本發(fā)明屬于獸用疫苗領(lǐng)域，具體涉及預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,prrsv)引起的以母豬發(fā)熱、流產(chǎn)，斷奶前、后的仔豬死亡率升高，不同年齡豬呼吸障礙等為臨床特征的疾病。該病最早發(fā)現(xiàn)于美國的北卡羅來納州(1987年)，此后相繼在加拿大(1998年)、德國(1990年)、英國(1991年)發(fā)現(xiàn)此病。1992年國際獸醫(yī)局(oie)將此病命名為豬繁殖與呼吸綜合征(prrs)。我國于1996年也報道了此病的流行，2006年更是爆發(fā)了變異的高致病性prrsv引起的豬繁殖與呼吸綜合征，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。近一年來，多地區(qū)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有新的prrsv流行，與以往的流行株相比，其基因序列發(fā)生較大改變。而現(xiàn)有的疫苗在臨床上的預(yù)防效果不甚理想，而且，新的prrsv流行株與高致病性prrsv混合感染，造成臨床上病情的復(fù)雜性，因此，需要研發(fā)出針對我國最新臨床情況的疫苗組合物，以有效防止我國新的豬繁殖與呼吸綜合征的流行。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗組合物，所述疫苗組合物由豬繁殖與呼吸綜合征病毒株制得，該豬繁殖與呼吸綜合征病毒株制得的疫苗組合物可以對流行野毒株提供 有效的免疫保護，顯示出顯著的免疫特性。本發(fā)明的一個方面在于提供一種用于預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株的抗原以及高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原，以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的一個方面在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法，其中，所述方法包括：分別增殖培養(yǎng)所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株和豬繁殖與呼吸綜合征病毒超強變異株nvdc-jxa1株，滅活，加入佐劑，攪拌均勻；其中，所述增殖培養(yǎng)所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒的步驟為將豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗株接種于各自的易感細胞，并培養(yǎng)所述接種后的易感細胞，收獲細胞培養(yǎng)物；所述易感細胞包括傳代細胞系和原代細胞，所述傳代細胞系包括st細胞系、非洲綠猴腎細胞marc-145細胞系、牛腎細胞mdbk細胞系、牛鼻甲骨細胞bt細胞系、vero細胞系、bhk-21細胞系、豬腎傳代細胞系ibrs-2、兔腎傳代細胞系rk，所述原代細胞包括雞胚成纖維細胞、pam細胞和豬腎細胞。本發(fā)明的一個方面在于提供所述的疫苗組合物在制備預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應(yīng)用。發(fā)明優(yōu)點本發(fā)明采用目前豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行毒株及豬繁殖與呼吸綜合征病毒超強變異株，制備混合疫苗，具有良好的免疫原性，接種豬只后，能夠刺激機體快速地產(chǎn)生免疫力，產(chǎn)生較高的中和抗體水平。本發(fā)明制備的混合疫苗能夠有效地保護流行毒株及變異株引起的單感染或混合感染的現(xiàn)象，可以有效地保護豬群抵抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行毒株引起的相關(guān)疾病，提高豬群的生產(chǎn)力。序列表中：序列1為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株nsp2基因核苷酸序列；序列2為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株gp2蛋白核苷酸序列；序列3為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株gp5蛋白核苷酸序列；序列4為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株gp5蛋白氨基酸序列。具體實施方式以下，對本發(fā)明的實施方式進行說明。本發(fā)明的一個方面在于提供一種用于預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的疫苗組合物，其中，所述疫苗組合物包括免疫量的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株的抗原以及高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原，以及藥學(xué)上可接受的載體。豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,strainhnjz15)保藏號為：cctccno.v201540，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢·武漢大學(xué)，保藏時間為2015年9月21日。該豬繁殖與呼吸綜合征病毒株具有序列表seqno.1所示核苷酸序列編碼的nsp2基因，具有序列表seqno.2所示核苷酸序列編碼的gp2蛋白，具有序列表seqno.3所示核苷酸序列編碼的gp5蛋白，所述序列表seqno.3所示核苷酸序列編碼序列表seqno.4所示的蛋白?！昂塑账嵝蛄小痹诒旧暾堉惺侵敢环Ndna序列，其能夠被轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的rna序列。prrsv是正鏈rna病毒，其基因的編碼序列為dna，其能夠被轉(zhuǎn)錄成正鏈rna,該正鏈rna與病毒本身的基因組中的序列相同。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株的抗原包括豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物的滅活抗原、減毒抗原、亞單位抗原或合成肽抗原。“培養(yǎng)物”是病毒的不同代次傳代培養(yǎng)物，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉不同代次之間其基因序列僅可能會發(fā)生微小的變異?！耙呙缃M合物”系指含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒免疫原性的藥物組合物。該藥物組合物可誘發(fā)、刺激或增強豬只針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的免疫反應(yīng)。疫苗組合物包括免疫量的豬繁殖與呼吸綜合征病毒 株的滅活疫苗?！皽缁羁乖?，也稱作失活抗原，指的是用作抗原以產(chǎn)生免疫力的滅活病毒的混懸液。滅活抗原的例子包括全病毒滅活抗原和裂解型抗原。使用已知方法可以很容易地產(chǎn)生滅活抗原。例如，通過用甲醛溶液處理病毒可獲得全病毒滅活抗原。裂解型抗原可在用醚處理后由病毒包膜制備得到?！皽p毒抗原”指的是以毒力已經(jīng)減弱但仍可在宿主體內(nèi)或細胞上復(fù)制的病毒。本發(fā)明所用的術(shù)語“減毒”用于指以使病原喪失致病性、但保持免疫原性的方式對基因進行突變來人工降低病原體毒性。通常，通過uv輻射、化學(xué)處理或體外連續(xù)高階繼代培養(yǎng)實現(xiàn)減毒。人工的基因改變，例如將已知序列中的特定核苷酸缺失以使毒力減弱。“亞單位抗原”指的是利用基因工程方法將病原體的保護性抗原基因克隆到原核或真核表達系統(tǒng)中，使其高效表達而制成的抗原。它比全病毒抗原引起副反應(yīng)的可能性小。“合成肽抗原”指的是一種僅含免疫決定簇組分的小肽,即用人工方法按天然蛋白質(zhì)的氨基酸順序合成保護性短肽,與載體連接后加佐劑所制成的抗原。本發(fā)明的組合物的成分或組分的量優(yōu)選地是治療有效量。所述治療有效量是指在組合物施用的宿主中發(fā)揮它們的免疫學(xué)作用而不導(dǎo)致過度副作用所必需量。所用的成分和待施用的組合物的精確的量將根據(jù)因素如治療的疾病的類型，待治療的動物的類型和年齡，施用的方式，以及組合物中的其它成分而變化。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原為nvdc-jxa1株抗原、nvdc-jxa1-r株抗原、tjm株抗原、tj株抗原、gd株抗原、gdr株抗原、hun4株抗原、hun4-f112株抗原。高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株公開于中國專利申請cn101045917a；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1-r株公開于中國專利申請cn101307305a；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒tjm株和tj株公開于中國專利申請cn101633909a；高致病性豬 繁殖與呼吸綜合征病毒gd株和gdr株公開于中國專利申請cn102304496a；高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒hun4株和hun4-f112株公開于中國專利申請cn101280292a。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株的抗原為hnjz15株或其培養(yǎng)物的滅活抗原，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原為nvdc-jxa1株或其培養(yǎng)物的滅活抗原。優(yōu)選地，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原為滅活抗原。優(yōu)選地，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原為全病毒滅活抗原，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒全病毒滅活抗原選自豬繁殖與呼吸綜合征病毒超強變異株nvdc-jxa1，公開于中國專利申請cn101045917a。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株的抗原含量為滅活前≥106.0tcid50/ml的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物滅活抗原，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原為滅活前≥106.0tcid50/ml的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒或其培養(yǎng)物的滅活抗原。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株的抗原含量為滅活前106.0～108.0tcid50/ml的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物滅活抗原，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原為滅活前106.0～108.0tcid50/ml的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒或其培養(yǎng)物的滅活抗原。作為本發(fā)明的一種最優(yōu)選實施方式，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株的抗原含量為滅活前107.0tcid50/ml的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物滅活抗原，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原為滅活前107.0tcid50/ml的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒或其培養(yǎng)物的滅活抗原。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述疫苗組合物包括滅活前≥106.0tcid50/ml的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物滅活抗原，以及滅活前≥106.0tcid50/ml的豬繁殖與呼吸綜合征病毒超強變異 株nvdc-jxa1株或其培養(yǎng)物滅活抗原。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述疫苗組合物包括滅活前106.0～108.0tcid50/ml的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物滅活抗原，以及滅活前106.0～108.0tcid50/ml的豬繁殖與呼吸綜合征病毒超強變異株nvdc-jxa1株或其培養(yǎng)物滅活抗原。作為本發(fā)明的一種最優(yōu)選實施方式，所述疫苗組合物包括滅活前107.0tcid50/ml的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株或其培養(yǎng)物滅活抗原，以及滅活前107.0tcid50/ml的豬繁殖與呼吸綜合征病毒超強變異株nvdc-jxa1株或其培養(yǎng)物滅活抗原。當(dāng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒以少于106.0tcid50的量使用時，疫苗不能有效刺激抗體產(chǎn)生。另一方面，超過的量可能是不經(jīng)濟的。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述藥學(xué)上可接受的載體包括佐劑，所述佐劑包括白油、德雷克油(drakeoil)，以及其他動物油、植物油或礦物油；或氫氧化鋁、磷酸鋁及其它金屬鹽；montanidetmgel、卡波姆、角鯊?fù)榛蚪酋徬?、isa206佐劑、皂苷、油包水乳劑、水包油乳劑、水包油包水乳劑。本發(fā)明的疫苗組合物可使用本領(lǐng)域公知技術(shù)來調(diào)配，優(yōu)選為獸藥學(xué)上可接受的載體一起調(diào)配。例如，油可有助于穩(wěn)定調(diào)配物，且另外充當(dāng)疫苗佐劑。因此，本發(fā)明中，所述可藥用疫苗佐劑包括油佐劑，其選自白油、角鯊?fù)榛蚪酋徬?、德雷克?drakeoil)，以及其他動物油、植物油或礦物油。上述油佐劑既可以是來源，也可以是經(jīng)過人工合成獲得的。本發(fā)明中，所述疫苗組合物為水包油乳液、油包水乳液或雙重乳液，所述雙重乳液通常表現(xiàn)為水包油包水乳液。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述疫苗組合物還包括助懸劑、表面活性劑、抗原滅活劑或防腐劑。所述助懸劑可包括，例如，硬脂酸鋁，以及所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
可用的其他助懸劑。所述表面活性劑可包括，例如，脫水山犁醇單油酸酯(tween系列)，司本(span)，以及所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
可用的其他表面活性劑。所述抗原滅活劑包括(但不限于)，例如福爾馬林、β－丙內(nèi)酯等等。所述防腐劑包括，例如硫柳汞。上述物質(zhì) 的使用方法及用量均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。基于油佐劑會對動物體帶來一定的副反應(yīng)，還可以選擇本領(lǐng)域的其它佐劑，包括氫氧化鋁、磷酸鋁及其它金屬鹽，來制備混懸液，減少免疫刺激。本發(fā)明的一個方面是提供一種制備所述疫苗組合物的方法，其中，所述方法包括：分別增殖培養(yǎng)所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株和豬繁殖與呼吸綜合征病毒超強變異株nvdc-jxa1株，滅活，加入佐劑，攪拌均勻；其中，所述增殖培養(yǎng)所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒的步驟為將豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗株接種于各自的易感細胞，并培養(yǎng)所述接種后的易感細胞，收獲細胞培養(yǎng)物；所述易感細胞包括傳代細胞系和原代細胞，所述傳代細胞系包括st細胞系、非洲綠猴腎細胞marc-145細胞系、牛腎細胞mdbk細胞系、牛鼻甲骨細胞bt細胞系、vero細胞系、bhk-21細胞系、豬腎傳代細胞系ibrs-2、兔腎傳代細胞系rk，所述原代細胞包括雞胚成纖維細胞、pam細胞和豬腎細胞。具體地，所述方法為：(1)將豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗株接種于各自的易感細胞，并培養(yǎng)所述接種后的易感細胞；收獲細胞培養(yǎng)物；(2)用甲醛溶液、bpl(β-丙內(nèi)酯)或bei(二乙烯亞胺)處理來自步驟(1)的病毒；所述易感細胞可以是傳代細胞系，也可以是原代細胞。適合于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的易感細胞包括但不限于，st細胞系(atcc編號：crl-1746)、pk-15細胞系(atcc編號：ccl-33)、非洲綠猴腎細胞marc-145細胞系(atcc編號：crl-12219)、牛腎細胞mdbk細胞系(atcc編號：ccl-22)、牛鼻甲骨細胞bt細胞系(atcc編號：crl-1390)、vero細胞系(atcc編號：ccl-81)、bhk-21細胞系(atcc編號：ccl-10)、豬腎傳代細胞系(如：ibrs-2，見例如，decastro，m.p.1964.behavioroffootandmouthdiseasevirusincellculture：susceptibilityoftheib-rs-2swinecellline.arquivosinstitutobiologica31：63-78)、兔腎傳代細胞系(rk，如：atcc編號：ccl-106)等傳代細胞系，或者雞胚成纖維細胞、pam細胞和豬腎細胞等原代細胞。原代細胞 可以通過本領(lǐng)域公知的方法，用動物體內(nèi)的組織進行分離和制備。可將根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物制備成口服劑型或非口服劑型。優(yōu)選的是可通過皮內(nèi)、肌肉、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或硬腦膜外途徑給予的非口服劑型。本發(fā)明的一個方面是提供所述的疫苗組合物在制備預(yù)防豬繁殖與呼吸綜合征的藥物中的應(yīng)用?！邦A(yù)防”指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染或推遲疾病發(fā)作的所有行為。“治療”指通過給予根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物使豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染引起的癥狀減輕或好轉(zhuǎn)的所有行為。“豬繁殖與呼吸綜合征”指prrsv感染豬后引起的一系列生理和病理的癥狀。這些癥狀包括，但不限于，發(fā)熱、嗜睡、食欲不振、倦怠、呼吸困難、咳嗽、母豬繁殖障礙、仔豬生長緩慢、死亡等。下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。本發(fā)明中的術(shù)語“頭份”是指每頭豬注射的疫苗量。本發(fā)明中所述的“tcid50”(50％tissuecultureinfectivedose)是指半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量，是表示病毒感染力的一種表示方式。dmem液體培養(yǎng)基(液)用購自美國lifetechnologies公司的dmem干粉培養(yǎng)基按照其說明書配制。本發(fā)明的dmem培養(yǎng)基參照gb/t18641-2002附錄a配制方法配制。本發(fā)明中所述的“pbs”是指磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline)的英文縮寫，本發(fā)明中使用的是0.01mm的ph7.4的pbs，按《分子克隆》第三版所述配制。實施例1病毒的采集分離從來自河南的疑似豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的樣本中分離，無菌采集豬扁桃體淋巴組織，以1∶10(體積比)加入dmem培養(yǎng)液，研磨，制備組織懸液，經(jīng)反復(fù)3次凍融后，12000r/min離心15min，收集上清液，再經(jīng)0.22μm濾膜濾器過濾，在pam細胞上傳代37℃培養(yǎng)1h，換加含2％犢牛血清的dmem培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)5日。收獲含毒培養(yǎng)液，經(jīng)2次凍融后，收毒，換加含2％犢牛血清的dmem培養(yǎng)液。采用豬繁殖與呼吸綜合征病毒pcr檢測試劑盒(北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司)檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒，結(jié)果為陽性；對分離的病毒利用利用pcr試劑盒進行外源病毒的檢測，分別檢測豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒、豬瘟病毒，(豬偽狂犬病病毒rt-pcr檢測試劑盒、豬細小病毒pcr檢測試劑盒、豬瘟病毒rt-pcr檢測試劑盒均為北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公產(chǎn)品)，pcr檢測結(jié)果均為陰性，表明毒種純凈。將分離到的豬繁殖與呼吸綜合征病毒命名為hnjz15株，提交保藏。實施例2分離病毒的遺傳特性通過基因分析來確定實施例1中分離的病毒的遺傳特性。利用在pam細胞上分離的豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組做模板，反轉(zhuǎn)錄成cdna，使用表1所示的引物進行pcr。分別使用primerpremier5.0來設(shè)計用于擴增gp5、gp2、nsp2基因的引物序列。pcr擴增體系如下：模板cdna1μl，primerstarhsdnapolymerase(2.5u/μl)0.5μl，5×primestartmbuffer10μl，上下游引物各1μl(10pmol/μl)，dntpmix(2.5mmeach)4μl，并用ddh2o將體積補足50μl。進行兩步pcr反應(yīng)：在98℃2min；98℃10s，55℃1min，72℃1mim/kb，30cycles；72℃5min。通過在含有溴化乙錠的1％的瓊脂糖凝膠上進行電泳分析所得的pcr產(chǎn)物。pcr產(chǎn)物進行序列測定。豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株gp5核苷酸序列如seqno.1所示，gp2核苷酸序列如seqno.3所示，nsp2核苷酸序列如seqno.4所示。表1pcr引物序列實施例3商品化疫苗對豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株的免疫保護試驗將43日齡prrsv抗原抗體陰性仔豬15頭隨機分成3組，5頭/組，按照表2注射疫苗，對照組接種dmem培養(yǎng)基2ml/頭。商品化活疫苗由豬繁殖與呼吸綜合征病毒jxa1-r株制備，病毒含量為106.0tcid50/ml；商品化滅活疫苗由豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株制備，病毒含量為滅活前106.0tcid50/ml。表2商品化疫苗的免疫保護試驗動物分組組別注射疫苗免疫劑量1商品化活疫苗2ml/頭2商品化滅活疫苗2ml/頭3dmem培養(yǎng)基2ml/頭免疫后28日攻毒，攻毒劑量為豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株 病毒105.0tcid50/頭，觀察臨床癥狀見表3，攻毒后每日測定仔豬體溫。表3商品化疫苗免疫仔豬后的攻毒情況表3結(jié)果顯示，用現(xiàn)有的商品化豬繁殖與呼吸綜合征病毒活疫苗及滅活疫苗免疫仔豬，均不能完全阻斷病毒感染，只能提供部分保護作用，而對照組仔豬攻毒后全部出現(xiàn)臨床癥狀；進一步通過剖檢發(fā)現(xiàn)，免疫商品化活疫苗和滅活疫苗組剖檢后依然存在不同程度的肺病變。實施例4豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗原的制備將實施例1中分離到的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株培養(yǎng)物接種于pam細胞，按照病毒培養(yǎng)液量的1％(v/v)接入形成單層的pam細胞培養(yǎng)物中，置37℃培養(yǎng)，當(dāng)病變達到80％時，收獲含毒細胞培養(yǎng)液，經(jīng)2次凍融后，收毒，測定毒價。加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的終濃度為0.2％(v/v)，37℃滅活18小時，每4小時攪拌1次，每次攪拌10min，滅活完全后備用。將豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株(公開于中國專利申請cn101045917a)培養(yǎng)物接種于marc-145細胞，按照病毒培養(yǎng)液量的1％(v/v)接入形成單層的marc-145細胞培養(yǎng)物中，置37℃培養(yǎng)，當(dāng)病變達到80％時，收獲含毒細胞培養(yǎng)液，經(jīng)2次凍融后，收毒，測定毒價。加入10％(v/v)甲醛溶液使甲醛的終濃度為0.2％(v/v)，37℃滅活18小時，每4小時攪拌1次，每次攪拌10min，滅活完全后備用。實施例5豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物的制備將實施例4制備的豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株滅活抗原與nvdc-jxa1株滅活抗原按比例混合，再與206佐劑(法國seppic公司產(chǎn)品)按照體積比50:50混合，在30℃條件下120轉(zhuǎn)/分鐘攪拌15分鐘。具體配比見表4。表4豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物配比實施例6豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物免疫原性試驗將43日齡prrsv抗原抗體陰性仔豬45頭隨機分成9組，5頭/組，按照表5注射疫苗，對照組接種dmem培養(yǎng)基2ml/頭。表5免疫原性試驗動物分組組別注射疫苗免疫劑量4疫苗12ml/頭5疫苗12ml/頭6疫苗22ml/頭7疫苗22ml/頭8疫苗32ml/頭9疫苗32ml/頭10dmem培養(yǎng)基2ml/頭11dmem培養(yǎng)基2ml/頭12dmem培養(yǎng)基2ml/頭免疫后28天攻毒，第4組、第6組、第8組和第10組用豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株攻毒，第5組、第7組、第9組和第11組用豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株攻毒，攻毒劑量均為105.0tcid50/頭，觀察臨床癥狀見表6，攻毒后每日測定仔豬體溫見表7。表6豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物免疫仔豬后的攻毒情況表7豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物免疫仔豬攻毒后體溫變化表6和表7的結(jié)果顯示，本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物免疫仔豬，能阻斷病毒感染(出現(xiàn)臨床癥狀)，為仔豬提供100％(5/5)保護，而攻毒對照仔豬攻毒后全部出現(xiàn)臨床癥狀，部分豬只死亡，因此，本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物無論對新的流行株還是高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒均具有很好的保護力。實施例7豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物免疫原性對比試驗將43日齡prrsv抗原抗體陰性仔豬35頭隨機分成7組，5頭/組，按照表8注射疫苗，對照組接種dmem培養(yǎng)基2ml/頭。表8免疫原性對比試驗動物分組組別注射疫苗免疫劑量13疫苗22ml/頭14疫苗22ml/頭15疫苗42ml/頭16疫苗52ml/頭17dmem培養(yǎng)基2ml/頭18dmem培養(yǎng)基2ml/頭19dmem培養(yǎng)基2ml/頭免疫后28天攻毒，第13組、第15組和第17組用豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株攻毒，第14組、第16組和第18組用豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株攻毒，攻毒劑量均為105.0tcid50/頭，觀察臨床癥狀見表9，攻毒后每日測定仔豬體溫見表10。表9免疫原性對比試驗攻毒情況結(jié)果顯示，本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物免疫仔豬，無論是用hnjz15株攻毒，還是用nvdc-jxa1株攻毒，均能阻斷病毒感染(出現(xiàn)臨床癥狀)，為仔豬提供100％(5/5)保護；豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株單苗亦能阻斷hnjz15株攻毒病毒感染(出現(xiàn)臨床癥狀)，為仔豬提供100％(5/5)保護；而豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株單苗不能完全阻斷nvdc-jxa1株攻毒病毒感染(出現(xiàn)臨床癥狀)，為仔豬提供60％(3/5)保護；攻毒對照仔豬攻毒后全部出現(xiàn)臨床癥狀，部分豬只死亡；陰性對照無異常。因此，本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物無論是對豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株攻擊還是nvdc-jxa1株攻擊均具有很好的保護力；豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株單苗也能夠提供對豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株攻擊具有很好的保護力；而豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株單苗能提供對豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株攻擊豬只存活，部分豬只依然會發(fā)生臨床反應(yīng)，不能提供完全的保護作用。上述實驗證明了本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物兩種抗原成分協(xié)同作用，提供了對豬繁殖與呼吸綜合征病毒攻擊良好的保護作用，尤其是對豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株攻擊，提供了 優(yōu)于單苗的保護效果。表10免疫原性對比試驗攻毒后體溫變化結(jié)果顯示，本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物免疫仔豬，無論是用hnjz15株攻毒，還是用nvdc-jxa1株攻毒，均能阻斷病毒感染(出現(xiàn)臨床癥狀)，體溫?zé)o異常；豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株單苗亦能阻斷hnjz15株攻毒病毒感染(出現(xiàn)臨床癥狀)，體溫?zé)o異常；而豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株單苗不能完全阻斷nvdc-jxa1株攻毒病毒感染(出現(xiàn)臨床癥狀)，其中兩頭豬體溫超過40.5℃，為體溫異常；攻毒對照組存活豬只全部體溫異常；陰性對照組體溫?zé)o異常。因此，本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物無論是對豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株攻擊還是nvdc-jxa1株攻擊均具有很好的保護力；豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株單苗也能夠提供對豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株攻擊具有很好的保護力；而豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株單苗能提供對豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株攻擊部分保護，部分豬只依然會發(fā)生臨床反應(yīng)， 不能提供完全的保護作用。證明了本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物兩種抗原成分協(xié)同作用，提供了對豬繁殖與呼吸綜合征病毒攻擊良好的保護作用，尤其是對豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株攻擊，提供了優(yōu)于單苗的保護效果。實施例8豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物免疫仔豬后血清抗體比較試驗將43日齡prrsv抗原抗體陰性仔豬20頭隨機分成4組，5頭/組，按照表11注射疫苗，對照組接種dmem培養(yǎng)基2ml/頭。表11血清抗體比較試驗動物分組組別注射疫苗免疫劑量20疫苗22ml/頭21疫苗42ml/頭22疫苗52ml/頭23dmem培養(yǎng)基2ml/頭免疫后28天，各免疫組及對照組采集血清，測定中和抗體效價。結(jié)果見表12。表12血清抗體比較試驗結(jié)果結(jié)果顯示，本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物免疫仔豬， 免疫28天無論是對hnjz15株，還是對nvdc-jxa1株均具有較高的血清中和效價；與豬繁殖與呼吸綜合征病毒hnjz15株單苗對hnjz15株的血清中和效價相當(dāng)或更高，而遠高于豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株單苗對nvdc-jxa1株的血清中和效價。證明了本發(fā)明的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗組合物兩種抗原成分協(xié)同作用，提供了對豬繁殖與呼吸綜合征病毒良好的中和抗體，尤其是對豬繁殖與呼吸綜合征病毒nvdc-jxa1株的中和抗體，提供了優(yōu)于單苗的保護效果。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以優(yōu)選實施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12