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      苦豆子黃酮組合物的制備方法及醫(yī)藥新用途與流程

      文檔序號:12009433閱讀:457來源:國知局
      本發(fā)明涉及一種從苦豆子中提取藥物組合物的制備方法及本藥物組合物在制備α-糖苷酶抑制劑藥物及脂肪酶抑制劑藥物中的應(yīng)用,可用于預(yù)防和治療糖尿病及高血脂癥作用。本發(fā)明也涉及該藥物的藥物制劑,屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

      背景技術(shù):
      糖尿病、高血脂均為代謝性疾病,糖尿病常伴有脂代謝紊亂及高脂血癥。目前,代謝性疾病的發(fā)病率越來越高,可涉及心、腦、腎、肺、血管、神經(jīng)、皮膚、眼、耳、足等組織的慢性進行性病變,引起功能缺陷及衰竭,已經(jīng)嚴重威脅到人們的正常生活。長期高血糖、高血脂極易誘發(fā)糖尿病性心腦血管病變。α-葡萄糖苷酶抑制劑是通過競爭性抑制α-葡萄糖苷酶的活性,可阻滯雙糖水解為單糖,延緩糖的吸收,使血糖平穩(wěn)并緩慢的維持在一定的水平,防治餐后高血糖癥,同時還可以提高糖耐量,預(yù)防和治療肥胖癥,高三酰甘油血癥,用于治療應(yīng)碳水化合物紊亂而引起的疾病。脂肪酶抑制劑就是專門用來針對脂肪酶的降脂減肥藥。在脂肪酶抑制劑的作用下,脂肪酶將失去部分的分解能力,因而大約有三分之一的脂肪沒有被脂肪酶分解,隨食渣一起被排出體外。脂肪酶抑制劑就是它能將人攝入的部分脂肪在進入體血液之前就排出了體外,這樣可以從脂肪的源頭控制脂肪在人體內(nèi)的聚積。況且,目前還沒有副作用小療效確切的治療這兩種代謝性疾病的天然藥物。糖尿病及高血脂癥是近年來的常見病,本發(fā)明基于苦豆子中提取的藥物組合具有抑制α-葡萄糖苷酶及抑制脂肪酶的雙重作用,該組合物具有既可以降低血糖又可以防治高血脂癥的作用。本發(fā)明組合物是從豆科植物苦豆子SophoraalopecuroidesL.的干燥成熟種子提取分離得到??喽棺邮侵匾木S藥資源,主產(chǎn)于我國西北地區(qū),含有蛋白質(zhì)、糖類、有機酸、黃酮類、色素和生物堿等營養(yǎng)物質(zhì)。目前對苦豆子的研究主要集中在苦豆子生物堿方面,對黃酮研究較少。苦豆子民間用于治療胃脘痛,吞酸,或配蒲公英、生姜等藥用(《新疆中草藥手冊》),也可治療濕疹、頑癬;民間用根治療喉痛、咳嗽、痢疾及濕疹等;黃華專利報道了(公開號:CN101982171A)苦豆雙黃酮具有抗病毒及抗腫瘤活性;陳虹發(fā)明專利報道了(公開號:CN101480472B)由苦豆子、決明子、山楂、太子參、天麻組成的組合物具有降血脂作用;阿吉艾克拜爾·艾薩發(fā)明專利報道了(CN1640429A)苦豆子種子或地上部分正丁醇萃取物具有降血脂活性,本發(fā)明正丁醇萃取物是一種混合物,沒有明確具體的藥效物質(zhì),同時,也沒有明確降血脂機理,與本發(fā)明組合物具有明顯的不同。本發(fā)明是從苦豆子中提取的黃酮組合物,在本發(fā)明完成之前還沒有文獻報道關(guān)于從苦豆子提取的黃酮組合物的制備方法及具有抑制α-葡萄糖苷酶活性及抑制脂肪酶活性的報道。

      技術(shù)實現(xiàn)要素:
      發(fā)明目的是提供一種苦豆子黃酮組合物,用于預(yù)防和治療糖尿病及高血脂癥的作用。本發(fā)明對苦豆子的有效成分進行了研究,尋找到了活性更強、實用性強的有效部位,用于糖尿病及高血脂癥的預(yù)防和治療。更進一步地,本發(fā)明的發(fā)明人通過進一步的研究發(fā)現(xiàn),主要由黃酮類成分組成的組合物在抑制α-葡萄糖苷酶及抑制脂肪酶方面有很強的活性。這種天然的藥物組合物是本發(fā)明人首次通過實驗篩選得到,具有突出的貢獻及顯著的技術(shù)進步。本發(fā)明突出貢獻在于:從維藥資源苦豆子成熟種子中富集黃酮,得到苦豆子黃酮組合物,具有治療糖尿病及高血脂癥的作用。提供一種新藥用資源及新醫(yī)藥用途,這是本發(fā)明最突出的貢獻及最顯著的創(chuàng)新性。本發(fā)明目的之二是提供了苦豆子黃酮組合物提取分離方法,藥用部位利用乙醇提取,提取液直接通過大孔樹脂吸附純化,除去色素等脂溶性雜質(zhì)后,提取液及洗脫液經(jīng)過濃縮,析晶得到小分子黃酮化合物;水溶性黃酮、生物堿及其與水溶性雜質(zhì)經(jīng)過聚酰胺樹脂吸附純化,除去生物堿等水溶性雜質(zhì),得到大分子黃酮化合物,合并兩部分黃酮,得到本發(fā)明組合物,本發(fā)明制備方法沒有用有機試劑,可操作性強,又是本發(fā)明的創(chuàng)新點之一。本發(fā)明的另一目的是提供一種從苦豆子成熟種子中提取的黃酮組合物的制備方法,其特征在于:苦豆子種子破碎,先用4-10倍量藥材重量的40-75%的乙醇回流提取2-3次,每次2-3小時,濾過,濾液通過已處理好的大孔樹脂柱或聚酰胺柱,再用40-75%的乙醇洗脫4-6倍柱體積,收集流出液及洗脫液,回收乙醇,濃縮,離心,沉淀干燥得組分Ⅰ;上清液通過聚酰胺樹脂柱,先用水洗脫,再用40-75%的乙醇洗脫4-6倍柱體積,收集乙醇洗脫液,濃縮,干燥得組分Ⅱ;合并組分Ⅰ與組分Ⅱ,得苦豆子黃酮組合物。優(yōu)選最佳制備工藝:苦豆子種子破碎,先用6倍量藥材重量的65%的乙醇回流提取2-3次,每次2-3小時,濾過,濾液通過已處理好的D101大孔樹脂柱,再用65%的乙醇洗脫4-6倍柱體積,收集流出液及洗脫液,回收乙醇,濃縮,離心,沉淀干燥得組分Ⅰ;上清液通過聚酰胺樹脂柱,先用水洗脫,再用70%的乙醇洗脫4倍柱體積,收集乙醇洗脫液,濃縮,干燥得組分Ⅱ;合并組分Ⅰ與組分Ⅱ,得苦豆子黃酮組合物。本發(fā)明的另一突出貢獻在于,提供一種具有抑制α-葡萄糖苷酶活性及抑制脂肪酶活性的藥物組合物,其特征在于:組合物中總黃酮含量不低于80%。為實現(xiàn)以上技術(shù)方案,苦豆子黃酮組合物總黃酮含量通過以下方法測定:對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品10mg,置100ml量瓶中,用甲醇溶解,并稀釋至刻度,搖勻,精密量取5ml置10ml量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。供試品溶液的制備取苦豆子黃酮組合物粉末,精密稱定50mg,至50ml容量瓶中,加甲醇適量,超聲處理20min,取出,放置室溫,加甲醇定容至刻度,搖勻,取2ml至25ml容量瓶中,加甲醇定容至刻度即得。測定法分別取對照品溶液、供試品溶液、隨行空白。照分光光度法(《中國藥典》2010年版一部附錄VB),在波長340nm處分別測定吸收度,計算??喽棺狱S酮組合物(簡稱組合物)具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性及抑制脂肪酶活性,通過以下藥效學(xué)實驗得到證實。實驗原料:本藥效學(xué)中用到的組合物為本發(fā)明人提供,按照實例1制備而成。本藥效學(xué)試驗中用到的奧利司他膠囊為浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(批號為:20130302);阿卡波糖為拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)(批號:20130905)。本藥效學(xué)試驗用的α-葡萄糖苷酶為sigma公司生產(chǎn)(G5003-100UN);大鼠腸內(nèi)粘膜酶自制;脂肪酶為北京凱泰新世紀生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。1、苦豆子黃酮組合物對α-糖苷酶的抑制作用1.1標準反應(yīng)體系67mmol/LpH為6.8磷酸鉀緩沖液150uL,1mg/mL谷胱甘肽溶液50μL,2.5U/mLα-葡萄糖苷酶溶液100μL,37℃保溫10min,20mmol/LPNPG溶液100ul,37℃反應(yīng)20min后加入0.2mol/LNa2CO3溶液400uL終止反應(yīng),測定400nm處光吸收值。樣品對酶活性的抑制率計算公式:抑制率(%)=(A對照-A樣品)/A對照×100%1.2拜糖平對α-葡萄糖苷酶活性的影響取研磨后的拜糖平配制成50mg/ml的原溶液,并以此稀釋成10.0,5.0,2.5,1.0,0.2,0.1,0.05mg/ml不同濃度。將100ul拜糖平加入到酶反應(yīng)體系中,先與酶在37℃保溫10min,再加底物反應(yīng)20min,用Na2CO3溶液終止反應(yīng),測定400nm處吸光值。1.3苦豆子黃酮組合物對α-葡萄糖苷酶活性的影響組合物用二甲基亞砜溶解,然后用緩沖液稀釋至5.0,2.5,1.0,0.5,0.25,0.1,0.05mg/ml,二甲基亞砜于反應(yīng)體系中終含量﹤1%。將100ul組合物加入到反應(yīng)體系中,測定組合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。實驗結(jié)果見表1。表1苦豆子黃酮組合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用結(jié)果表明,拜糖平對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用具有良好的量效關(guān)系。組合物在濃度為5.0,2.5,1.0,0.5,0.25,0.1,0.05mg/ml條件下,對α-葡萄糖苷酶的抑制作用存在良好的量效關(guān)系,組合物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用是陽性藥拜糖平的2倍以上,對α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出非常強的抑制作用。2、苦豆子黃酮組合物對大鼠腸內(nèi)粘膜酶的抑制作用2.1大鼠腸內(nèi)粘膜酶的提取取正常大鼠1只,處死后,立即取出小腸,洗凈內(nèi)容物,按質(zhì)量體積比1:3加入4℃預(yù)冷的0.1mol/L,pH=6.8PBS,勻漿,4℃、8000rpm,離心20分鐘,取上清液分裝入EP管中,-20℃冷凍備用。2.2苦豆子黃酮組合物對大鼠腸內(nèi)粘膜酶的抑制作用2.2.1標準反應(yīng)體系67mmol/LpH為6.8磷酸鉀緩沖液150uL,1mg/mL谷胱甘肽溶液50μL,大鼠腸內(nèi)粘膜酶溶液100μL,37℃保溫10min,20mmol/LPNPG溶液100ul,37℃反應(yīng)20min后加入0.2mol/LNa2CO3溶液400uL終止反應(yīng),測定400nm處光吸收值。樣品對酶活性的抑制率計算公式:抑制率(%)=(A對照-A樣品)/A對照×100%2.2.2拜糖平對大鼠腸內(nèi)粘膜酶活性的影響取研磨后的拜糖平配制成50mg/ml的原溶液,并以此稀釋成10.0,5.0,2.5,1.0,0.2,0.1,0.05mg/ml不同濃度。將100ul拜糖平加入到酶反應(yīng)體系中,先與酶在37℃保溫10min,再加底物反應(yīng)20min,用Na2CO3溶液終止反應(yīng),測定400nm處光吸收值。2.2.3苦豆子黃酮組合物對大鼠腸內(nèi)粘膜酶活性的影響組合物用二甲基亞砜溶解,然后用緩沖液稀釋至5.0,2.5,1.0,0.5,0.25,0.1,0.05mg/ml,二甲基亞砜于反應(yīng)體系中終含量﹤1%。將100ul組合物加入到反應(yīng)體系中,測定組合物對大鼠腸內(nèi)粘膜酶的抑制作用。實驗結(jié)果見表2。表2苦豆子黃酮組合物對大鼠腸內(nèi)粘膜酶的抑制作用結(jié)果表明,拜糖平對大鼠腸內(nèi)粘膜酶活性的抑制作用具有良好的量效關(guān)系。組合物在濃度為5.0,2.5,1.0,0.5,0.25,0.1,0.05mg/ml條件下,對大鼠腸內(nèi)粘膜酶的抑制作用存在良好的量效關(guān)系,組合物對大鼠腸內(nèi)粘膜酶活性的抑制作用是陽性藥拜糖平的2倍以上,對大鼠腸內(nèi)粘膜酶表現(xiàn)出非常強的抑制作用。3、苦豆子黃酮組合物對脂肪酶的抑制作用3.1脂肪酶抑制活性的測定在100mL錐形瓶中加入5mL0.025mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)和4mL聚乙烯醇三油酸甘油酯底物乳化液(0.229g/mL),置于37℃水浴保溫10min,然后加入1mL酶液(2mg/mL),之后再反應(yīng)15min,加95%乙醇15mL終止酶反應(yīng)。加酚酞2滴,用0.025mol/LNaOH標準溶液滴定至微紅色??瞻讓嶒灥拿敢涸诜磻?yīng)終止后加入。3.2陽性對照藥奧利司他對脂肪酶抑制作用在100mL錐形瓶中加入5mL0.025mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)和4mL聚乙烯醇三油酸甘油酯底物乳化液(0.229g/mL),分別加入濃度為5.0,2.5,1.0,0.5,0.25,0.1,0.05mg/ml的陽性對照藥1mL,置于37℃水浴保溫10min,然后加入1mL酶液(2mg/mL),之后再反應(yīng)15min,加95%乙醇15mL終止酶反應(yīng)。加酚酞2滴,用0.025mol/LNaOH標準溶液滴定至微紅色。3.3苦豆子黃酮組合物對脂肪酶抑制作用在100mL錐形瓶中加入5mL0.025mol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)和4mL聚乙烯醇三油酸甘油酯底物乳化液(0.229g/mL),分別加入濃度為5.0,2.5,1.0,0.5,0.25,0.1,0.05mg/ml的苦豆子黃酮組合物1mL,置于37℃水浴保溫10min,然后加入1mL酶液(2mg/mL),之后再反應(yīng)15min,加95%乙醇15mL終止酶反應(yīng)。加酚酞2滴,用0.025mol/LNaOH標準溶液滴定至微紅色。抑制率=×100%表3苦豆子黃酮組合物對脂肪酶的抑制作用結(jié)果表明,奧利司他對脂肪酶的抑制作用具有良好的量效關(guān)系。組合物在濃度為5.0,2.5,1.0,0.5,0.25,0.1,0.05,條件下,對脂肪酶的抑制作用存在良好的量效關(guān)系,組合物對脂肪酶活性的抑制作用較陽性藥奧利司他弱。實施例本發(fā)明是通過如下的實驗施例得以實現(xiàn)(證實),但不僅限于本實例。實例1苦豆子黃酮組合物的制備方法苦豆子種子10kg破碎,先用6倍量藥材重量的65%的乙醇回流提取3次,每次2小時,濾過,濾液通過已處理好的D101大孔樹脂柱,再用65%的乙醇洗脫5倍柱體積,收集流出液及洗脫液,回收乙醇,濃縮,離心,沉淀干燥得組分Ⅰ;上清液通過聚酰胺樹脂柱,先用水洗脫5倍柱體積,再用70%的乙醇洗脫4倍柱體積,收集乙醇洗脫液,濃縮,干燥得組分Ⅱ;合并組分Ⅰ與組分Ⅱ,得苦豆子黃酮組合物295g,總黃酮含量為86.2%。實例2苦豆子黃酮組合物的制備方法苦豆子種子10kg破碎,先用8倍量藥材重量的60%的乙醇回流提取2次,每次2小時,濾過,濾液通過已處理好的D101大孔樹脂柱,再用60%的乙醇洗脫5倍柱體積,收集流出液及洗脫液,回收乙醇,濃縮,離心,沉淀干燥得組分Ⅰ;上清液通過聚酰胺樹脂柱,先用水洗脫4倍柱體積,再用80%的乙醇洗脫4倍柱體積,收集乙醇洗脫液,濃縮,干燥得組分Ⅱ;合并組分Ⅰ與組分Ⅱ,得苦豆子黃酮組合物268g,總黃酮含量為83.7%。實施例3(膠囊劑)組合物原料100g,藥用淀粉適量,混合均勻,制粒,干燥,整粒,裝入1號膠囊,制成1000粒,即得。每次3粒、每日2次。實施例4(片劑)組合物原料100g,藥用淀粉適量,糊精適量,混合均勻,制粒,干燥,整粒,干燥,加入潤滑劑適量,壓片,制成1000片,即得。每次3片、每日2次。
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