一項很重要的工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種L-亮氨酸增進聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增效果的方法及用途，本方法通過在PCR反應(yīng)體系中添加L-亮氨酸達到對 DNA片段的有效擴增。本方法明顯提高了反應(yīng)特異性，應(yīng)用成本低，使用簡便，易于掌握。本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下一種L-亮氨酸增進聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增效果的方法，在PCR反應(yīng)體系中添加L-亮氨酸溶液，L-亮氨酸在PCR反應(yīng)體系中的終濃度為5-15mg/mL。而且，PCR擴增產(chǎn)物大小為100_4000bp。而且，PCR擴增產(chǎn)物GC含量小于70%。而且，PCR的步驟如下(I)L-亮氨酸溶液的配制；
(2) L-亮氨酸溶液的滅菌；(3) PCR體系的配置；(4) PCR體系的優(yōu)化在PCR反應(yīng)體系中添加L-亮氨酸溶液，L-亮氨酸終濃度為 5_15mg/mL ；(5) PCR條件的設(shè)定與運行；(6) PCR 產(chǎn)物檢測。而且，所述L-亮氨酸溶液包括L_亮氨酸完全溶解于純水、10XPCR緩沖液或者適用于PCR反應(yīng)的液相。L-亮氨酸作為提高聚合酶鏈式反應(yīng)效率試劑的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果是1、本發(fā)明作為PCR增效劑的新成果，與已有方法相比，L-亮氨酸優(yōu)化擴增的效果明顯，明顯提高了 PCR擴增的特異性，且L-亮氨酸較為低廉的價格使得其應(yīng)用沒有增加很多成本。2、本發(fā)明中使用的PCR優(yōu)化試劑L-亮氨酸，添加到體系中基本不影響PCR反應(yīng)后的一般后續(xù)操作如電泳分離DNA產(chǎn)物。3、本發(fā)明提供的L-亮氨酸提高聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增效果的優(yōu)化方法易于掌握，使用簡便。


圖1為本發(fā)明中利用L-亮氨酸優(yōu)化擴增片段長度為IOOObp左右的非高GC-DNA 片段的結(jié)果電泳圖，與不添加L-亮氨酸的反應(yīng)相對比，20對引物擴增結(jié)果。上半為沒有添加L-亮氨酸的擴增效果圖，下半為對應(yīng)的添加L-亮氨酸的擴增效果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方案對本發(fā)明進一步說明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容，不能以下述舉例說明來限定本發(fā)明的保護范圍。鑒于PCR反應(yīng)本身是一種模擬體內(nèi)DNA復(fù)制的體外擴增方法，因此在本發(fā)明的摸索過程中，試圖從模擬細胞核內(nèi)環(huán)境出發(fā)，尋找參與釀酒酵母細胞代謝的核內(nèi)小分子，并設(shè)計將這些核內(nèi)小分子以接近核內(nèi)濃度的條件下添加入PCR反應(yīng)體系中，以期獲得更為有效的PCR添加劑。L-亮氨酸就是通過這個思路被我們發(fā)現(xiàn)有明顯增進PCR反應(yīng)特異性的作用。一、本發(fā)明所涉及的PCR技術(shù)的優(yōu)化方法是通過向PCR體系中添加L-亮氨酸來實現(xiàn)的，其具體操作方法如下1、L-亮氨酸(L-Leucine)溶液的制備L-亮氨酸又稱白氨酸，化學(xué)名為a—氨基異己酸，是常見十八種氨基酸中的一種， 也是人體八種必需氨基酸之一，由于L 一亮氨酸的分子結(jié)構(gòu)中含有一個甲基側(cè)鏈而被稱為支鏈氨基酸。L 一亮氨酸分子式為C6H1302N，相對分子量131. 18。白色結(jié)晶或結(jié)晶粉末，是一種非極性氨基酸，味微苦，溶于水，20°C、25°C時溶解度分別為23. 7g/L和24. 26g/ L，加熱到145"r 148 °C時升華，293-295 °C時分解，比重1. 29 (180C)，比旋光度[a]D20為+14. 5"-+16.0(6mol/L HCl, C= 1)，等電點5. 98。L-亮氨酸固體粉末可以用市售產(chǎn)品，屬于現(xiàn)有技術(shù)，不再詳細敘述。所述的L-亮氨酸溶液的濃度為可以根據(jù)需要配置不同濃度大小的溶液，濃度的單位為質(zhì)量體積比(W/V)，范圍在10-50mg/mL。一般推薦濃度為IOmg/ mL。以配置濃度為(W/V)10mg/mL的L-亮氨酸溶液為例，先精確稱取IOmg L-亮氨酸粉末， 置于已滅菌的1. 5mL的小離心管中，用移液器緩慢加入滅菌水，使其溶解，最后定容至lmL。2、L-亮氨酸溶液的滅菌溶液均需用高溫滅菌(12rC，30min)。3、PCR體系的配置PCR體系根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)，由待擴增DNA片斷的不同而各不相同。具體表現(xiàn)在 dNTP、模板、Mg2+、引物的添加量應(yīng)根據(jù)不同的模板和不同的擴增片段長度來選擇；PCR反應(yīng)體系中的H2O為雙蒸水及以上級別水，體系中水的添加量應(yīng)根據(jù)L-亮氨酸溶液添加的體積進行調(diào)整，即應(yīng)扣除相應(yīng)添加的L-亮氨酸溶液的體積。4、PCR體系的優(yōu)化在上述PCR反應(yīng)體系中加入一定體積的L-亮氨酸溶液。5、PCR條件的設(shè)定與運行PCR反應(yīng)條件中的預(yù)變性，變性及退火各階段的溫度和對應(yīng)時間應(yīng)根據(jù)不同模板和引物融解溫度來選擇；其中的延伸溫度根據(jù)所用聚合酶的合適溫度來選擇；其中的延伸時間根據(jù)所擴增片段的長度來選擇；其中的循環(huán)次數(shù)根據(jù)個人試驗?zāi)康暮托枰M行選擇。6、PCR產(chǎn)物的檢測一般用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進行檢測，瓊脂糖凝膠的濃度及PCR產(chǎn)物的上樣體積需根據(jù)具體情況而定。所述的瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)依照已有方法概括如下(1)制備所需要濃度的瓊脂糖凝膠，具體濃度大小應(yīng)根據(jù)擴增DNA片段的大小來確定。(2)吸取一定體積的PCR產(chǎn)物上電泳槽點樣，同時點上合適分子量標記作為參照。(3)加上3 4V/cm的電壓進行電泳。(4)待指示劑到合適位置時，取出膠板于凝膠成象系統(tǒng)下觀察并照相記錄。二、具體PCR擴增實例L_亮氨酸對一組PCR反應(yīng)的增效作用；1、L-亮氨酸溶液配制10mg/ml ；2、L-亮氨酸溶液滅菌高溫滅菌(12rC，30min)；3、PCR反應(yīng)體系的配置按以下順序和添加量配置體系于薄壁PCR管中。
權(quán)利要求
1.一種L-亮氨酸增進聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增效果的方法，其特征在于在PCR反應(yīng)體系中添加L-亮氨酸溶液，L-亮氨酸在PCR反應(yīng)體系中的終濃度為5-15mg/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-亮氨酸增進聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增效果的方法，其特征在于PCR擴增產(chǎn)物大小為100-4000bp。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-亮氨酸增進聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增效果的方法，其特征在于PCR擴增產(chǎn)物GC含量小于70%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-亮氨酸增進聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增效果的方法，其特征在于PCR的步驟如下(1)L-亮氨酸溶液的配制；(2)L-亮氨酸溶液的滅菌；(3)PCR體系的配置；(4)PCR體系的優(yōu)化在PCR反應(yīng)體系中添加L-亮氨酸溶液，L-亮氨酸終濃度為 5_15mg/mL ；(5)PCR條件的設(shè)定與運行；(6)PCR產(chǎn)物檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的L-亮氨酸增進聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增效果的方法，其特征在于所述L-亮氨酸溶液包括L-亮氨酸完全溶解于純水、10XPCR緩沖液或者適用于 PCR反應(yīng)的液相。
6.L-亮氨酸作為提高聚合酶鏈式反應(yīng)效率試劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種L-亮氨酸增進聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增效果的方法及用途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，本方法是在原有的PCR擴增方法基礎(chǔ)上，通過向體系中添加一定量的L-亮氨酸來實現(xiàn)的。本發(fā)明優(yōu)化擴增的效果明顯，操作簡便，易于掌握。本發(fā)明作為PCR增效劑的新成果，與已有方法相比，L-亮氨酸優(yōu)化擴增的效果明顯，提高了PCR擴增的特異性，且L-亮氨酸較為低廉的價格使得其應(yīng)用沒有增加很多成本。
文檔編號C12N15/10GK102286469SQ20111025655
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者呂志偉, 張治洲, 桑付明, 王有志, 趙鶴翔 申請人:山東大正醫(yī)療器械股份有限公司