載多西他賽和萊菔硫烷的自組裝納米粒的制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒，及其制備方法與在制備治療乳腺癌藥物中的應用。本發(fā)明納米粒的微觀結(jié)構(gòu)包括疏水的PLGA核心和親水的HA外殼，其中PLGA核心用于包載藥物DTX或SFN，而親水外殼HA可以靶向CD44受體高表達的乳腺癌干細胞。本發(fā)明經(jīng)體外細胞毒性實驗表明載藥納米粒比游離藥物發(fā)揮了更好的抗分化乳腺細胞和乳腺癌干細胞的能力；經(jīng)體內(nèi)腫瘤抑制實驗表明較游離藥物及聯(lián)用的游離藥物更有效，并且系統(tǒng)毒性小。本發(fā)明的納米?？蛇_到同時靶向分化乳腺癌細胞核乳腺癌干細胞的作用，為乳腺癌治療提供了一種新策略。
【專利說明】載多西他賽和萊菔硫烷的自組裝納米粒的制備方法與應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說，涉及制備載多西他賽(DTX)和萊菔硫烷(SFN)的PLGA-HA自組裝納米粒，靶向已分化的乳腺癌細胞和乳腺癌干細胞，以達到根治乳腺癌的目的。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在我國發(fā)病率有逐年上升的趨勢，并且發(fā)病率趨于年輕化。因此，乳腺癌的預防和治療成為我國醫(yī)藥研究的一項重要任務。目前乳腺癌的治療已從單一的手術(shù)治療發(fā)展到包括手術(shù)、化療、放療、生物治療在內(nèi)的綜合療法。這些方法主要表現(xiàn)為以下幾個方面:(I)術(shù)后輔助化療，這種療法采用互不交叉耐藥的多種化療藥物按時序和不同的藥物組合進行聯(lián)合治療。旨在降低化療藥物的用藥劑量、更好的控制藥物劑量強度和劑量累計，從而降低化療藥物對正常組織的損傷。(2)術(shù)后輔助內(nèi)分泌治療，乳腺癌組織中雌激素暴露時間的延長會增加乳腺癌的危險性，基于這樣的背景原因，減少或切斷雌激素來源，或者設法抵抗雌激素的作用就有可能阻止雌激素對乳腺癌細胞的刺激，抑制乳腺癌的生長。(3)分子靶向治療，這是基于乳腺癌細胞表面抗原、生長因子受體或細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路中重要的酶或者蛋白質(zhì)等的一種治療方法。其中包括表皮生長因子受體靶向(如赫賽汀)、血管生成抑制因子(如貝伐單抗)以及表皮生長因子受體-酪氨酸酶抑制劑(如吉非替尼)。
[0003]盡管，以上的綜合療法與單一的手術(shù)治療、放療、化療相比取得了很大的進展，但是這些方法依舊面臨著一些問題:(1)輔助化療和內(nèi)分泌治療盡管降低了用藥劑量，也減輕了對正常組織的損傷。臨床上依舊采用的是全身給藥，藥物在腫瘤組織中的積累量僅僅是給藥量的一小部分，并且藥物在體內(nèi)難以達到長循環(huán)的作用很快便代謝消除，需要對患者反復的給藥，這對于腫瘤患者來說是雪上加霜。(2)分子靶向給藥盡管在靶向性上有了提高，但是這種作用往往是針對乳腺癌病理過程中的某一個單一環(huán)節(jié)，對于不同的患者而言具有很大的個體差異性。(3)目前的治療方法存在一個共同問題:這些療法中用于乳腺癌治療的一線藥物針對的都是已分化的腫瘤細胞，可以在較短時間內(nèi)殺滅這類細胞，使腫瘤體積減小甚至消失，然而難以根除乳腺癌的復發(fā)，沒有從根源上對乳腺癌進行治療。
[0004] 隨著人們對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機制的深入研究，近年來在干細胞學說的基礎(chǔ)上提出了腫瘤干細胞(cancer stem cell, CSC)學說,該學說認為腫瘤干細胞是腫瘤發(fā)生的根源。CSC是存在于腫瘤組織中極小部分的未分化的細胞，這類細胞具很強的自我更新能力和分化潛能，并且能不斷地產(chǎn)生新的腫瘤干細胞和腫瘤細胞，最新的研究表明乳腺癌干細胞細胞表型為CD44+CD24—。傳統(tǒng)的腫瘤治療如手術(shù)切除、放療、化療均是針對整個腫瘤組織進行的，雖然消除了大多數(shù)的已分化腫瘤細胞，但由于CSC表達多種耐藥蛋白如多藥耐藥蛋白-1，ATP結(jié)合盒蛋白等，導致其對化療、放療及其他的一些誘導凋亡的治療不敏感。治療后殘余的CSC進一步增值分化形成新的腫瘤組織，導致腫瘤的復發(fā)。靶向腫瘤干細胞治療為從本質(zhì)上根除腫瘤提供了一條新的途徑。[0005]多西他賽(DTX)，是一線化療藥物，其主要的劑型為多西他賽注射液(商品名:泰索帝)，該產(chǎn)品不具備腫瘤靶向性，易產(chǎn)生骨髓抑制，皮膚紅斑以及胃腸道反應。并且其溶劑為吐溫-80，不實用于對吐溫-80過敏的患者使用。另外，萊菔硫烷(SFN)是抗乳腺癌干細胞特異性的藥物，但由于其體外對熱和堿性條件的不穩(wěn)定性以及體內(nèi)的快速消除，其臨床運用受到極大的限制。
[0006]聚乳酸羥基乙酸(Poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)由于具有良好的組織相容性和生物可降解性而廣泛用于組織工程支架。透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA-b-HA)可主動結(jié)合乳腺癌及乳腺癌干細胞上高表達的CD44受體，從而介導納米粒的主動靶向。
[0007]目前尚無文獻報道載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒的制備方法。本發(fā)明的另一個目的是提供上述方法制備得到的納米粒，以及該納米粒在制備治療乳腺癌藥物中的應用。
[0009]本發(fā)明擬將多西他賽和萊菔硫烷聯(lián)用同時消除分化的乳腺癌及乳腺癌干細胞，以達到更好的治療乳腺癌的目的。
[0010]進一步地，本發(fā)明擬將多西他賽和萊菔硫烷兩藥包載于納米粒中，利用PLGA-b-HA納米粒對腫瘤組織的EPR效應以及主動靶向性，以達到提高療效降低副作用的目的。
[0011]本發(fā)明的主要技術(shù)方案是選擇一線化療藥物-多西他賽和抗乳腺癌干細胞特異性的藥物-萊菔硫烷，將其用生物可降解的PLGA-b-HA嵌段共聚物包載后用于乳腺癌的靶向治療。載多西他賽(DTX)的PLGA-b-HA納米粒(DTX/NPs)用于消除腫瘤內(nèi)已分化的乳腺癌細胞，載萊菔硫烷(SFN)的PLGA-b-HA納米粒(SFN/NPs)用于消除乳腺癌干細胞。
[0012]本發(fā)明的技術(shù)方案包括:
[0013]PLGA-b-HA的嵌段共聚物的合成；
[0014]載多西他賽和萊菔硫烷的PLGA-b-HA納米粒的制備；
[0015]載藥納米粒體外抗乳腺癌和乳腺癌干細胞活性；
[0016]載藥納米粒體內(nèi)外抗乳腺癌和乳腺癌干細胞效果分析。
[0017]本發(fā)明的第一方面，是提供了一種載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒的制備方法，該制備方法包括以下步驟:
[0018]A、PLGA-b-HA的嵌段共聚物的合成
[0019]HA的末端經(jīng)還原胺化形成丁二胺化的HA，然后再和PLGA的琥珀酰亞胺酯形成兩親嵌段共聚物；
[0020]B、載藥PLGA-bHA納米粒的制備
[0021]將藥物(DTX, SFN)和PLGA-b-HA嵌段聚合物同時溶解于DMSO/DMF (v/v=3:l)的混合溶劑中，磁力攪拌15分鐘讓材料和藥物盡可能的溶解。然后再緩慢的加入一定量的去離子水，繼續(xù)攪拌15min后將該溶液轉(zhuǎn)入到透析袋中(Spectra/Por, MWC012000-14000)，透析12小時除去有機溶劑，每兩小時換水一次。[0022]步驟A中，所形成的PLGA-b-HA的嵌段共聚物屬于線性高分子，并且水性環(huán)境中可形成核-殼結(jié)構(gòu)的球形納米粒。其中的還原胺化的方法為本領(lǐng)域公知方法，可參考文獻“Jeong YI, Kim do H, Chung CW, Yoo JJ, Choi KH, Kim CH, et al.Self-assemblednanoparticles of hyaluronic acid/poly(DL-lactide-co-glycolide)block copolymer.Colloids Surf B Biointerfaces2012; 90:28-35”，將聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)和透明質(zhì)酸(HA)首位相連形成嵌段共聚物。
[0023]所述的聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)可選用分子量為10000_35000Da，最佳分子量為13600Da。
[0024]所述的透明質(zhì)酸(HA)可選用分子量為3000_10000Da，最佳分子量為5600Da。
[0025]優(yōu)化的方法為:
[0026](I)末端胺化的HA的制備:按質(zhì)量比1:30將HA溶解于醋酸/醋酸鈉(pH=5.6，2%w/w)的緩沖液中，待HA完全溶解后加入1.0ml的1，4- 丁二胺。50°C磁力攪拌形成亞胺，其后加入五分之一于HA質(zhì)量的氰基硼氫化鈉，然后將pH值調(diào)節(jié)到弱堿性繼續(xù)于50°C磁力攪拌，并且在接下來連續(xù)兩天分別再加入同等質(zhì)量的氰基硼氫化鈉；反應結(jié)束后，將反應溶液裝入透析袋中(Spectra/Por, MWC03500)，在去離子水中透析；透析結(jié)束將袋內(nèi)溶液凍干待用；
[0027]⑵NHS活化的PLGA的制備:按1:10 (m/v)的比例將PLGA溶解于二氯甲烷中，再分別加入5倍于PLGA摩爾質(zhì)量的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl )，室溫下磁力攪拌，反應結(jié)束后產(chǎn)物用冰冷的乙醚沉淀，再用冰冷的乙醚/甲醇混合液(50/50，v/v)沖洗三次以去除過量的NHS和EDC.HC1，然后將產(chǎn)物真空干燥待用；
[0028](3) PLGA-b-HA的合成:精密稱取一定量的PLGA-NHS和1.5倍于PLGA-NHS摩爾質(zhì)量的丁二胺化的HA將其盡可能分散到一定量的DMSO中最終使PLGA-NHS的含量為25 μ g/ml，再加入N，N- 二異丙基乙胺使其最終含量為I μ g/ml，然后在50°C下攪拌48小時，反應結(jié)束后將該溶液裝入透析袋中(Spectra/Por, MWC012000-14000)，在去離子水中透析，透析結(jié)束將袋內(nèi)溶液凍干即得PLGA-b-HA嵌段共聚物。
[0029]步驟(1)中，可采用:1.0g的HA、30.0ml的醋酸/醋酸鈉、1.0ml的1，4-丁二胺、
0.2g的氰基硼氫化鈉；
[0030]步驟⑵中，可采用:1.0g的PLGA、10ml的二氯甲烷中、48.0mg的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、80.0mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl);
[0031]步驟(3)中，可采用:0.5g 的 PLGA-NHS、0.35g 的胺化的 HA,20.0ml 的 DMSO 中、20 μ I的N，N- 二異丙基乙胺。
[0032]步驟B中，為了提高藥物的載藥量，在溶劑-透析法的基礎(chǔ)上我們稍作修改，具體的方法為:在含有聚合和藥物的有機相中緩慢加入水相，給予聚合物充足的時間將藥物包載到疏水核心中，有利于載藥量的提聞。
[0033]步驟B較佳的步驟為:
[0034]將PLGA-b-HA嵌段聚合物和DTX按20:1的比例(SFN按1:1的比例)溶解于一定體積的DMSO/DMF (v/v=3:l)的混合溶劑中，使PLGA-b-HA的最終濃度為5-10mg/ml，然后在磁力攪拌下緩慢加入4.0ml的去離子水,繼續(xù)攪拌將該溶液轉(zhuǎn)入到透析袋中(Spectra/Por, MWC012000-14000)，透析除去有機溶劑。
[0035]步驟B中，可采用:IOmg的PLGA-b-HA嵌段聚合物和0.5mg的DTX，或IOmg的PLGA-b-HA嵌段聚合物和IOmg SFN分別溶解于Iml的DMS0/DMF( v/v=3:1)的混合溶劑中。
[0036]本發(fā)明的第二方面，是提供了根據(jù)上述方法制備得到的載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒。
[0037]本發(fā)明的第三方面，是提供了上述的納米粒在制備治療乳腺癌藥物中的應用。
[0038]該應用具體靶向已分化的乳腺癌細胞和乳腺癌干細胞。
[0039]本發(fā)明的載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒(載藥納米粒)體外抗乳腺癌和乳腺癌干細胞活性:
[0040]本發(fā)明采用MTT法測定細胞在經(jīng)不同藥物濃度處理后細胞存活率，來評價藥物和載藥納米粒的細胞毒性。細胞的生存曲線經(jīng)對數(shù)模擬后，計算細胞的IC50來定量比較其細胞毒性大小。
[0041]萊菔硫烷和載萊菔硫烷的納米粒的體外抗干細胞活性，乳腺癌細胞在經(jīng)不同濃度SFN及SFN納米粒處理后，在無血清懸浮培養(yǎng)基中所形成的乳腺球的數(shù)量和大小來評價。
[0042]本發(fā)明的載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒(載藥納米粒)體內(nèi)外抗乳腺癌和乳腺癌干細胞效果分析:
[0043]( I)體內(nèi)抗瘤效果評價:
[0044]在BABL/c裸鼠的乳墊下注射乳腺癌細胞懸液，建立原位乳腺癌荷瘤小鼠模型。待腫瘤生長到一定體積，藥物經(jīng)尾靜脈注射，每三天注射一次，一共注射四次。每兩天測定腫瘤的大小(腫瘤體積=長邊X短邊2/2)和稱量小鼠的體重，分別用于評價抗腫瘤生長作用和毒副作用。荷瘤小鼠經(jīng)34天治療觀察后，麻醉處死將腫瘤剝離，用PBS洗凈血潰，并用濾紙片吸干水分后，稱量腫瘤的重量。
[0045](2)體內(nèi)抗腫瘤干細胞活性評價:
[0046]經(jīng)不同藥物組分治療后的離體腫瘤，經(jīng)消毒處理后，消化成單細胞懸液，再經(jīng)無血清培養(yǎng)后，計算乳腺球的的成球率和大小。在蛋白水平上，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定乳腺癌干細胞相關(guān)蛋白(β -連環(huán)蛋白和細胞周期素D1)。
[0047]本發(fā)明的PLGA-b-HA可以形成具有核-殼結(jié)構(gòu)的球型納米粒，該納米粒的微觀結(jié)構(gòu)包括疏水的PLGA核心和親水的HA外殼，其中PLGA核心用于包載藥物(DTX or SFN),而親水外殼HA可以靶向CD44受體高表達的乳腺癌干細胞。體外細胞毒性實驗表明載藥納米粒比游離藥物發(fā)揮了更好的抗分化乳腺細胞和乳腺癌干細胞的能力。體內(nèi)腫瘤抑制實驗表明載多西他賽納米粒和萊菔硫烷納米粒聯(lián)用后較游離藥物及聯(lián)用的游離藥物更有效，并且系統(tǒng)毒性小。體內(nèi)抗干細胞活性表明SFN的使用可以明顯的降低體內(nèi)干細胞的數(shù)量。
[0048]因此，本發(fā)明的載多西他賽和萊菔硫烷的PLGA-b-HA自組裝納米?？蛇_到同時靶向分化乳腺癌細胞核乳腺癌干細胞的作用。這是乳腺癌治療的一種新策略，利用納米載體的優(yōu)勢，再結(jié)合化療藥物和抗干細胞藥物的聯(lián)用效果，可以從其根源上治療乳腺癌，具有廣闊的運用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1是PLGA-b-HA嵌段共聚物的合成；[0050]其中A為末端丁二胺化的透明質(zhì)酸的合成；B為PLGA02H活潑酰亞胺酯的合成；C為PLGA-b-HA嵌段共聚物的合成。
[0051]圖2是溶劑透析法制備載藥的PLGA-b-HA自組裝納米粒。
[0052]圖3是PLGA-b-HA納米粒的表征；
[0053]其中A為PLGA-b-HA納米粒的水化粒徑分布圖；B，C為PLGA-b-HA納米粒在不同的放大倍率下的透射電鏡圖片；D，E為PLGA-b-HA的原子力顯微鏡圖片。
[0054]圖4是載藥PLGA-b-HA納米粒對分化乳腺癌細胞和乳腺癌干細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50);
[0055]其中Al和BI為48小時抑制曲線；A2和B2為72小時的抑制曲線。
[0056]圖5是載萊菔硫烷的PLGA-b-HA納米粒體外抗乳腺癌干細胞活性；
[0057]其中A，B分別為不同濃度的SFN和載SFN的PLGA-b-HA的納米粒對乳腺球的形成數(shù)量和大小的影響。
[0058]圖6是載多西他賽和萊菔硫烷的PLGA-b-HA納米粒聯(lián)用體外抗乳腺癌活性評價。
[0059]圖7是載多西他賽和萊菔硫烷的PLGA-b-HA納米粒聯(lián)用體內(nèi)抗瘤活性及系統(tǒng)毒性評價；
[0060]其中A為不同給 藥組的腫瘤生長曲線圖出為不同給藥組小鼠的體重變化(系統(tǒng)毒性評價);C為不同給藥組小鼠腫瘤離體圖片；D為不同給藥組治療34天后離體腫瘤的重量。
[0061]圖8是體內(nèi)抗干細胞活性評價；
[0062]其中A為經(jīng)游離藥物和載藥納米粒治療后離體腫瘤細胞再經(jīng)懸浮培養(yǎng)后形成乳腺球的數(shù)量。B，C分別為荷瘤小鼠經(jīng)不同給藥組治療后β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和細胞周期素Dl (Cyclin Dl)在腫瘤組織中的表達分析。
【具體實施方式】
[0063]以下結(jié)合附圖和具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0064]材料和儀器
[0065]PLGA(502Η, 13600Da),德國 Boehringer Ingelheim 公司；
[0066]透明質(zhì)酸(HA，5600Da)，山東福瑞達生物醫(yī)藥有限公司；
[0067]多西他賽原料藥(>98%)，上海瀚香生物科技有限公司；
[0068]D, L-萊菔硫燒(>90%),美國 Sigma-aIdrich 公司；
[0069]N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，上海阿拉丁試劑有限公司；
[0070]1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)，上海阿拉丁試劑有限公司；
[0071]堿性成纖細胞生長因子(bFGF),以色列prospec公司；
[0072]內(nèi)皮生長因子(EGF)、胰島素，以色列prospec公司；
[0073]胎牛血清、胰酶、青鏈雙抗、B27添加物，美國Gibico公司；
[0074]其他化學試劑均購自上海國藥集團；
[0075]杜氏磷酸緩沖液(D-PBS)，美國Thermo公司；
[0076]萬分之一電子天平AL104，梅特勒托利多公司；[0077]十萬分之一電子天平MS20OTU，梅特勒托利多公司；
[0078]數(shù)顯恒溫磁力攪拌器HJ-3，上海和欣科教設備有限公司；
[0079]透射電子顯微鏡JEM2100F，日本JEOL公司；
[0080]原子力顯微鏡Nanoscope IV,美國Veeco公司；
[0081]Zetasizer nano ZS激光粒度分析儀,英國馬爾文公司；
[0082]島津高效液相色譜儀LC-20A，日本島津公司。
[0083]實施例1: PLGA-b-HA嵌段共聚物的合成
[0084]在參考文獻“Jeong YI, Kim do H, Chung CW, Yoo JJ, ChoiKH,Kim CH,et al.Self-assembled nanoparticles of hyaluronic acid/poly (DL-lactide-co-glycolide)block copolymer.Colloids Surf BBiointerfaces2012; 90:28-35”的基礎(chǔ)上，采用還原胺化的方法將聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA和透明質(zhì)酸(HA)首位相連形成嵌段共聚物。
[0085]選擇型號為RG502H的PLGA和分子量為5600Da的HA作為載體的疏水和親水端。具體的制備方法為三步，如圖1所示:
[0086](I)末端胺化的HA的制備，精密稱量1.0g的HA溶解于30.0ml的醋酸/醋酸鈉(pH=5.6,2%w/w)的緩沖液中，待HA完全溶解后加入1.0ml的1，4- 丁二胺。50°C磁力攪拌24小時形成亞胺，其后加入0.2g的氰基硼氫化鈉，然后將pH值調(diào)節(jié)到弱堿性(pH=8.0)繼續(xù)于50°C磁力攪拌，并且在接下來連續(xù)兩天分別再加入0.2g的氰基硼氫化鈉。反應結(jié)束后，將反應溶液裝入透析袋中(Spectra/Por, MWC03500)，在去離子水中透析72小時，其中前24更換透析液6次其后每12h更換一次透析液。透析結(jié)束將袋內(nèi)溶液凍干待用。
[0087](2)NHS活化的PLGA的制備，精密稱取1.0g的PLGA502H溶解于IOml的二氯甲烷中，再分別加入48.0mg的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和80.0mg的1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl )。室溫下磁力攪拌24小時，反應結(jié)束后產(chǎn)物用冰冷的乙醚沉淀，再用冰冷的乙醚/甲醇混合液(50/50，v/v)沖洗三次以去除過量的NHS和EDC.HCl。然后將產(chǎn)物真空干燥待用。
[0088](3) PLGA-b-HA的合成，精密稱取0.5g的PLGA-NHS和0.35g的胺化的HA將其盡可能分散到20.0ml的DMSO中再加入20 μ I的N，N- 二異丙基乙胺，然后在50°C下攪拌48小時。反應結(jié)束后將該溶液裝入透析袋中(Spectra/Por, MWCO 12000-14000)，在去離子水中透析72小時，其中前24更換透析液6次其后每12h更換一次透析液。透析結(jié)束將袋內(nèi)溶液凍干即得PLGA-b-HA嵌段共聚物。
[0089]實施例2:載多西他賽和萊菔硫烷的PLGA-b-HA納米粒的制備
[0090]本發(fā)明在溶劑透析法(參見:ShahinM, Lavasanifar A.Novel self-associatingpoly (ethylene oxide)-bpoly(epsilon-caprolactone)based drug conjugates andnano-containers for paclitaxel delivery.1nt J Pharm2010; 389:213e22.)的基礎(chǔ)上做了相應的改良來制備載藥的PLGA-b-HA納米粒。溶劑透析法是直接將藥物和聚合物材料溶解于水溶性有機溶劑 ，然后在去離子水或者緩沖鹽中透析去除有機溶劑得到載藥納米粒，而我們修改后方法是:在溶解了藥物和聚合物材料的有機相中緩慢加入去離子水攪拌下形成載藥納米粒，然后再透析去除有機溶劑。這樣改進的目的是能提高藥物的載藥量(圖2)。利用該方法我們分別制備載多西他賽的PLGA-b-HA納米粒(DTX/NPs)和載萊菔硫烷的PLGA-b-HA 納米粒(SFN/NPs )。
[0091 ] DTX/NPs具體制備步驟:將IOmg的PLGA-b-HA嵌段聚合物和0.5mg的DTX溶解于Iml的DMS0/DMF( v/v=3:1)的混合溶劑中，磁力攪拌15分鐘讓材料和藥物盡可能的溶解。然后再緩慢的加入4.0ml的去離子水,繼續(xù)攪拌15min后將該溶液轉(zhuǎn)入到透析袋中(Spectra/Por，MWC012000-14000)，透析12小時除去有機溶劑，每兩小時換水一次。收集形成的載藥納米粒測定其粒徑，冷凍干燥后測載藥量和包封率。
[0092]SFN/NPs具體制備步驟:將IOmg的PLGA-b-HA嵌段聚合物和IOmg SFN溶解于Iml的DMSO/DMF (v/v=3:l)的混合溶劑中，磁力攪拌15分鐘讓材料和藥物盡可能的溶解。然后再緩慢的加入4.0ml的去離子水,繼續(xù)攪拌15min后將該溶液轉(zhuǎn)入到透析袋中(Spectra/Por，MWC012000-14000)，透析12小時除去有機溶劑，每兩小時換水一次。收集形成的載藥納米粒測定其粒徑，冷凍干燥后測載藥量和包封率。
[0093]通過溶劑透析發(fā)制備的PLGA-b-HA納米粒的水化粒徑為IlOnm (圖3A)，透射電鏡(圖3B和圖3C)和原子力顯微鏡(圖3D和圖3E)表明本發(fā)明制備的PLGA-b-HA納米粒為球形的，具備典型的核-殼結(jié)構(gòu)，其疏水內(nèi)核包載DTX和SFN提供必要的條件，而親水的外殼是主動靶向乳腺癌干細胞的配體。通過該實驗表明本發(fā)明制備的PLGA-b-HA自組裝納米粒具備明確的微觀結(jié)構(gòu)。
[0094]實施例3:載藥納米粒體外對乳腺癌和乳腺癌干細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)
[0095]本發(fā)明米用MTT法(參見TimMosmann,Rapid colorimetric assay for cellulargrowth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assays,Journal of Immunological Methods, , 1983,65 (1- 2): 55 - 6，3)評價載藥納米粒對乳腺癌和乳腺癌干細胞的體外細胞毒性，即IC5tl值。現(xiàn)在分別闡述對乳腺癌細胞(MCF-7)和乳腺癌干細胞(通過懸浮培養(yǎng)篩選)體外毒性的評價。
[0096]1.對乳腺癌的毒性評價:
[0097](I)對數(shù)生長期的MCF-7細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度至5 X IO4個/mL，以5000個/孔的密度接種于96孔板中，即每孔加入0.1ml的單細胞懸液，接種好的細胞于37°C，5%C02的條件下培養(yǎng)12h讓細胞貼壁。
[0098](2)含藥培養(yǎng)基的配置。
[0099]空白對照:培養(yǎng)基
[0100]陰性對照:細胞+培養(yǎng)基
[0101]實驗組:細胞+不同含藥培養(yǎng)基
[0102]按如下藥物濃度分別配置好含有游離藥物和載藥PLGA-b-HA納米粒的培養(yǎng)基。
[0103]DTX:50, 25，12.5，6.25，3.13，1.56，0.78，0.39，0.20nM
[0104]SFN:50, 40，30，25，20，12.5，6.25，3.13，1.56 μ M
[0105](3)待細胞貼壁后將培養(yǎng)基更換為含藥培養(yǎng)于37°C，5%C02的條件下培養(yǎng)48h，其后每孔加入20 μ I的MTT溶液(5mg/ml溶解于pH=7.4的PBS)再孵育4h。
[0106](4)小心去除96孔板的液體，每孔加入150 μ I的DMSO溶解形成的甲瓚，搖床上振搖10分鐘，以溶解紫色甲瓚結(jié)晶，使其充分溶解混勻，然后置于酶標儀于490nm測定各孔OD值。
[0107]細胞生存率(％)=(實驗組OD值一空白組OD值)/ (陰性對照組OD值一空白組OD值)X 100%O
[0108]2.對乳腺癌干細胞的毒性評價
[0109]對乳腺癌干細胞的毒性評價與乳腺癌類似，但由于干細胞的特性和其培養(yǎng)方式的不同(乳腺癌干細胞為懸浮細胞)操作步驟上略有差異。
[0110](I)成球生長的乳腺癌干細胞細胞，經(jīng)胰酶消化后，用PBS洗滌三次除去胰酶和血清等，調(diào)整細胞密度至5 X IO4個/mL，以5000個/孔的密度接種于96孔板中，即每孔加入0.1ml的單細胞懸液，接種好的細胞于37°C，5%C02的條件下培養(yǎng)12h讓細胞恢復良好的狀態(tài)。
[0111](2)含藥培養(yǎng)基的配置。
[0112]空白對照:培養(yǎng)基
[0113]陰性對照:細胞+培養(yǎng)基
[0114]實驗組:細胞+不同含藥培養(yǎng)基
[0115]按如下藥物濃度分別配置好含有游離藥物和載藥PLGA-b-HA納米粒的無血清培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基為最終濃度的兩倍濃度。
[0116]DTX:200, 100，50，25，12.5，6.25，3.13，1.56，0.78nM
[0117]SFN: 100，80，60，50，40，25，12.5，6.25，3.13，1.56 μ M [0118](3)待細胞孵育12小時恢復狀態(tài)后在原有的100 μ I的無血清培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加Λ?οομL的含藥培養(yǎng)基，使其最終藥物濃度均:
[0119]DTX:100, 50，25，12.5，6.25，3.13，1.56，0.78，0.39nM
[0120]SFN:50, 40，30，25，20，12.5，6.25，3.13，1.56 μ M
[0121]再于37°C，5%C02的條件下培養(yǎng)48h，其后每孔加入20 μ I的MTT溶液(上海生工生物工程公司生產(chǎn)，5mg/ml溶解于pH=7.4的PBS)再孵育4h。
[0122](4)將96孔板于3000轉(zhuǎn)下離心15分鐘，讓懸浮的細胞和甲瓚均離心到底部，小心除去老的培養(yǎng)基后每孔加入150 μ I的DMSO溶解形成的甲瓚，搖床上振搖10分鐘，以溶解紫色甲瓚結(jié)晶，使其充分溶解混勻，然后置于酶標儀于490nm測定各孔OD值。
[0123]以細胞生存率對藥物濃度作圖，得到乳腺癌和乳腺癌干細胞在不同處理組下的生存曲線圖，通過對數(shù)模擬曲線計算各藥物對乳腺癌及乳腺癌干細胞的IC5tl值
[0124]通過乳腺癌細胞及乳腺癌干細胞的生存曲線，可以初步確定載藥的PLGA-b-HA納米粒比游離的藥物具有更強的殺傷效果(圖4A和圖4B)。
[0125]經(jīng)對數(shù)模擬后計算的IC5tl值可以看出在48小時和72小時的時候載藥納米粒都顯示了更佳的療效，說明本發(fā)明的載藥PLGA-b-HA納米粒的確可以取得很好的乳腺癌和乳腺癌干細胞向效果(表1)。
[0126]表1:游離藥物和載藥納米粒對分化乳腺癌和乳腺癌干細胞的IC5tl值
[0127]
【權(quán)利要求】
1.一種載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒的制備方法，其特征在于，該制備方法包括以下步驟: A、PLGA-b-HA的嵌段共聚物的合成 HA的末端經(jīng)還原胺化形成丁二胺化的HA，然后再和PLGA的琥珀酰亞胺酯形成兩親嵌段共聚物； B、載藥PLGA-bHA納米粒的制備 將多西他賽、萊菔硫烷和步驟A制備得到的PLGA-b-HA嵌段聚合物同時溶解于v/v=3:l的DMSO/DMF混合溶劑中，磁力攪拌15分鐘；然后再緩慢的加入一定量的去離子水，繼續(xù)攪拌15min后將該溶液轉(zhuǎn)入到Spectra/Por，MWC012000-14000的透析袋中，透析12小時除去有機溶劑，每兩小時換水一次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒的制備方法，其特征在于，步驟A中，所述的聚乳酸-羥基乙酸共聚物的分子量為10000-35000Da。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒的制備方法，其特征在于，步驟A中，所述的聚乳酸-羥基乙酸共聚物的分子量為13600Da。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒的制備方法，其特征在于，步驟A中，所述的透明質(zhì)酸的分子量為3 000-10000Da。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒的制備方法，其特征在于，步驟A中，所述的透明質(zhì)酸的分子量為5600Dao
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒的制備方法，其特征在于，步驟A為: (I)末端胺化的HA的制備:按質(zhì)量比1:30將HA溶解于pH=5.6,2%w/w的醋酸/醋酸鈉緩沖液中，待HA完全溶解后加入1.0ml的1，4- 丁二胺；50°C磁力攪拌形成亞胺，其后加入五分之一于HA質(zhì)量的氰基硼氫化鈉，然后將pH值調(diào)節(jié)到弱堿性繼續(xù)于50°C磁力攪拌，并且在接下來連續(xù)兩天分別再加入同等質(zhì)量的氰基硼氫化鈉；反應結(jié)束后，將反應溶液裝入Spectra/Por, MWC03500的透析袋中，在去離子水中透析；透析結(jié)束將袋內(nèi)溶液凍干待用； ⑵NHS活化的PLGA的制備:按1:1Om/V的比例將PLGA溶解于二氯甲烷中，再分別加入5倍于PLGA摩爾質(zhì)量的N-羥基琥珀酰亞胺和1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫下磁力攪拌，反應結(jié)束后產(chǎn)物用冰冷的乙醚沉淀，再用冰冷的v/v為50/50的乙醚/甲醇混合液沖洗三次以去除過量的N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，然后將產(chǎn)物真空干燥待用； (3)PLGA-b-HA的合成:精密稱取一定量的PLGA-NHS和1.5倍于PLGA-NHS摩爾質(zhì)量的丁二胺化的HA將其盡可能分散到一定量的DMSO中最終使PLGA-NHS的含量為25 μ g/ml，再加入N，N- 二異丙基乙胺使其最終含量為I μ g/ml，然后在50°C下攪拌48小時，反應結(jié)束后將該溶液裝入Spectra/Por, MWC012000-14000的透析袋中，在去離子水中透析,透析結(jié)束將袋內(nèi)溶液凍干即得PLGA-b-HA嵌段共聚物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒的制備方法，其特征在于，步驟B為: 將PLGA-b-HA嵌段聚合物和DTX按重量比為20:1的比例，或?qū)LGA-b-HA嵌段聚合物和SFN按重量比為1:1的比例溶解于v/v=3:1的DMSO/DMF混合溶劑中，使PLGA-b-HA的最終濃度為5-10mg/ml，然后在磁力攪拌下緩慢加入4.0ml的去離子水，繼續(xù)攪拌將該溶液轉(zhuǎn)入到Spectra/Por, MWC012000-14000的透析袋中，透析除去有機溶劑。
8.—種如權(quán)利要求1-7任一方法制備得到的載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒。
9.一種如權(quán)利要求8所述的載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒在制備治療乳腺癌藥物中的應用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的載多西他賽和萊菔硫烷的透明質(zhì)酸修飾的聚乳酸羥基乙酸共聚物自組裝納米粒在制備治療乳腺癌藥物中的應用，其特征在于，該應用具體靶向已分化的乳腺癌 細胞和乳腺癌干細胞。
【文檔編號】A61P35/00GK103877066SQ201410060679
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】鐘延強, 黃景彬, 張翮, 魯瑩, 王新霞, 張國慶, 陳琰, 俞媛, 鄒豪, 劉俊杰, 孫治國, 陶春, 賈婷婷, 吳珊, 向婧潔 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學