一種姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法
【專利摘要】一種姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法，所述方法包括：稱取質(zhì)量之比為1﹕30~50﹕3~5﹕1~3的姜黃素、大豆卵磷脂、膽固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，溶于乙醇中作為有機相；以pH6~7的磷酸鹽緩沖鹽液作為水相；在1000~1500r·min-1的轉(zhuǎn)速下，將有機相勻速緩慢滴入40~50℃保溫的水相中，滴畢，繼續(xù)攪拌2~3h，揮發(fā)有機溶劑，得到所述姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的溶液。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明以乙醇注入法制備Cur-LCL，工藝簡單，包封率較高，粒徑較小，體外釋放緩慢，體內(nèi)藥動學數(shù)據(jù)顯示其血漿清除率明顯降低，半衰期顯著延長，有一定長循環(huán)作用。
【專利說明】一種姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]姜黃素(Curcumin，Cur)是中藥姜黃的主要活性成分，屬于多酚類化合物，現(xiàn)代研究已經(jīng)明確證明其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理作用，且毒副作用小，臨床應用前景良好。但由于姜黃素水溶性差，易被氧化，體內(nèi)代謝迅速，生物利用度低的缺陷限制了姜黃素的推廣發(fā)展。脂質(zhì)體(Liposomes)作為藥物新型給藥系統(tǒng)具有靶向性，緩釋性，降低藥物毒性和提高藥物穩(wěn)定性的優(yōu)點。但是作為藥物載體普通脂質(zhì)體作用時間仍然不理想，且長期儲存易聚集穩(wěn)定性欠佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了提高姜黃素穩(wěn)定性降低其在血漿內(nèi)的消除速率，本發(fā)明提供了一種姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法。
[0004]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法，所述方法包括:稱取質(zhì)量之比為1: 30-50: 3飛:f3的姜黃素、大豆卵磷脂、膽固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，溶于乙醇中作為有機相；以pH6~7的磷酸鹽緩沖鹽液作為水相；在100(Tl50 0 r ^mirT1的轉(zhuǎn)速下，將有機相勻速緩慢滴入4(T50°C保溫的水相中，滴畢，繼續(xù)攪拌2~3h，揮發(fā)有機溶劑，得到所述姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的溶液。
[0005]本發(fā)明采用聚乙二醇(PEG)修飾的長循環(huán)脂質(zhì)體，能夠提高脂質(zhì)體的親水性，減弱血漿蛋白的調(diào)理作用，逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對其的識別，降低與單核吞噬細胞的親和力，可在循環(huán)系統(tǒng)中穩(wěn)定存在并使半衰期延長，增加腫瘤組織對它的攝取。
[0006]優(yōu)選的，所得姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的溶液進一步在_80°C預凍IOh后真空冷凍干燥，得姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉，冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0007]優(yōu)選的，所述姜黃素、大豆卵磷脂、膽固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺質(zhì)量用量之比為3: 100: 10: 5，有機相中姜黃素濃度為1.5mg/mL。
[0008]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明以乙醇注入法制備Cur-LCL，工藝簡單，包封率較高，粒徑較小，體外釋放緩慢，體內(nèi)藥動學數(shù)據(jù)顯示其血漿清除率明顯降低，半衰期顯著延長，有一定長循環(huán)作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為Cur-LCL的透射電鏡照片(X 60000)。
[0010]圖2為Cur-LCL的粒徑分布。
[0011]圖3為Cur-LCL的Zeta電位分布。
[0012]圖4為Cur原藥、Cur脂質(zhì)體、Cur長循環(huán)脂質(zhì)體的體外釋藥曲線(n=3)。
[0013]圖5為空白大鼠血漿(A)、空白大鼠血漿加Cur內(nèi)標物(B )、尾靜脈給藥Cur-LCL后大鼠血漿樣品加內(nèi)標后(C )的高效液相色譜圖。
[0014]圖6為大鼠尾靜脈給藥Cur原藥、Cur脂質(zhì)體混懸液、Cur長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液后的藥時曲線。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:
實施例1:
1.儀器與材料 1.1.儀器
CP225D電子天平(德國賽多利斯公司)；UV-1700紫外分光光度計(日本島津公司)；Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司);HJ_6B多頭磁力加熱攪拌機(金壇市金偉實驗儀器廠);SCIENTZ-1I D超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);pH酸度計(瑞士梅特勒托利多)；Optima超速低溫離心機(美國Beckman公司)；Labconco冷凍干燥機(美國Labconco公司),Marvern measurement粒度測定儀(英國馬爾文儀器有限公司)，JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)。
[0016]藥品與試劑
姜黃素(成都普思生物技術(shù)有限公司，含量>98%，批號12041502);姜黃素對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量98.8%，批號110823-201004);注射用大豆卵磷脂(PC>95%，購自上海太偉藥業(yè))；膽固醇(美國Avanti Polar Lipids,純度>99%);聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE，美國Avanti Polar Lipids,純度>99%);甲醇(色譜純，美國Honeywell Burdick&Jackson公司，批號10071753);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0017]實驗動物
清潔級SD大鼠，雌雄兼用，體重(200±10)g (浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，合格證號:SCXK浙2008-0036);所有動物實驗均按照浙江大學動物飼養(yǎng)和使用指南進行。
[0018]方法
2.1姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的制備
采用乙醇注入法:精密稱取姜黃素3.0mg,大豆卵磷脂100.0 mg,膽固醇10.0 mg,DSPE-PEG 5.0 mg溶于2.0mL乙醇作為有機相，pH6.5濃度為0.01 mol.L—1的磷酸鹽緩沖鹽液作為水相，在1200 r ^mirT1的轉(zhuǎn)速下，將有機相勻速緩慢滴入50 °C保溫水相中，滴畢，繼續(xù)1200 r.mirT1攪拌2 h，揮發(fā)有機溶劑，得姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的溶液，將其在_80°C預凍10 h后真空冷凍干燥，即得姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉。
[0019]稱取15mg Cur原藥于容量瓶中，用2mL的乙醇超聲溶解,用10%的輕丙基-β-環(huán)糊精稀釋至刻度，得Cur原藥混懸液。
[0020]稱取適量姜黃素脂質(zhì)體(除原料中無DSPE-PEG外，制備方法與Cur-LCL相同)和姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉各300mg，復溶于4mL的生理鹽水中，得姜黃素脂質(zhì)體混懸液和姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液。
[0021]2.2形態(tài)、粒徑和Zeia電位
取適量姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液滴于銅網(wǎng)上，靜置10 min后用濾紙片吸干，再滴加2.0% (w/w)磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上負染I min，自然揮干，用透射電子顯微鏡觀察形態(tài)并攝制照片；取姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液，適量蒸餾水稀釋后，采用激光粒度測定儀測定平均粒徑、粒徑分布和Zeia電位。
[0022]2.3包封率和載藥量的測定
2.3.1色譜條件
色譜柱:Agilent Extend_C18 柱(250 mmX4.6 mm, 5 μ m);流動相:乙腈-2%醋酸的水(53:47);檢測波長:420 nm ;流速:1.0 mL.mirT1 ;柱溫:35°C ;進樣體積:20 μ L。 [0023]2.3.2線性關(guān)系考察
精密稱取Cur標準品適量，置50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為100.0 yg -mr1的Cur對照品儲備液。分別精密量取儲備液適量于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得濃度分別為1.0,2.0,4.0,8.0、16.0,32.0,64.0 μg.mL—1的系列對照品溶液，按“2.3.1”項下Cur色譜條件測定，以峰面積積分值(A)對質(zhì)量濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程乂二 86.089C - 8.7642 Cr 二 7)，表明 Cur 在 1.0 ~64.0 μ g.mL-1 內(nèi)峰面積與藥物濃度呈良好的線性關(guān)系。
[0024]2.3.3包封率和載藥量測定
精密量取姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液1.5mL，置于具塞離心管中，40 000 r ^mirT1離心40 min，取上清液I mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，經(jīng)0.22 μπι微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按“2.3.1”項下色譜條件分別測定游離Cur含量；另取姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液I mL于10 mL容量瓶中，用甲醇破乳并稀釋至刻度，經(jīng)0.22 μπι微孔濾膜濾過，續(xù)濾液按“2.3.1”項下色譜條件分別測定姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體中總的Cur含量；按下列公式分別計算脂質(zhì)體中Cur的包封率(EE %)和載藥量(DL %)。
[0025]EE % = (W0 - W1)/ W0XlOO %
DL % = (W0 - W1)/ WtXlOO %
其中，W。為Cur-LCL中的總藥物量J1為脂質(zhì)體中的游離藥物量；Wt =Cur-LCL的總重量。
[0026]2.4體外釋藥研究
選取含30 % (v/v)乙醇的pH 5.8 PBS溶液為釋放介質(zhì)，考察的體外釋藥行為。分別精密稱取適量Cur原藥、姜黃素脂質(zhì)體(Cur-Lips)和姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體(Cur-LCL)各3份(含Cur均為I mg),分散于2 mL釋放介質(zhì),置于預先處理過的透析袋(伽=7000 Da)內(nèi)，排除氣泡后密封，置于200 mL釋放介質(zhì)中，于(37 土 0.5 VC恒溫水浴振蕩(75 r-mm1),于 0.25,0.5,0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、18、24 h 準確取樣 lmL，并立即補加等量同溫新鮮釋放介質(zhì)，樣品經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按“2.3.1”項下色譜條件測定釋放介質(zhì)中藥物含量，計算累積釋藥率(Q %)。
[0027]2.5姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體大鼠體內(nèi)藥動學研究
2.5.1血漿樣品處理
精密移取血漿樣品200 UL置2 mL具塞離心管中定量加入15 μ g.mL—1內(nèi)標物40μ L,加入0.6mL乙酸乙酯，潤旋混合3 min,于10 000 r ?mirT1離心10 min,移取、有機上清液，再加入0.6mL乙酸乙酯萃取重復萃取一次,合并萃取液，30°C真空干燥,殘洛用200 μ L甲醇溶解，充分潤旋振蕩后于10 000 r.mirT1離心10 min,取上清液20 μ L進樣分析。[0028]2.5.2血漿中Cur測定方法的建立 標準曲線的制備:
配制濃度為0.2,0.4,0.6,0.8、1、2、4、6、8、10 μδ.mL—1的一系列姜黃素標準品溶液，和濃度為15 μ g -mr1的大黃素標準品儲備液。精密吸取不同濃度的姜黃素200 μ L和大黃素標準儲備液40 μ L于EP管中，真空干燥后，分別加入空白血漿200 yL，高速渦旋3min，按照“2.5.1”項下方法處理血漿并進樣測定，以待測藥物的峰面積As與內(nèi)標物峰面積Ai之比AsAi為縱坐標，以姜黃素濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸，建立標準曲線方程。
[0029]色譜條件:
色譜柱:Agilent Extend_C18 柱(250 mmX4.6 mm, 5 μ m);流動相:乙腈-2%醋酸的水(53:47);檢測波長:420 nm ;流速:1.0 mL.min—1 ;柱溫:35 V ;進樣體積:20 μ L。
[0030]方法專屬性考察:
大鼠空白血漿、空白血漿加Cur，空白血漿加大黃素以及大鼠尾靜脈注射Cur-LCL后取血按照“2.5.1”處理后的樣品，經(jīng)HPLC分析測定。
[0031]萃取回收率:
將0.2、1、10的低、中、高3種濃度的Cur血漿樣品，按“2.3.1”項下方法處理
后進樣測定各個濃度Cur及內(nèi)標物的峰面積，相應濃度的姜黃素和內(nèi)標物的甲醇溶液進樣測定，得峰面積，將經(jīng)萃取的血漿樣品峰面積與其在甲醇中的峰面積相比即得姜黃素內(nèi)標物在血漿中萃取回收率。
[0032]方法回收率與精密度測定:將0.2、1、10的低、中、高3個質(zhì)量濃度的血漿樣品，按“2.5.1”項下方法處理后進樣測定，每個濃度平行測定3次，計算回收率。分別在日內(nèi)測定5次，連續(xù)測定5天(每天I次)，計算日內(nèi)和日間精密度。
[0033]2.5.3給藥方案及血樣采集
取健康SD大鼠18只，體重(200 ± IOg)禁食12 h，自由飲水，隨機分為3組，每組6只。按Cur 15 mg.kg—1單劑量尾靜脈注射分別給予Cur混懸液、Cur脂質(zhì)體混懸液，Cur長循環(huán)脂質(zhì)體混懸液，給藥后分別于5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、480 min經(jīng)股動脈取血0.5 mL，置肝素鈉預處理的2 mL具塞離心管中，3 000 r.mirT1離心10 min，定量吸取血漿200 μ L，按“2.5.1”項下方法處理。每次取血后立即用注射器給予等量的0.9 %生理鹽水。
[0034]3 結(jié)果
3.1姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的性質(zhì)
透射電鏡下觀察Cur-LCL呈類圓形，大小及分布較均勻，粒子間未見粘連和聚集(圖1)。粒徑分布結(jié)果顯示，平均粒徑為(110 ± 3.20 )nm,多分散系數(shù)為(0.259 ± 0.007 )(圖2 );Zeta電位為(-5.8±0.87)mV (圖3)。測得姜黃素包封率為(80.25 ± 1.61)%，載藥量為(2.16 ± 0.03)%。
3.2姜黃素脂質(zhì)體的體外釋藥
在pH 5.8 PBS介質(zhì)(含體積分數(shù)30 %乙醇)中Cur體外釋藥曲線見圖4。Cur原藥在釋放介質(zhì)中釋藥較快，2 h累積釋藥百分率分別為67.5%，4 h時基本釋放完全，累積釋放百分率為95.96 %。Cur-Lips在4 h時累積釋藥百分率分別為49.16 %，8 h時累計釋放82.48%，12 h累計釋放率95.34%，具有緩釋特征；而Cur-LCL在第8 h累積釋藥百分率只有55.48%, 24 h累計釋放88.92 %,與Cur原藥組和Cur-Lips組相比具有顯著緩釋特征。
[0035]釋放曲線說明，Cur-Lips和Cur-LCL在3 h內(nèi)釋藥較快，Cur-Lips有40%藥物突釋，Cur-LCL有30%的藥物突釋，可能是脂質(zhì)體表面吸附的藥物釋放弓丨起的，之后Cur-LCL表現(xiàn)了更好的緩釋性能，主要原因可能是PEG長鏈在納米粒表面形成了水化層，可有效阻止藥物擴散。結(jié)果表明Cur-Lips在12 h基本釋放完全，而Cur-LCL在24 h才達到完全釋放，說明Cur-LCL緩釋特性良好。
[0036]3.3藥動學研究
3.3.1方法專屬性
空白大鼠血漿、空白大鼠血漿加Cur和內(nèi)標、及大鼠尾靜脈注射給藥Cur-LCL后加內(nèi)標物的血漿樣品HPLC色譜圖見圖5。由圖5可知，所建立的方法分離效果好，專屬性強，且能與內(nèi)標物充分分離，血漿中雜質(zhì)或內(nèi)源性物質(zhì)均不干擾測定。
[0037]3.3.2萃取回收率考察
低、中、高3種血漿濃度Cur萃取回收率分別為81.30+3.72%,82.79±5.96%、84.13±4.12%，內(nèi)標物的萃取回收率為90.27±1.77%，符合方法學要求。
[0038]3.3.3標準曲線與方法學考察結(jié)果
血漿中Cur的標準曲線方程為J = 0.5725C + 0.02(r = 0.9995)，表明Cur血漿質(zhì)量濃度在0.2~10 Pg.mL—1內(nèi)線性關(guān)系關(guān)系良好。
[0039]3.3.4精密度、方法回收率、萃取回收率考察
低、中、高3種血漿濃度Cur的方法回收率分別為(91.24±5.69) %、(92.73±2.85) %、(94.85±2.11);日內(nèi) RSD 分別為 6.35 %A.32 %、3.15 % ;日間 RSD 分別為 5.71 %Α.62%、4.73 %； 3.3.5血藥濃度-時間曲線與藥動學參數(shù)大鼠尾靜脈注射Cur混懸液、Cur-Lips和Cur-LCL混懸液后，平均血藥濃度-時間曲線見圖6。數(shù)據(jù)經(jīng)擬合后符合開放式二室模型，所得主要藥動學參數(shù)見表1，并對其進行統(tǒng)計學分析。由表1可知，脂質(zhì)體組(Cur-Lips和Cur-LCL)和原藥組相比，血漿消除速率(CL)均顯著減慢，t1/2顯著延長(ρ〈0.01), AUC顯著提高(ρ〈0.01),并且Cur-LCL 的 t1/20 與 Cur-Lips 相比也延長(ρ〈0.05)。說明Cur制成長循環(huán)脂質(zhì)體能顯著延緩了藥物的消除。
[0040]表1:大鼠尾靜脈給藥后藥動學參數(shù)(mean土SD, n=6)
【權(quán)利要求】
1.一種姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的制備方法，所述方法包括:稱取質(zhì)量之比為1: 30-50:3飛:f3的姜黃素、大豆卵磷脂、膽固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，溶于乙醇中作為有機相；以pH6~7的磷酸鹽緩沖鹽液作為水相；在100(Tl500 r.mirT1的轉(zhuǎn)速下，將有機相勻速緩慢滴入4(T50°C保溫的水相中，滴畢，繼續(xù)攪拌2~3h，揮發(fā)有機溶劑，得到所述姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所得姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體的溶液進一步在-80°C預凍IOh后真空冷凍干燥，得姜黃素長循環(huán)脂質(zhì)體凍干粉，冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述姜黃素、大豆卵磷脂、膽固醇和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺質(zhì)量用量之比為3: 100: 10: 5，有機相中姜黃素濃度為.1.5mg/mL。
【文檔編號】A61P39/06GK103637988SQ201310414165
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月11日
【發(fā)明者】李范珠, 尤佳, 王國偉, 魏穎慧, 徐駿軍, 郭曼曼 申請人:浙江中醫(yī)藥大學