專利名稱：融合蛋白SAmB及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與預(yù)防和/或治療產(chǎn)志賀毒素病原菌感染相關(guān)的融合蛋白SAmB及其 編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicE. coli, EHEC)0157:H7 感染是一種新發(fā) 的食物源性傳染病，是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。EHEC 0157:H7感染主要引起嬰幼兒腹 瀉、出血性結(jié)腸炎(hemorrhagic colitis, HC)和溶血性尿毒綜合癥(hemolytic uremic syndrome, HUS) ^ifil^tiifil(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP) 等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。自1982年EHEC 0157 :H7首次在美國(guó)暴發(fā)以來(lái)，在日本、 美國(guó)、英國(guó)、加拿大、澳大利亞等國(guó)屢有暴發(fā)，尤其是在1996年5 8月間，我國(guó)自1986年 徐州首次報(bào)道EHEC 0157:H7感染以來(lái)，福建、甘肅、浙江、安徽等省市先后自人畜以及其它 動(dòng)物中分離出EHEC 0157:H7大腸桿菌。江蘇和安徽于2001年發(fā)生了 EHEC 0157:H7感染 性腹瀉暴發(fā)流行，患者超過(guò)2萬(wàn)例，死亡177例。EHEC 0157:H7的感染具有暴發(fā)流行趨勢(shì)、強(qiáng)烈的致病性與致死性，以及抗生素治 療可能會(huì)加劇病情等特點(diǎn)，已經(jīng)引起世界各國(guó)衛(wèi)生工作者及科學(xué)家的關(guān)注。對(duì)EHEC0157:H7 感染的自然史研究表明，這些感染可激發(fā)免疫力，這在下列事實(shí)中可得到反映，即EHEC 0157:H7腹瀉發(fā)生率隨年齡增大而降低，有癥狀與無(wú)癥狀EHEC感染比率隨年齡增大而降 低，最初的EHEC 0157:H7感染與嗣后具有類似毒素和定居因子表型的感染之間的保護(hù)關(guān) 系。目前還沒(méi)有人用EHEC 0157:H7疫苗問(wèn)世，但有很多候選疫苗正在研制中，包括黏附相關(guān) 因子、毒素和溶血素等組分的全分子或部分結(jié)構(gòu)是目前最重要的保護(hù)性抗原的篩選目標(biāo)。毒素Stxs家族主要包括在免疫學(xué)上沒(méi)有交叉反應(yīng)的兩個(gè)毒素，分別為1、2型 Stx (Stxl、Stx2)。一株EHEC 0157 :H7可以只表達(dá)Stxl或Stx2，也可以同時(shí)表達(dá)Stxl和 Stx2。雖然Stxl與Stx2的抗原性不同，但兩種毒素的分子結(jié)構(gòu)、受體相同，毒性機(jī)理相似， 均由1個(gè)A亞單位和5個(gè)B亞單位組成，A亞單位具有細(xì)胞內(nèi)毒性，能與28SrRNA作用導(dǎo)致 蛋白質(zhì)合成停止，是EHEC 0157:H7引起臨床表現(xiàn)的病理基礎(chǔ)；B亞單位具有細(xì)胞結(jié)合特性， 能與具有特定受體，即球丙糖?；拾贝?globotriaos-ylceramide，Gb3)或球丁糖?；?鞘氨醇(globotatrasylceramide，Gb4)的細(xì)胞結(jié)合，從而引導(dǎo)A亞單位酶活性發(fā)揮作用。 多數(shù)EHEC 0157:H7至少含有Stx2，且Stx2毒性強(qiáng)于Stxl。臨床研究資料表明，Stx與HUS 及TTP等感染嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)，是大腸桿菌0157等病原菌重癥感染致嚴(yán)重腎損 傷甚至死亡的重要原因。Stx的B亞基是一種保護(hù)性抗原，具有有效的抗原表位。Boyd等用純化的StxlB 亞基或B亞基的合成片段免疫家兔，可保護(hù)家兔抵抗致死劑量Stxl的攻擊。Marcato P等 研究表明Stx2B對(duì)Vero細(xì)胞無(wú)毒性，也不會(huì)引起伯吉特淋巴瘤細(xì)胞(Burkitt’ slymphoma cells)凋亡，免疫兔產(chǎn)生的抗Stx2B特異抗體能抵抗致死劑量Stx2毒素的攻擊。發(fā)明人所 在的研究小組前期研究也證實(shí)(包士中等，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2008 ；Gao et al, Vaccine
32009)，克隆表達(dá)的Stxs的B亞單位及其多肽片段無(wú)毒，且具有良好的免疫保護(hù)性，針對(duì) StxlB和Stx2B的多克隆抗體具有阻斷毒素活性的作用，但以上抗體都無(wú)法提供針對(duì)雙產(chǎn) 毒株的保護(hù)效果。前期以StxlB、Stx2B為基礎(chǔ)構(gòu)建的融合蛋白Stx2B-StxlB (簡(jiǎn)稱2S)，雖 然可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生分別針對(duì)1、2型志賀毒素的免疫抗體，但中和抗體滴度出現(xiàn)型差別，針 對(duì)2型志賀毒素的中和滴度相對(duì)低，表現(xiàn)為當(dāng)攻毒細(xì)菌(裂解物)由致死劑量進(jìn)一步提高 時(shí)，免疫動(dòng)物的保護(hù)率下降。因此，為了改善目前針對(duì)雙型毒素的免疫保護(hù)水平，本發(fā)明意 在選擇更為有效的新的保護(hù)性抗原組分構(gòu)建新的融合蛋白，有望發(fā)展成一種具有更好保護(hù) 效果的新型疫苗。實(shí)驗(yàn)表明，Stx2的A亞基的滅活抗原可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度抗體，是一種良好 的免疫原。曾有文獻(xiàn)報(bào)道了相關(guān)研究(0，Brien et al，Vaccine，2006)，通過(guò)將Stx2的A 亞基的酶活性相關(guān)位點(diǎn)Tyr77 (Ser77)，Glul67 (Glnl67)，Argl70 (Lysl70)采用定點(diǎn)突變技 術(shù)進(jìn)行滅活，構(gòu)建Stx2突變株，制備的重組類毒素在Hela細(xì)胞模型上不再具有天然毒素 的細(xì)胞毒性，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度免疫抗體或中和抗體。但是這種重組類毒素模擬天 然毒素結(jié)構(gòu)(ΙΑ: 5B)，包括1個(gè)A亞單位和5個(gè)B亞單位，因?yàn)橹亟M表達(dá)過(guò)程中需要結(jié)構(gòu)組 裝，制備存在技術(shù)難度，工藝不易放大，而且蛋白不穩(wěn)定，不易保存，這為其進(jìn)一步應(yīng)用帶來(lái) 了限制。另外，已有文獻(xiàn)報(bào)道(Nacilla H et al. Int Immunol 2003 ；Nacilla H et al. J Immunol 2000), StxB是有效的生物佐劑，具有免疫增效作用，可以作為分子內(nèi)佐劑提高新 型融合蛋白的免疫效應(yīng)，獲得更好的保護(hù)效果。到目前為止，對(duì)大腸桿菌0157感染，仍需要 更為安全有效、保護(hù)范圍更廣的疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種融合蛋白。本發(fā)明提供的融合蛋白，命名為SAmB，包括處于N端的II型志賀毒素的A亞單位 突變體蛋白和處于C端的I型志賀毒素的B亞單位蛋白；上述II型志賀毒素的A亞單位突變體蛋白是將II型志賀毒素的A亞單位蛋白的 活性位點(diǎn)氨基酸殘基進(jìn)行突變的蛋白。進(jìn)一步，上述活性位點(diǎn)氨基酸殘基是所述II型志賀毒素的A亞單位蛋白的第77、 167和170位三個(gè)位點(diǎn)氨基酸；所述II型志賀毒素的A亞單位蛋白的氨基酸序列如序列表 中序列5所示。 具體地講，上述II型志賀毒素的A亞單位突變體蛋白的氨基酸序列如序列表中序 列4的第1-297所示；所述I型志賀毒素的B亞單位蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4 的第303-371所示。進(jìn)一步講，上述融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。任一上述的融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述編碼基因具體可以是如下1) _3)1)其編碼序列是序列表中的序列3 ；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼上述的融合蛋白的基因；3)與1)的基因具有90%以上的同源性且編碼上述的融合蛋白的基因。含有上述基因的重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之
4內(nèi)。上述重組載體是將上述基因插入pEASYE2質(zhì)粒的拓?fù)洚悩?gòu)位點(diǎn)中構(gòu)成的重組表 達(dá)載體；所述重組菌是重組大腸桿菌或重組酵母菌。上述的融合蛋白或上述基因在制備預(yù)防和/或治療由志賀毒素或產(chǎn)志賀毒素的 病原菌所引起疾病的藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。進(jìn)一步，上述產(chǎn)志賀毒素病原細(xì)菌可以是EHEC 0157:H7。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明提供的融合蛋白SAmB具有良好的免疫反應(yīng)性，SAmB免疫組小鼠 的抗-StxlB和抗-Stx2A抗體效價(jià)水平均高于2S免疫組小鼠(對(duì)照組)，SAmB末次免疫后 的第14天免疫血清針對(duì)0157:H7裂解菌上清、Stxl和Stx2均產(chǎn)生了特異的中和抗體，其中 Stx2的中和效價(jià)顯著高于2S免疫組。動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高致死劑量EHEC 0157:H7裂解 菌攻擊下，SAmB免疫組93. 3%小鼠全部顯示被保護(hù)(14/15)，而安慰免疫組(PBS) 15只小 鼠全部死亡(0/15)，2S免疫組只有26.7%小鼠存活(4/15)；高致死劑量Stxl毒素攻擊下， SAmB免疫組保護(hù)率為100% ；高致死劑量Stx2毒素攻擊下，SAmB免疫組保護(hù)率為93. 3% ； 高致死劑量Stxl和Stx2毒素同時(shí)攻擊下，SAmB免疫組保護(hù)率為80%。


圖1為重組工程菌pSAmB/E. coli TransB (DE3)的PCR鑒定電泳圖，其中泳道1為 SAmB基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道M為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)DL2000。圖2為重組SAmB在原核系統(tǒng)中表達(dá)產(chǎn)物、純化產(chǎn)物的SDS-PAGE圖與免疫印跡圖， 其中泳道1和3為未誘導(dǎo)菌裂解物；2.誘導(dǎo)菌裂解上清；4.裂解菌沉淀物；5.低分子量蛋 白標(biāo)準(zhǔn)；6. SAmB純化產(chǎn)物；7和8為SAmB純化產(chǎn)物與雞抗StxlB多抗、兔抗Stx2A血清分別 進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。圖3為末次免疫后14天的免疫小鼠血清抗體效價(jià)檢測(cè)，其中檢測(cè)用抗原分別為 Stxl和Stx2，圖示為小鼠免疫分組，圖中黑色表示免疫原為SAmB、空白表示免疫原為2S、格 紋表示免疫原為PBS ；圖中縱坐標(biāo)表示以2為底的血清抗體的ELISA效價(jià)的對(duì)數(shù)值，橫坐標(biāo) 為免疫血清抗體類別IgA或IgG。安慰免疫組小鼠血清IgG、IgA效價(jià)很低(< 2)，而蛋白免 疫組效價(jià)均較高。圖中標(biāo)注的*代表與PBS安慰免疫組比較，P < 0. 01，**代表P < 0. 01， # 代表 P > 0. 05, ## 代表 P < 0. 05。圖4為針對(duì)0157:H7 88321裂解菌上清、Stxl、Stx2的免疫血清中和效價(jià)測(cè)定，其 中每個(gè)數(shù)值為3份血清混合后測(cè)定，圖中縱坐標(biāo)表示以10為底的中和效價(jià)的對(duì)數(shù)值；圖中 標(biāo)注的*代表與PBS安慰免疫組比較，P < 0.01,**代表P < 0. 01，#代表P > 0. 05 ；實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，SAmB免疫血清能更好的中和Stx2，相比2S(102 8)提供更高的中和效價(jià)(103 4)。圖5為免疫小鼠細(xì)菌攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中A圖所示為對(duì)免疫小鼠進(jìn)行10LD50 劑量0157:H7產(chǎn)毒株裂解菌攻毒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；B圖所示為對(duì)免疫小鼠進(jìn)行10LD50Stxl或 10LD50Stx2U0LD50Stxl和10LD50Stx2劑量混合攻毒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果?？v坐標(biāo)表示攻毒實(shí)驗(yàn)中 每組小鼠的只數(shù)，橫坐標(biāo)表示自攻毒之日(第0天)起計(jì)算的天數(shù)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。
下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、重組融合蛋白SAmB的構(gòu)建、表達(dá)與純化本發(fā)明所用菌株和質(zhì)粒如下表1所示；本發(fā)明所用引物如下表2所示。Ni親和層 析柱HisTRAP FFTM及AKTA FPLC純化系統(tǒng)為GE公司產(chǎn)品。表1.實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌菌株，質(zhì)粒
權(quán)利要求
一種融合蛋白，包括處于N端的II型志賀毒素的A亞單位突變體蛋白和處于C端的I型志賀毒素的B亞單位蛋白；所述II型志賀毒素的A亞單位突變體蛋白是將II型志賀毒素的A亞單位蛋白的活性位點(diǎn)氨基酸殘基進(jìn)行突變的蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述活性位點(diǎn)氨基酸殘基是所述II型 志賀毒素的A亞單位蛋白的第77、167和170位三個(gè)位點(diǎn)氨基酸；所述II型志賀毒素的A 亞單位蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
3.如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于所述II型志賀毒素的A亞單位突 變體蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4的第1-297所示；所述I型志賀毒素的B亞單位 蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4的第303-371所示。
4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白的氨基酸序列 如序列表中序列4所示。
5.權(quán)利要求1-4中任一所述的融合蛋白的編碼基因。
6.如權(quán)利要求5所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因是如下1)-3)1)其編碼序列是序列表中的序列3；2)在嚴(yán)格條件下與1)的基因雜交且編碼權(quán)利要求1-4中任一所述的融合蛋白的基因；3)與1)的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1-4中任一所述的融合蛋白的基因。
7.含有權(quán)利要求5或6所述基因的重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
8.如權(quán)利要求7所述的重組載體或重組菌，其特征在于所述重組載體是將權(quán)利要求5 或6所述基因插入PEASYE2質(zhì)粒的拓?fù)洚悩?gòu)位點(diǎn)中構(gòu)成的重組表達(dá)載體；所述重組菌是重 組大腸桿菌或重組酵母菌。
9.權(quán)利要求1-4中任一所述的融合蛋白或權(quán)利要求5或6所述基因在制備預(yù)防和/或 治療由志賀毒素或產(chǎn)志賀毒素的病原菌所引起疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)志賀毒素病原細(xì)菌是 EHEC0157:H7。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種融合蛋白SAmB及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的融合蛋白，命名為SAmB，包括處于N端的II型志賀毒素的A亞單位突變體蛋白和處于C端的I型志賀毒素的B亞單位蛋白；上述II型志賀毒素的A亞單位突變體蛋白是將II型志賀毒素的A亞單位蛋白的活性位點(diǎn)氨基酸殘基進(jìn)行突變的蛋白。本發(fā)明提供的融合蛋白SAmB可做成藥物，用以預(yù)防和/或治療產(chǎn)志賀毒素病原細(xì)菌感染或感染并發(fā)癥。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101948546SQ20101029047
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月25日
發(fā)明者侯曉軍, 李濤, 王慧, 王琴, 蔡昆, 高翔 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所