專利名稱：一種天然植物來源的總黃酮的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種天然植物來源的總黃酮的制備方法。
背景技術(shù)：
天然黃酮類化合物是一類廣泛存在于植物界的重要的生物活性物質(zhì)，廣泛存在于不同科屬植物中，主要存在于蕓香料、唇形科、豆科、傘形科、銀杏科與菊科中。據(jù)研究，約有 20%的中草藥中含有黃酮類化合物，可見其資源之豐富。黃酮類化合物可以直接從食物中獲得，也可以從富含黃酮類化合物的植物中提取，它不僅能作為防治心腦血管疾病的藥物， 而且有明顯的抗脂質(zhì)過氧化、抗衰老、清除自由基，降血脂、降低膽固醇、降血糖，抗癌防癌、 免疫調(diào)節(jié)等生理活性，是一種在人類的營養(yǎng)、健康和老年退行性疾病的防治上有著廣闊應(yīng)用前景的藥物，也是應(yīng)用前景廣泛的天然抗氧劑，防腐劑，可用于研制多種保健食品和化妝品。因此具有很好的開發(fā)應(yīng)用價值。近年來從天然植物中提取黃酮類化合物的方法多采用常規(guī)的超聲提取法、回流提取法、冷浸提取法及滲漉提取法。這些方法同時具有溶劑用量大、提取時間長、操作麻煩、工作效率較低等缺點。而分離富集黃酮類成分多采用大孔樹脂柱色譜，選用不同性能規(guī)格的樹脂填料，以不同比例的含水溶劑梯度洗脫的方法。采用這些方法同樣存在操作步驟較多、 收率低，生產(chǎn)成本較高的缺點，尤其是提取純化過程中的加熱濃縮環(huán)節(jié)較多，容易造成有效成分破壞或流失，總黃酮的提取率及轉(zhuǎn)移率不高，同時黃酮提取物中常含有一些重金屬雜質(zhì)，且往往超標。紅花芒毛苣苔為苦苣苔科芒毛苣苔屬植物Aeschynanthus moningeriae (Merr.)，生于山谷林中或溪邊石上，海拔800-1200米，為海南特有植物。據(jù)文獻報道，苦苣苔科植物在全世界有120 140個屬，在我國有M個屬，其中藥用植物有100多種。該科植物中所含的化學成分主要為黃酮類、苯乙醇類、醌類和萜類等，具有顯著的抑菌、抗氧化、、 抗病毒、抗炎、祛痰止咳等作用，但對芒毛苣苔屬植物一紅花芒毛苣苔的研究，無論是基礎(chǔ)還是開發(fā)應(yīng)用研究均未見有報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種天然植物來源的總黃酮的制備方法的技術(shù)方案，其工藝簡單、提取濃縮技術(shù)先進、操作方便、成本低，綠色高效，總黃酮提取物收率高。所述的一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，其特征在于包括以下步驟
1)原料處理將紅花芒毛苣苔藥材切成1 2cm的小段；
2)破碎提取將切段的藥材放入破碎提取容器中，每次用50% 80%的含水乙醇做溶劑破碎提取1-2次，若藥材重量為Ikg則含水乙醇的用量為6 10升，破碎提取時間每次 2 5 min，抽濾，合并濾液；
3)閃蒸濃縮將濾液在水浴溫度60°C 90°C，真空度為0.090 Mpa -0. 095Mpa，進液流速為200 350 mL · HiirT1的條件下進行真空薄膜濃縮，回收乙醇，得到濃縮液，ImL濃縮液含lg-2g藥材；
4)大孔樹脂純化將得到的濃縮液通過大孔吸附樹脂分離富集，色譜柱的徑高比為 1 10 1 15，先用H2O洗脫，再依次用10% 80%含水乙醇進行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，洗脫流速為5 15 mL ^irT1,分別收集4倍柱體積的各部位洗脫液，收集合并20% 70% 含水乙醇各部位的洗脫液，將合并的洗脫液在50°C 80°C、真空度為0. 090 Mpa 0. 095 Mpa、進液流速為250 350 mL · mirT1的條件下進行真空薄膜濃縮、干燥，即得紅花芒毛苣苔總黃酮提取物干粉。所述的一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，其特征在于步驟2)中含水乙醇的濃度為55% 75%，優(yōu)選60% 70% ；破碎提取時間每次3 4 min。所述的一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，其特征在于步驟3)中水浴溫度為651 851，優(yōu)選70°C 80°C ；進液流速為230 320 mL · mirT1，優(yōu)選250 300 mL · mirT1。所述的一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，其特征在于步驟4)中色譜柱的徑高比為1:12 1:13 ；洗脫流速為8 13 mL ^irT1,優(yōu)選洗脫流速為10 12 mL -min"1 ； 真空薄膜濃縮的溫度為65°C 70°C，進液流速為280 300 mL · mirT1。所述的一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，其特征在于步驟4)中先用H2O 洗脫，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙醇、75%含水乙醇進行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，分別收集4倍柱體積的各部位洗脫液，收集合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脫液，將合并的洗脫液真空薄膜濃縮、干
O所述的一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，其特征在于步驟4)中先用H2O 洗脫，再依次用10%含水乙醇、30%含水乙醇、50%含水乙醇、70%含水乙醇進行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，分別收集4倍柱體積的各部位洗脫液，收集合并30%含水乙醇、50%含水乙醇、70%含水乙醇各部位的洗脫液，將合并的洗脫液真空薄膜濃縮、干燥。所述的大孔吸附樹脂為Diaion HP-20大孔吸附樹脂。上述一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，具有以下有益效果
1.對紅花芒毛苣苔采用含水乙醇破碎提取，通過高速攪拌、振動、混合、滲透、浸漬的結(jié)合作用，使原料中的成分在極短的時間內(nèi)從植物組織中溶出，實現(xiàn)了粉碎和提取過程的同時完成。同時室溫提取避免熱敏性成分破壞，具有提取快速、完全、高效節(jié)能，操作簡便、工作效率較高等優(yōu)勢，提高了總黃酮的提取率。提取液采用真空閃蒸濃縮，具有濃縮液受熱溫度低、受熱時間短、有效保護熱敏性成分不被破壞，濃縮速度快、效率高，操作簡單、使用方便、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)勢。2.該制備方法工藝簡單、提取濃縮技術(shù)先進、操作方便、成本低，綠色高效，總黃酮提取物收率高。采用紫外分光光度法測定所得到的總黃酮提取物，提取物中總黃酮的含量為32. 27% 43. 69，總黃酮的提取率為8. 56% 13. 56%，總黃酮的轉(zhuǎn)移率高達72. 33% 84. 45%。經(jīng)初步體外生物活性試驗表明，紅花芒毛苣苔總黃酮提取物具有一定的抗菌、抗氧化活性，可用作食品添加劑、抗氧劑、防腐劑、藥物原料等。因此具有很好的開發(fā)應(yīng)用價值。3.通過ICP-MS法測定總黃酮提取物中重金屬的含量，發(fā)現(xiàn)制得的紅花芒毛苣苔總黃酮中重金屬含量很低，完全符合《藥用植物及其制劑進出口綠色行業(yè)標準》的標準。4.紅花芒毛苣苔總黃酮外觀為淺黃色無定型粉末，將其少量用含水乙醇溶解后進行化學試管反應(yīng)表明，遇三氯化鐵-鐵氰化鉀試劑顯藍色，與鹽酸-鎂粉試劑反應(yīng)顯粉紅色。經(jīng)初步體外活性試驗表明，紅花芒毛苣苔總黃酮具有一定的抗菌及抗氧化活性，因此具有很好的開發(fā)應(yīng)用價值。本申請文件中涉及的百分含量除另有說明外，液體的百分含量為體積比，固體的
百分含量為重量比。


圖1為5-羥基-7，4' -二甲氧基黃酮的核磁共振氫譜圖； 圖2為5-羥基-7，4' -二甲氧基黃酮的核磁共振碳譜圖1、圖2中橫坐標代表化學位移。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1
1)原料處理將紅花芒毛苣苔藥材切成Icrn的小段；
2)破碎提取將切段的藥材放入破碎提取容器中，每次用60%的含水乙醇做溶劑破碎提取2次，若藥材重量為Ikg則含水乙醇的用量為8升，破碎提取時間每次3 min，抽濾，合并濾液；
3)閃蒸濃縮將濾液在水浴溫度70°C，真空度為0.095Mpa，進液流速為250mL · mirT1 的條件下進行真空薄膜濃縮，回收乙醇，得到濃縮液，ImL濃縮液含2g藥材；
4)大孔樹脂純化將得到的濃縮液通過DiaionHP-20大孔吸附樹脂分離富集，色譜柱的徑高比為1 12，先用H2O洗脫，再依次用10%含水乙醇、30%含水乙醇、50%含水乙醇、70% 含水乙醇進行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，洗脫流速為IOmL mirT1，分別收集4倍柱體積的各部位洗脫液，收集合并30%含水乙醇、50%含水乙醇和70%含水乙醇各部位的洗脫液， 將合并的洗脫液在70°C、真空度為0. 095 Mpa、進液流速為300mL ^irT1的條件下進行真空薄膜濃縮、干燥，即得紅花芒毛苣苔總黃酮提取物干粉。在本發(fā)明所述的工藝方法中
步驟1)中將紅花芒毛苣苔藥材切成1. 5,1. 8,2. Ocm的小段；
步驟2)中每次含水乙醇濃度為50%,65^^70%或80%，破碎提取1次，若藥材重量為 Ikg則含水乙醇的用量為6升、7升、9升或10升，破碎提取時間每次2 mindmin或5 min ； 步驟3)中閃蒸濃縮的水浴溫度60°〇、751、801或901，真空度為0. 090 Mpa，進液流速為 200 mL ‘ min"\280 mL · mirT1、300 mL · mirT1 或 350 mL · mirT1，ImL 濃縮液含 1. 0g、 1. 5g藥材；
步驟4)中色譜柱的徑高比為1:10、1:13或1:15，洗脫流速為5 HiI^mirT1A mL -min"1, 12 mL · min"1或15 mL · min"1 ；真空薄膜濃縮的溫度為60°C、65°C、75°C或80°C ；進液流速為 250mL · mirT1、280 mL · min"\320 mL · mirT1 或；350 mL · mirT1。先用 H2O 洗脫，再依次用 10%含水乙醇、25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、65%含水乙醇、80%含水乙醇進行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，分別收集4倍柱體積的各部位洗脫液，收集合并25%含水乙醇、35%含水乙醇、45%含水乙醇、65%含水乙醇各部位的洗脫液，將合并的洗脫液真空薄膜濃縮、干燥。或者先用H2O洗脫，再依次用10%含水乙醇、30%含水乙醇、55%含水乙醇、60% 含水乙醇、70%含水乙醇、80%含水乙醇進行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，分別收集4倍柱體積的各部位洗脫液，收集合并30%含水乙醇、55%含水乙醇、60%含水乙醇和70%含水乙醇各部位的洗脫液，將合并的洗脫液真空薄膜濃縮、干燥。其它同實施例1，也能取得本發(fā)明所述的有益效果。以下通過相應(yīng)的試驗對通過本發(fā)明制備的總黃酮提取物進行總黃酮的含量測定及重金屬元素的含量測定，同時進行體外抗菌及抗氧化活性試驗。試驗1 紅花芒毛苣苔提取物中總黃酮的含量測定
測定條件UV-2102PCS紫外可見分光光度計(上海龍尼柯儀器有限公司)；蘆丁對照品 (中國藥品生物制品檢定所提供)，蘆丁的最大吸收波長510 nm。標準曲線的繪制準確稱取干燥恒重的蘆丁對照品17. 75 mg,加入70%乙醇溶解并定容至100 mL的量瓶中，搖勻得濃度為0. 1775 mg · mL—1的對照品溶液。分別取上述蘆丁標準溶液0，0. 5，1. 5，2. 5，3. 5，4. 5 ml于6只10 mL量瓶中，用70%乙醇補充至5 mL，各加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻，放置5 min后再各加入10%硝酸鋁0. 4 mL，搖勻。5 min后再加入1 mol · L—1的氫氧化鈉溶液4 mL，混勻，用70%乙醇稀釋至刻度。10 min后于510 nm 處測吸光度，試劑為空白參比，以蘆丁質(zhì)量濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標繪制標準曲線， 用最小二乘法進行線性回歸，得蘆丁含量與吸光度之間的回歸方程A=O. 0057C-0. 0266, R2=O. 9990。樣品的含量測定精密稱定干燥的紅花芒毛苣苔提取物干粉(實施例1)適量，用 70%乙醇溶解并定容至25 mL量瓶中。吸取一定量的上述溶液于10 mL量瓶中，添加70% 乙醇溶液使體積約為5 mL，按照上述繪制蘆丁標準曲線的方法，依次加入亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉溶液，混勻，用70%乙醇稀釋至刻度。靜置20 min后測定吸光度。重復(fù)3次測定，并根據(jù)標準曲線換算出樣品中總黃酮的含量，計算出紅花芒毛苣苔提取物中總黃酮的平均含量為32. 27% 43. 69%，總黃酮的提取率為8. 56% 13. 56%，總黃酮的轉(zhuǎn)移率高達 72. 33% 84. 45%ο經(jīng)系統(tǒng)提取分離，從紅花芒毛苣苔70%乙醇提取物的不同萃取部位得到了若干個黃酮單體，經(jīng)過理化鑒別及光譜技術(shù)鑒定了它們的結(jié)構(gòu)。其中在乙酸乙酯萃取部位分離鑒定出的5-羥基_7，4' - 二甲氧基黃酮的量非常大。經(jīng)HPLC含量測定，紅花芒毛苣苔總黃酮提取物中5-羥基-7，4' -二甲氧基黃酮的含量達16. 37%，該化合物可以作為生產(chǎn)藥物的原料。試驗2 紅花芒毛苣苔總黃酮提取物中重金屬元素的含量測定
(1)儀器與工作參數(shù)采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定紅花芒毛苣苔總黃酮提取物中重金屬元素的含量。X-Series型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國熱電公司)； MARS-5型微波消解儀(美國CEM公司)，附RTP-300 Plus溫控；MiIli-Q Academic超純水處理器(美國Millipore公司)。硝酸為優(yōu)級純，其他試劑均為分析純。儀器工作參數(shù)如下表。ICP-MS工作參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)原料處理將紅花芒毛苣苔藥材切成1 2cm的小段；2)破碎提取將切段的藥材放入破碎提取容器中，每次用50% 80%的含水乙醇做溶劑破碎提取1-2次，若藥材重量為Ikg則含水乙醇的用量為6 10升，破碎提取時間每次 2 5 min，抽濾，合并濾液；3)閃蒸濃縮將濾液在水浴溫度60°C 90°C，真空度為0.090 Mpa -0. 095Mpa，進液流速為200 350 mL · HiirT1的條件下進行真空薄膜濃縮，回收乙醇，得到濃縮液，ImL濃縮液含lg-2g藥材；4)大孔樹脂純化將得到的濃縮液通過大孔吸附樹脂分離富集，色譜柱的徑高比為 1 10 1 15，先用H2O洗脫，再依次用10% 80%含水乙醇進行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，洗脫流速為5 15 mL ^irT1,分別收集4倍柱體積的各部位洗脫液，收集合并20% 70% 含水乙醇各部位的洗脫液，將合并的洗脫液在50°C 80°C、真空度為0. 090 Mpa 0. 095 Mpa、進液流速為250 350 mL · mirT1的條件下進行真空薄膜濃縮、干燥，即得紅花芒毛苣苔總黃酮提取物干粉。
2.如權(quán)利要求1所述的一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，其特征在于步驟2) 中含水乙醇的濃度為55% 75%，優(yōu)選60% 70% ；破碎提取時間每次3 4 min。
3.如權(quán)利要求1所述的一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，其特征在于步驟3) 中水浴溫度為65°C 85°C，優(yōu)選70°C 80°C ；進液流速為230 320 mL · mirT1，優(yōu)選 250 300 mL · mirT1。
4.如權(quán)利要求1所述的一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，其特征在于步驟4) 中色譜柱的徑高比為1 12 1 13 ；洗脫流速為8 13 mL · mirT1，優(yōu)選洗脫流速為10 12 mL · mirT1 ；真空薄膜濃縮的溫度為65°C 70°C，進液流速為280 300 mL · mirT1。
5.如權(quán)利要求1所述的一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，其特征在于步驟4) 中先用H2O洗脫，再依次用10%含水乙醇、20%含水乙醇、40%含水乙醇、60%含水乙醇、75% 含水乙醇進行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，分別收集4倍柱體積的各部位洗脫液，收集合并20%含水乙醇、40%含水乙醇和60%含水乙醇各部位的洗脫液，將合并的洗脫液真空薄膜濃縮、干燥。
6.如權(quán)利要求1所述的一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，其特征在于步驟4) 中先用H2O洗脫，再依次用10%含水乙醇、30%含水乙醇、50%含水乙醇、70%含水乙醇進行梯度洗脫，最后用70%丙酮洗脫，分別收集4倍柱體積的各部位洗脫液，收集合并30%含水乙醇、50%含水乙醇、70%含水乙醇各部位的洗脫液，將合并的洗脫液真空薄膜濃縮、干燥。
全文摘要
一種天然植物來源的總黃酮的制備方法，屬于植物技術(shù)領(lǐng)域。以紅花芒毛苣苔為原料，用含水乙醇做溶劑進行組織破碎提??；抽濾，合并濾液，進行閃蒸濃縮回收溶劑；得到的濃縮液通過大孔吸附樹脂分離富集，用含水溶劑進行梯度洗脫，合并一定比例的含水溶劑洗脫液進行閃蒸濃縮回收溶劑，繼續(xù)真空干燥成干粉，即得紅花芒毛苣苔總黃酮提取物。其工藝簡單、提取濃縮技術(shù)先進、操作方便、成本低，綠色高效，提取物中總黃酮的含量為32.27％～43.69％，提取率為8.56％～13.56%，轉(zhuǎn)移率高達72.33％～84.45%。經(jīng)初步體外生物活性試驗表明，紅花芒毛具體總黃酮提取物具有一定的抗菌、抗氧化活性。
文檔編號A61P39/06GK102151292SQ201110080148
公開日2011年8月17日 申請日期2011年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月31日
發(fā)明者劉輝鑫, 袁珂 申請人:浙江農(nóng)林大學