專利名稱：一株海洋真菌卷枝毛霉及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株海洋真菌-卷枝毛霉(Mucor circinelloides)MNP12010102及
其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤是威脅人類健康的主要疾病之一，尋找生理活性強的物質(zhì)成為人類攻克疾病的主要工作之一。由于對陸生動植物的藥源發(fā)現(xiàn)越來越稀少，海洋已成為人類開墾新藥的處女地。海洋約占地球總面積71%，微生物資源豐富，種類繁多，是生物資源的巨大寶庫。海洋高鹽、高壓、低溫、寡營養(yǎng)等獨特的環(huán)境，賦予了海洋微生物獨特的代謝途徑和機體防御機制，使其產(chǎn)生的代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、生理功能獨特，為提取和分離天然生物活性分子提供了 新來源。海洋微生物作為抗腫瘤活性物質(zhì)的新來源，受到了全世界海洋研究工作者的關(guān)注。有關(guān)具有抗腫瘤活性的海洋微生物代謝產(chǎn)物的研究表明，醚類、大環(huán)內(nèi)酯類、萜類、生物堿類、肽類、酰胺類以及醌類化合物具有較好的抗腫瘤活性，因此成為抗癌新藥研發(fā)的重點。可見，從海洋真菌的次級代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)高活性的物質(zhì)對于發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物非常的重要，對疾病的攻克也具有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一株具有抗腫瘤活性的海洋真菌菌株——卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)MNP12010102及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一株具有抗腫瘤活性的海洋真菌-卷枝毛霉(Mucor circinelloides)
MNP12010102,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號CCTCC No M 2012298，保藏日期:2012年7月25日。所述卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102涂布或劃線接種于平板培養(yǎng)基上生長迅速，28°C培養(yǎng)48h后的菌落特征如下灰白色，菌落表面疏松，呈絨毛狀，極易挑起。菌體沿培養(yǎng)基表面蔓延伸長，有成束狀的氣生菌絲，氣生菌絲產(chǎn)黑色的球形孢子，氣生菌絲的高度約O. 8 I. 5cm ;所述卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102在液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)48h后的菌體生長特征如下呈絨毛小球狀生長，小球直徑約O. 35、. 8cm ；所述的卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102的生理生化特性如下革蘭氏染色陽性。本發(fā)明所述卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102由浙江省東海海域米集的海水中分離和篩選得到。菌株的篩選純化方法為將采集的海水運用稀釋涂布法涂于土豆平板培養(yǎng)基上，28 V培養(yǎng)至菌落數(shù)量不再增加，挑取單菌落至斜面培養(yǎng)基上。28°C培養(yǎng)2d，以菌株形態(tài)特征區(qū)別進行挑選，即得該菌株，并對該菌株進行菌種鑒定。所述的平板培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基的組成相同，組成為土豆15(T350g/L，葡萄糖l(T30g/L，瓊脂15 35g/L，溶劑為海水，pH7. 2 8. O。本發(fā)明經(jīng)篩選獲得的卷枝毛霉Mucorcircinelloides MNP12010102，涂布或劃線接種在平板培養(yǎng)基上生長迅速，28°C培養(yǎng)48h后長出灰白色，表面疏松，呈絨毛狀，有成束狀的氣生菌絲的菌體。將所述的卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102的18sRNA部分核苷酸序列與美國國立生物信息中心(National Cen ter for Biotechnology Information USA, NCBI)的基因庫中的微生物18sRNA序列比對，將其命名為卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102。所述卷枝毛霉 Mucor cireineIIoidesMNP12010102 的 18s rRNA 的部分核苷酸序列如下TTTCCGGTGGGGGACCTGCGGAAGGATCCTTAAATAATCAATAATTTTGGCTTGTCCATTATTATCTATTTACTGTGAACTGTATTATTACTTGACGCTTGAGGGATGCTCCACTGCTATAAGGATAGGCGATGGGGATGTTAACCGAGTCATAGTCAAGCTTAGGCTTGGTATCCTATTATTATTTACCAAAAGAATTCAGAATTAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTATAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAACTTGCGCTCATTGGTATTCCAATGAGCACGCCTGTTTCAGTATCAAAACAAACCCTCTATCCAACATTTTTGTTGAATAGGAATACTGAGAGTCTCTTGATCTATTCTGATCTCGAACCTCTTGAAATGTACAAAGGCCTGATCTTGTTTGAATGCCTGAACTTTTTTTTAATATAAAGAGAAGCTCTTGCGGTAAACTGTGCTGGGGCCTCCCAAATAATACTCTTTTTAAATTTGATCTGAAATCo本發(fā)明還涉及所述的卷枝毛霉MNP12010102在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述抗腫瘤藥物具體可為治療神經(jīng)癌、肝癌或白血病的藥物。所述應(yīng)用具體為所述卷枝毛霉MNP12010102提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述提取物為乙酸乙酯提取物，由如下方法獲得卷枝毛霉MNP12010102接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于25 35°C條件下培養(yǎng)Hlld得到發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)細胞破碎，離心取濾液用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮，得浸膏，即為所述乙酸乙酯提取物；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下麥芽提取物5 10g/L，葡萄糖5 10g/L，麥芽糖f2. 5g/L，酵母膏O. 8 2g/L，溶劑為水人工海水體積比廣4 1的混合物，ρΗ7. (Γ8. O。所述人工海水每IOOml 組成為NaCl 2. 448g, Na2SO4 O. 3917g, KC10. 0664g, KBrO. 0096g, SrCl2 0. 0024g, MgCl · 6H20 0. 4981g, CaCl2 · H2OO. 1102g, NaHCO3 0. 0192g, H3BO3
0.0026g, NaF 0. 0004g，蒸餾水 100ml。所述菌株在發(fā)酵培養(yǎng)前，通常需要先經(jīng)斜面培養(yǎng)活化，然后經(jīng)種子培養(yǎng)、獲得種子液再接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。所述的斜面培養(yǎng)基組成為土豆15(T350g/L，葡萄糖l(T30g/L，瓊脂15 35g/L，溶劑為人工海水，PH7. 2 8. O。所述的液體種子培養(yǎng)基組成為麥芽提取物5 10g/L，葡萄糖5 10g/L，麥芽糖Γ2. 5g/L，酵母膏0. 8 2g/L，溶劑為水人工海水廣4 1的混合物，pH7. 2^8. O。所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為麥芽提取物5 10g/L，葡萄糖5 10g/L，麥芽糖Γ2. 5g/L，酵母膏0. 8 2g/L，溶劑為水人工海水I 4 1的混合物，pH7 8. O。具體的，所述乙酸乙酯提取物由如下方法獲得(I)將海洋真菌卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102菌株接種于斜面培養(yǎng)基，于25 35°C培養(yǎng)24 48h，得到活化后的菌種；
所述的斜面培養(yǎng)基組成為土豆15(T350g/L，葡萄糖l(T30g/L，瓊脂15 35g/L，溶劑為人工海水，pH7. 2^8. O ；(2)將步驟(I)活化培養(yǎng)后海洋真菌卷枝毛霉Mucor circinelloidesMNP12010102菌體接種至液體種子培養(yǎng)基中，于25 35°C條件下培養(yǎng)16 48h，得到種子液；所述液體種子培養(yǎng)基組成為麥芽提取物5 10g/L，葡萄糖5 10g/L，麥芽糖f2. 5g/L，酵母膏O. 8^2g/L,溶劑為水人工海水f 4 1的混合物，pH7. 2^8. O ；(3)將步驟(2)種子液以10%體積比接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于25 35°C條件下培養(yǎng)疒14d，得到發(fā)酵液；所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為麥芽提取物5 10g/L，葡萄糖5 10g/L，麥芽糖f 2. 5g/L，酵母膏O. 8 2g/L，溶劑為水人工海水廣4 1的混合物，pH7^8. O。(4)將步驟(3)的發(fā)酵液于4°C條件下細胞破碎、離心或者過濾，分離除去菌體，所得發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取后收集上層萃取液，濃縮揮干制得的油狀提取物總浸膏(比重為
I.25^1. 38)。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(I)本發(fā)明的海洋真菌菌株一卷枝毛霉Mucorcircinelloides MNP12010102營養(yǎng)要求簡單、容易培養(yǎng)；(2)本發(fā)明海洋真菌菌株——卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102的代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤活性；(3)該菌株的次級代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性高，其培養(yǎng)所得的發(fā)酵液總浸膏對肝癌細胞(HepG2)、神經(jīng)癌細胞株P(guān)C12細胞和白血病細胞株U937細胞都有一定的抗腫瘤活性。


圖I為平板培養(yǎng)基上卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102的菌落形態(tài)；圖2為光學(xué)顯微鏡下卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102的菌體形態(tài)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例I :菌株的篩選、純化及鑒定( I)將自東海海域采集的海水運用稀釋涂布法涂于土豆平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)至菌落數(shù)量不再增加，挑取單菌落至斜面培養(yǎng)基上。28°C培養(yǎng)2d，以菌株形態(tài)特征區(qū)別進行挑選，即得該菌株。所述土豆平板培養(yǎng)基按如下組成配制土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，人工海水1000ml。(2)對篩選獲得的菌株MNP12010102進行18sRNA的PCR產(chǎn)物核苷酸序列比對，將其命名為卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102，提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC No M 2012298，保藏日期2012年7月25日。實施例2 :菌株的活化及大規(guī)模培養(yǎng)(I)將實施例I中篩選獲得的菌株接種于斜面培養(yǎng)基，于28°C培養(yǎng)24 48h，得到活化后的菌株，所述斜面培養(yǎng)基組成為土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，人工海水1000ml。(2)將步驟(I)活化培養(yǎng)后的菌株接種至液體種子培養(yǎng)基中，于28°C、15(T250r/min振蕩條件下培養(yǎng)24 48h，得到種子液，所述液體種子培養(yǎng)基按如下組成配制麥芽提取物6. Og,葡萄糖6. Og,麥芽糖I. 8g，酵母膏I. 2g,蒸懼水800ml,人工海水200ml, pH7. 5。
(3)將步驟(2)種子液以10%的體積比的接種量，移種到大規(guī)模液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C、15(T250r/min振蕩條件下培養(yǎng)7d，靜置培養(yǎng)7d得到發(fā)酵液。所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基按如下組成配制麥芽提取物6. Og,葡萄糖6. Og,麥芽糖I. Sg,酵母膏I. 2g，蒸餾水800ml，人工海水 200ml, ρΗ7· 5。實施例3 :海洋真菌卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102在抗腫瘤活性中的應(yīng)用(I)將實施例2中培養(yǎng)所得的發(fā)酵液先于超聲波細胞破碎儀中進行菌體破碎20min,然后于4°C條件下離心(9000r/min，15min)或者過濾，除去菌體，等體積乙酸乙酯進行萃取，對萃取相進行旋蒸，所得浸膏(比重約為I. 32)即為該菌株的次級代謝產(chǎn)物總浸膏。(2)將步驟(I)所得的發(fā)酵液總浸膏進行抗腫瘤活性測定。具體步驟如下選取三株腫瘤細胞，分別為腎上腺嗜鉻細胞瘤(PC12細胞)，肝癌 細胞(HepG2細胞)和組織細胞淋巴瘤細胞(U937細胞)，取對數(shù)期的細胞株制成細胞懸液，接種于96孔板中，培養(yǎng)48h，待測樣品(總浸膏加入O. 1%DMS010 μ L溶解后，用無血清的1640細胞培養(yǎng)基稀釋，加100 μ L至試驗組中，使得最終發(fā)酵液總浸膏的濃度分別為50 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml、400 μ g/ml、800 μ g/ml,陰性對照組加等量不含樣品的無血清培養(yǎng)基，空白對照組則為無細胞和樣品的無血清培養(yǎng)基，依托泊苷(VP-16)作為陽性對照品，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，腫瘤細胞在CO2培養(yǎng)箱(37°C)培養(yǎng)48h，每孔加入5mg/ml的MTT20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心移去上清，每孔加DMS0150 μ L，振蕩lOmin，用酶標(biāo)儀充分振蕩使得MTT紫色產(chǎn)物完全溶解，測490nm的A值，根據(jù)公式抑制率=(A陰性對照組-A空白對照組)-(A樣品組-A空白對照組)/(A陰性對照組-A空白對照組)即可求得抑制率。(3)用SPSS軟件測得海洋真菌卷枝毛霉Mucor circinelloidesMNP12010102的提取物對PC12細胞的IC50 (ug/ml)為373. 73ug/ml，提取物對H印G2細胞的IC50 (ug/ml)為512. 21ug/ml，提取物對 U937 細胞的 IC50 (ug/ml)為 250. 46ug/ml。由所測的數(shù)據(jù)可知海洋真菌卷枝毛霉Mucor circinelloidesMNP12010102的次級代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性高，其培養(yǎng)所得的發(fā)酵液總浸膏對腎上腺嗜鉻細胞瘤(PC12細胞)，肝癌細胞(ifepG2細胞)和組織細胞淋巴瘤細胞(U937細胞)都有一定的抗腫瘤活性。
權(quán)利要求
1.卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)MNP12010102,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，保藏編號:CCTCC No M 2012298，保藏日期:2012年7月25日。
2.如權(quán)利要求I所述的卷枝毛霉MNP12010102在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤藥物為治療神經(jīng)癌、肝癌或白血病的藥物。
4.如權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于所述卷枝毛霉MNP12010102提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述提取物為乙酸乙酯提取物，由如下方法獲得卷枝毛霉MNP12010102接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于25 35°C條件下培養(yǎng)Hlld得到發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)細胞破碎，離心取濾液用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮，得浸膏，即為所述乙酸乙酯提取物；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下麥芽提取物5 10g/L，葡萄糖5 10g/L，麥芽糖Γ2. 5g/L，酵母膏O. 8 2g/L，溶劑為水人工海水體積比廣4 1的混合物，ρΗ7. (Γ8. O。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株新的抗腫瘤活性海洋真菌菌株——卷枝毛霉Mucor circinelloides MNP12010102，及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC NoM2012298，保藏日期2012年7月25日。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)本發(fā)明的海洋真菌菌株—卷枝毛霉Mucor circinelloidesMNP12010102營養(yǎng)要求簡單、容易培養(yǎng)；(2)該菌株的代謝產(chǎn)物具有抗腫瘤活性；(3)該菌株的次級代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性高，其培養(yǎng)所得的發(fā)酵液總浸膏對神經(jīng)癌細胞(PC12細胞)，肝癌細胞(HepG2細胞)和白血病細胞(U937細胞)都有一定的抗腫瘤活性。
文檔編號A61P35/02GK102911876SQ201210308209
公開日2013年2月6日 申請日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者王鴻, 馮宇美, 謝燕瑾 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)