專利名稱：依托泊甙磷酸酯和依托泊甙的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備抗癌化合物的新方法和制備這些抗癌化合物的新的中間體。本發(fā)明尤其涉及制備4’-去甲表鬼臼脂素甙4’-磷酸酯的方法和用于制備這些磷酸酯的中間體化合物。特別是本發(fā)明涉及到制備依托泊甙磷酸酯和由依托泊甙磷酸酯制備依托泊甙的方法。
依托泊甙和替尼泊甙是4’-去甲表鬼臼脂素甙衍生物，廣泛用于臨床治療癌癥。尤其在美國已被批準治療小細胞肺癌和睪丸癌。然而依托泊甙水溶解度有限，使制成適宜的劑型有困難。
為了提高依托泊甙的水溶解度和提高用藥的能力，制成了依托泊甙磷酸酯作為前藥。依托泊甙磷酸酯在體內(nèi)代謝成依托泊甙后才可被機體利用。一個水溶性前藥的實例敘述于美國專利4,904,768，該專利公開了在4’-位帶有磷酸酯基的4’-去甲表鬼臼脂素衍生物，為水溶性前藥。其中公開的一個實例是依托泊甙4’-磷酸酯。依托泊甙4’-磷酸酯的制法是將依托泊甙與三氯氧化磷反應(yīng)后，水解，或?qū)⒁劳胁催芭c氯代磷酸二苯酯反應(yīng)，再氫化除去苯基。
表鬼臼脂素甙的制備還公布于美國專利No.4,997,931中。4’-去甲表鬼臼脂素甙的制備方法是將4’-保護的4’-去甲表鬼臼脂素與保護的糖縮合。生成的化合物再經(jīng)衍生化，生成相應(yīng)的4’-磷酸酯。
以前制備依托泊甙和依托泊甙磷酸酯的方法有代表性的是需要將酚加以保護，再與經(jīng)保護的糖結(jié)合，然后除掉保護基因。此外，這些方法多數(shù)需要對羥基和磷酸酯基進行保護。不同的保護基需要多個步驟以除去各個保護基因。除去保護基各步常常需要酸性或堿性條件，這會使終產(chǎn)物降解，使收率降低。
依托泊甙磷酸酯通常由依托泊甙經(jīng)磷酸化和除去保護基等附加步驟來制備。這些多步驟反應(yīng)會導(dǎo)致所需化合物的總收率降低，并由于在依托泊甙上的甙羥基不希望有磷酸化反應(yīng)，使成本增高并且難以制備這些化合物。
本發(fā)明涉及一種制備4’-去甲表鬼臼脂素甙4’-磷酸酯，特別是依托泊甙磷酸酯的方法，該方法是將新的被保護的糖與新的被保護的4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸酯偶聯(lián)。更具體地說，本發(fā)明涉及二(芳甲基)保護的糖和四芳甲基保護的4’-去甲基-4-表鬼臼脂素甙4’-磷酸酯和由此制備依托泊甙磷酸酯的方法。在羥基和磷酸酯基上的芳甲基保護基可以是相同的，也可以是不同的，優(yōu)選為芐基或被如下一個或多個基團取代的芐基C1-4烷基、羥基、苯基、芐基、鹵素、烷氧基、硝基、羧酸及其酯。4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二(芳甲基)酯的制法是在適當(dāng)溶劑中將酚與亞磷酸二(芳甲基)酯、四鹵甲烷、三乙胺和?；呋瘎┓磻?yīng)。
按照本發(fā)明的一個實例，被保護的糖是2，3-二-O-芐基-4，6-O-亞乙基-α，β-D-吡喃葡萄糖，后者在溶劑中與4’-去甲基-4-表鬼臼脂素磷酸二芐酯偶聯(lián)，生成四芐基保護的依托泊甙磷酸酯。被保護的依托泊甙4’-磷酸酯經(jīng)結(jié)晶或重結(jié)晶回收C-1”-β-端基異構(gòu)體。甙基及磷酸酯基上的保護基經(jīng)氫化或其它適宜方法可同時被除去，生成依托泊甙磷酸酯。
整個過程可有效率地生成純凈的依托泊甙4’-磷酸酯，而無需另行純化。被保護的二芐基-4-(2，3-二-O-芐基-4，6-O-亞乙基-β-D-吡喃葡糖基)-4’-二甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸酯容易自反應(yīng)介質(zhì)中結(jié)晶出來，或重結(jié)晶出來，以基本純凈的形式分離出C-1”-β體。所需的端基異構(gòu)體的分離通常只經(jīng)過一步結(jié)晶就可得到。
具體地說，本發(fā)明涉及一種制備式V化合物的方法，
該方法包括將式IIIb化合物與式II化合物在路易斯酸存在下于反應(yīng)介質(zhì)中反應(yīng)，
式中R1是芳甲基羥基保護基，R2是芳甲基或兩個R2基共同是C1-5亞烷基，R3是芳甲基，R1、R2和R3是相同的或不同的，反應(yīng)生成式IVb化合物，
選擇性地結(jié)晶出式IVb化合物的C-1”-β端基異構(gòu)體，然后除去羥基和磷酸酯基保護基，若R2是芳甲基羥基保護基，則使化合物IVb與具有1-5個碳原子的羰基或其縮醛等同物反應(yīng)。
本發(fā)明的另一方面是一種制備式VI化合物的方法，
該方法包括將式V化合物于緩沖溶液中與磷酸酶反應(yīng)以除去磷酸酯，得到式VI的該化合物。
本發(fā)明的另一方面是提供一種制備式VI化合物的方法，
該方法包括用磷?；瘎κ絀化合物進行磷?；?，
生成式II的被保護的4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸酯。
式中R3為芳甲基，使該式II化合物與式III的被保護的糖反應(yīng)，
生成式IV化合物
式中R1是芳甲基保護基；分離出式IV的C-1”-β體；除去羥基和磷酸酯基保護基，生成式V化合物，
然后用磷酸酶處理該式V化合物以除去磷酸酯基，生成式VI化合物。
本發(fā)明涉及一種制備4’-去甲表鬼臼脂素甙4’-磷酸酯的改進方法，尤其是制備依托泊甙4’-磷酸酯，其藥用鹽及溶劑化物。本發(fā)明還涉及芳甲基保護的糖和芳甲基保護的依托泊甙和依托泊甙4’-磷酸酯的前體的制備。本發(fā)明還涉及一種用羥基和磷酸酯基保護基制備依托泊甙磷酸酯的方法，這使得容易用結(jié)晶方法分離出端基異構(gòu)體。另一個有利的特征是羥基和磷酸酯基保護基可容易地同時被除去，而不會降解終產(chǎn)物。
本發(fā)明方法產(chǎn)生保護的依托泊甙4’-磷酸芳甲基(尤其是芐基)酯，它容易用結(jié)晶方法自反應(yīng)介質(zhì)中分離出或用適宜的溶劑重結(jié)晶出純的端基異構(gòu)體C-1”-β體。整個過程快速而有效，提供了制備依托泊甙4’-磷酸酯的有效方法。磷酸酯基很容易用磷酸酶除去，這是一種有效地制備依托泊甙、其藥用鹽及溶劑化物的方法。
如同以下詳細討論的那樣，整個方法可有效地制備依托泊甙磷酸酯或依托泊甙。在優(yōu)選的實例中，4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐基酯在路易斯酸存在下與2，3-二芐基-4，6-O-亞乙基-α，β-D-吡喃葡萄糖偶聯(lián)，生成4-(2，3-二-O-芐基-4，6-O-亞乙基-α，β-D-吡喃葡糖基)-4-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐基酯的端基異構(gòu)體混合物。令人意外地發(fā)現(xiàn)，C-1”-β端基異構(gòu)體很容易以基本上純凈的形式從溶液中結(jié)晶出來，C-1”-β端基異構(gòu)體可直接由反應(yīng)介質(zhì)中結(jié)晶或用適宜溶劑重結(jié)晶。然后回收C-1”-β端基異構(gòu)體，經(jīng)氫化同時除去羥基和磷酸酯基保護基。
此處所用的術(shù)語藥用鹽包括一或二堿金屬鹽和堿土金屬鹽。在優(yōu)選的實例中，終化合物是乙醇的溶劑化物。溶劑化物是用標(biāo)準方法在有機溶劑如乙醇中結(jié)晶或重結(jié)晶生成的。術(shù)語亞烷基包括直鏈或支鏈烷基鏈，例如包括亞乙基、亞丙基和亞異丙基。
本發(fā)明的一個方面是將式I的4’-去甲表鬼臼脂素磷酰化，生成式II的被保護的4’-去甲表鬼臼脂素-4’-磷酸二(芳甲基)酯。該磷酰化過程的優(yōu)選方法是將4’-去甲表鬼臼脂素與亞磷酸二(芳甲基酯)、四鹵甲烷、叔胺和?；呋瘎┓磻?yīng)。四鹵甲烷的分子式為CX4，X為鹵素，選自F、Cl、Br和I。在優(yōu)選的實例中，四鹵甲烷是CCl4。碳上的鹵素可相同或不同。優(yōu)選實例用的叔胺是N，N-二異丙基乙胺(DIPA)，其它適宜的叔胺也可以使用。?；呋瘎┛梢允潜炯夹g(shù)領(lǐng)域已知的標(biāo)準催化劑。在優(yōu)選的實例中，?；呋瘎┦荖，N-二甲基氨基吡啶(DMPA)。該反應(yīng)可總結(jié)如下
式中R3是芳甲基。優(yōu)選實例中R3為芐基，得到的磷酸酯具有化合物IIa的結(jié)構(gòu)
另外，R3是被如下一個或多個基團取代的芐基C1-4烷基、羥基、苯基、芐基、鹵素、烷氧基、硝基和羧酸及其酯。適宜的取代的芐基包括，例如2-甲基芐基、3-甲基芐基、4-甲基芐基、1或2-萘基、2、3或4-苯基芐基，4-甲氧羰芐基，2，6-二氯芐基、2-氯芐基和五氟芐基。
該磷?；^程是一種方便而容易的方法，生成被保護的4’-去甲表鬼臼脂素-4’-磷酸二(芳甲基)酯，收率很高。該方法基本上是一罐法，迅速而高選擇性地對化合物I的酚羥基反應(yīng)。雖然這種方法對于4’-去甲表鬼臼脂素的磷酰化特別有利，但對酚類是有普遍性和高選擇性的，例如酚類包括對氟苯酚、2，6-二甲氧基苯酚，鄰苯二酚和4-羥基苯乙醇。用4-羥基苯乙醇進行反應(yīng)時只產(chǎn)生很少量的伯醇基的磷?；?。依托泊甙的磷?；伤Ｍ幕衔?，甙基上的磷酰化比預(yù)先形成的氯代磷酸二芐酯要少。
優(yōu)選的溶劑是乙腈，但在磷?；瘯r也可用鹵代的或非鹵代的溶劑。四鹵甲烷，尤其是四氯化碳優(yōu)選只以試劑用量使用，而不像在一些常規(guī)方法中用作溶劑。四鹵甲烷在磷酰化反應(yīng)中的用量是每當(dāng)量起始酚一個或多個當(dāng)量。該反應(yīng)也可在溫和條件下于室溫或低于室溫下進行，有代表性的是低于大約-10℃。該磷酰化反應(yīng)基本上在不加氯代磷酸二芐酯(DBPCl)條件下進行，因為DBPCl可就地生成。這就避免了制備DBPCl的額外步驟，并降低了生成的磷?；a(chǎn)物的雜質(zhì)含量。有代表性的是，反應(yīng)在大約45分鐘進行完全?；衔颕I用標(biāo)準方法如于異丙醇中重結(jié)晶得到。
然后化合物II在路易斯酸存在下與羥基被保護的吡喃葡萄糖偶聯(lián)。在優(yōu)選的實例中，路易斯酸是三氟化硼醚合物。其它的路易斯酸例如包括AlCl3、ZnCl2、Et2AlCl、CF3SO3H、CF3SO3Ag、Zn(CF3SO3)2和TMSCF3SO3。該偶聯(lián)反應(yīng)可以在分子篩存在下進行。該偶聯(lián)反應(yīng)在鹵代或未鹵代溶劑，最優(yōu)選的是乙腈中進行。其它溶劑例如包括丙腈、丙酮、二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷和它們的混合物。
優(yōu)選的羥基被保護的吡喃葡萄糖具有式III的結(jié)構(gòu)
式中R1為芳甲基。優(yōu)選的實例中R1為芐基，這樣吡喃葡萄糖具有式IIIa的結(jié)構(gòu)
在另一實例中R1是取代的芐基，可被如下的一個或多個基團取代C1-4烷基、羥基、苯基、芐基、鹵素如氟、氯、溴和碘，烷氧基、硝基和羧酸及其酯。適宜的取代的芐基包括2-甲基芐基、3-甲基芐基、4-甲基芐基、1或2-萘基、2，3或4-苯基芐基，4-甲氧羰芐基、2，6-二氯芐基、2-氟芐基和五氟芐基。有代表性的是R1與R3相同。
吡喃葡萄糖還可具有式IIIb的結(jié)構(gòu)，
式中R1含義與前述相同，R2與R1相同，或兩個R2基共同構(gòu)成C1-5亞烷基。優(yōu)選的是，兩個R2基共同為亞乙基。在另一些實例中兩個R2基可共同為亞丙基或亞異丙基。
化合物III、IIIa和IIIb的制備按已知的方法，如在美國專利No.4,997,931中所述的方法進行。形成的芳基被保護的吡喃葡萄糖為C-1-α，β的端基異構(gòu)體混合物。與大多數(shù)端基異構(gòu)體混合物不同，芳甲基吡喃葡萄糖的C-1-β端基異構(gòu)體可用結(jié)晶法與α-端基異構(gòu)體分開。具體地說，式IIIa的吡喃葡萄糖化合物的端基異構(gòu)體混合物可用己烷結(jié)晶，生成化合物IIIa的基本上是端基異構(gòu)體純的C-1-β體。而且，吡喃葡萄糖化合物IIIa的初始組成為β∶α＝1∶1，過一段時間固化后β∶α＝85∶15。
被保護的化合物IH的吡喃葡萄糖與化合物II的被保護的4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸酯的偶聯(lián)反應(yīng)最好是在路易斯酸存在下于乙腈中進行。
化合物IIIa的羥基被保護的吡喃葡萄糖與4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐酯(IIa)偶聯(lián)生成具有式IVa的4-(2，3-二-O-芐基-4，6-O-亞乙基-D-吡喃葡糖基)-4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐酯的C-1”-α，β端基異構(gòu)體混合物。
在三氟化硼醚合物的存在下偶聯(lián)反應(yīng)迅速而容易地進行，生成化合物IVa的α和β端基異構(gòu)體。
在偶聯(lián)反應(yīng)之前，不必分離出化合物III，特別是IIIa的β體。當(dāng)反應(yīng)是在鹵代烴溶劑中進行時，IVa的α和β體的最后比例并不取決于原料化合物IIIa的端基異構(gòu)體的組成。于-20℃和在三氟化硼醚合物的存在下，在乙腈中化合物IIa和IIIa(β∶α＝85∶15)偶聯(lián)生成的化合物IVaβ和IVaα的比例為72∶28。據(jù)信在鹵代烴溶劑中糖的端基異構(gòu)化發(fā)生得非?？欤谝译嬷卸嘶悩?gòu)化要慢得多。
在另一實例中，反應(yīng)混合物中可加入適宜的鹽，以增強溶劑的離子強度。適宜的鹽包括高氯酸堿金屬鹽和堿土金屬鹽。例如用溶解于乙腈中的0.5M LiClO4使IVa的β∶α增加到81∶19。
生成的IVa α，β化合物的端基異構(gòu)體混合物可用甲醇重結(jié)晶，得到高收率的基本上是純凈的C-1”-β體。只單純在甲醇中結(jié)晶或甲醇與其它溶劑合用使極性略低的IVa β端基異構(gòu)體幾乎完全結(jié)晶出來，基本上沒有IVa α端基異構(gòu)體的雜染。
偶聯(lián)反應(yīng)一般在室溫或低于室溫下，優(yōu)選于大約-10℃～-40℃進行。盡管偶聯(lián)反應(yīng)在低溫下反應(yīng)較慢，但較低的溫度有利于通過減慢IIIa的反應(yīng)混合物中的端基異構(gòu)化而生成IVa C-1”-β端基異構(gòu)體。例如，4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐基酯和2，3-二-O-芐基-4，6-O-亞乙基-α，β-D-吡喃葡萄糖(85∶15β∶α)在乙腈中于-20℃偶聯(lián)生成IVaβ和IVaα，其比例是72∶28，而在-40℃時，其比例為74∶26。在丙腈中于-20℃進行同樣的偶聯(lián)反應(yīng)，IVaβ與IVaα的比例為57∶43，而在-78℃時，其比例是76∶24。
用于偶聯(lián)反應(yīng)的優(yōu)選溶劑是乙腈，因為它與偶聯(lián)反應(yīng)的標(biāo)準溶劑相比，反應(yīng)更快。乙腈的未預(yù)料到的性質(zhì)是能使偶聯(lián)反應(yīng)在大約2小時內(nèi)達到完全，而在二氯乙烷中反應(yīng)歷時大約18小時。在乙腈中的偶聯(lián)反應(yīng)比在丙腈中迅速。而且在乙腈中的偶聯(lián)反應(yīng)也會使生成的IVaβ端基異構(gòu)體更多。在4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐酯與2，3-O-芐基-4，6-O-亞乙基-α，β-D-吡喃葡萄糖的偶聯(lián)反應(yīng)中研究了數(shù)種溶劑。有代表性的是，用較高介電常數(shù)的溶劑增加了β∶α比例。
吡喃葡萄糖的取代芐基保護基上的取代基也影響生成的IVaβ與IVaα的比例。例如，在鄰位上的大基團有利于化合物IV的C-1”-β體，這是由于在化合物IVa中產(chǎn)生了位阻，而在間位和對位的取代基造成的位阻較小。吸電子基團也有利于C-1”-β體。用五氟芐基得到最高的β∶α比例，生成的IVa C-1”-β與IVa C-1”-α的比例是80∶20。
在標(biāo)準操作后進行單一的結(jié)晶步驟，可以分開IVaα，β的端基異構(gòu)體混合物，得到基本上純凈的C-1”-β體。將IVaα，β的端基異構(gòu)體混合物溶解于甲醇中，將溶液加熱回流使化合物IVaα，β完全溶解。使溶液冷卻到室溫，得到的沉淀物為基本純凈的化合物IVa的C-1”-β體。
優(yōu)選的實例是結(jié)晶化得到的化合物IVa C-1”-β體直接進行偶聯(lián)反應(yīng)。偶聯(lián)反應(yīng)完成后，不必進一步萃取或常規(guī)操作，將甲醇加到溶液中，并使溶液溫?zé)嶂?℃。然后將溶液于0℃放置數(shù)小時，得到的固體證明基本是純凈的IVa C-1”-β。
甚至從50∶50端基異構(gòu)體混合物中能直接結(jié)晶出化合物IVa的C-1”-β體，這是本方法顯著的和出人意料的優(yōu)點。如同J.March在高等有機化學(xué)第4版John Wiley & Sons，紐約，1992，p.121所報導(dǎo)的那樣，很少的差向異構(gòu)體能夠只經(jīng)單一的結(jié)晶法得以分離開。
得到化合物IV的C-1”-β端基異構(gòu)體后，用已知方法(最好是氫化法)同時除掉羥基和磷酸酯基保護基。氫化除去保護基步驟可有效地進行，以高收率和最低降解作用生成依托泊甙磷酸酯。化合物IV，IVa和IVb極不穩(wěn)定且對酸和堿都很敏感。用酸或堿除去羥基和磷酸酯基保護基的已有方法通常會使一部分所需化合物分解。此外，去保護步驟可以將吡喃葡萄糖上的亞乙基除去。與已有的除去保護基的方法相比，氫化法的優(yōu)點是只需要一個去保護步驟，不需用重金屬，而且反應(yīng)在溫和和中性條件下進行，產(chǎn)物收率高。不需用層析法就可得到純凈形式的依托泊甙磷酸酯，而其它方法需用。
氫化可用許多已知方法進行。有代表性的是氫化反應(yīng)于貴金屬催化劑存在下于適宜的溶劑或溶劑混合物中進行。
優(yōu)選的實例是氫化用4％鈀/碳在化合物IVa C-1”-β體于50/50甲醇/四氫呋喃(THF)的溶液中進行。將混合物氫化數(shù)小時，有代表性的是3-6小時，氫壓力為40-50磅/英寸2的氫氣。然后可濾除催化劑，用乙醇重結(jié)晶依托泊甙磷酸酯。IV C-1”-β的去保護作用生成式V的依托泊甙磷酸酯如下所示
式V的4’-去甲表鬼臼脂素甙-4’-磷酸酯可與適宜的陽離子源接觸轉(zhuǎn)變成其藥用鹽。例如，將該磷酸酯用適宜的鈉堿處理，使其鈉鹽生成可制成鈉鹽。式V的4’-去甲表鬼臼脂素甙-4’-磷酸酯的溶劑化物也可用已知方法得到。
依托泊甙磷酸酯可在緩沖水溶液中用磷酸酶除去磷酸酯基而轉(zhuǎn)變成依托泊甙。磷酸酶能夠?qū)⒁劳胁催傲姿狨ネ耆D(zhuǎn)變成依托泊甙。該反應(yīng)在裝有緩沖液的反應(yīng)罐中于pH大約5-12(優(yōu)選pH 6-9)、室溫下進行。有代表性的是依托泊甙磷酸酯在與緩沖水溶液混合時，以溶劑化物的形式存在。
將依托泊甙4’-磷酸酯酶促轉(zhuǎn)變成依托泊甙是有利的，因為這種轉(zhuǎn)變條件溫和，不會使依托泊甙或依托泊甙4’-磷酸酯降解。例如活潑的亞乙基基本上不受磷酸酶的影響。所用的酶可以是在pH 5-12(優(yōu)選為6-9)下具有磷酸酶活性的任何酶。適宜的磷酸酶包括酸性和堿性磷酸酶。該磷酸酶可由牛、細菌或其它來源如牛和小牛的小腸粘膜中得到。另外，磷酸酶可以是麥芽脂酶，已知它具有磷酸酶活性。這些酶在Sigma化學(xué)公司有售。
適宜的緩沖液例如包括M-Tris(pH7.8)，M-Tris(pH8.7)，M-硼酸鹽(pH10.0)和M-碳酸氫鹽(pH10.3)。依托泊甙磷酸酯V的去磷酸基生成依托泊甙VI如下所示
下面的非限制性實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方案加以說明。實施例12，3-二-O-芐基-4，6-O-亞乙基-α，β-D-吡喃葡萄糖(IIIa α，β)本化合物是按照文獻類似化合物的制法制備的，如在美國專利No.4,997,931中所述。1H NMR表明端基異構(gòu)體組成是57∶43β∶α。Rf(40％ EtOAc/己烷)0.40.1H NMR(CDCl3)δ7.39-7.27(m，10H)，5.14(d，0.5H，J＝3.7Hz)，4.91-4.66(m，5.5H)，4.14(dd，0.5H，J＝5.0，10.5Hz)，4.09(dd，0.5H，J＝5.0，10.3Hz)，3.94-3.88(m，1H)，3.66(t，0.5H，J＝9.0Hz)，3.56-3.25(m，3.5H)，3.10(bs，1H，依賴于濃度的OH)，1.36(d，3H，J＝5.0Hz).13C NMR(CDCl3)δ128.53，128.42，128.31，128.09，127.95，127.83，127.63，99.50，97.72，92.12，82.94，81.44，81.08，80.89，79.31，78.33，75.23，75.12，74.96，73.81，68.53，68.22，66.22，62.48，20.43.實施例22，3-二-O-芐基-4，6-O-亞乙基-β-D-吡喃葡萄糖(IIIaβ)將IIIa α，β的端基異構(gòu)體混合物(7g)量于250ml圓底燒瓶內(nèi)，加入己烷(125ml)，將混懸物加熱回流。糖變成不溶性油狀物，沉于瓶底。將混懸液冷卻至室溫，然后放入攪拌棒，輕輕攪拌此溶液過夜。生成的白色蓬松狀結(jié)晶漂浮于己烷中，不純的固體留于下面。傾析出結(jié)晶，濾集于布氏漏斗上。不純的固體留于瓶內(nèi)。室溫真空(20mmHg)干燥白色的IIIaβ固體。1H NMR(CDCl3)δ7.37-7.27(m，10H)，4.90-4.69(m，6H)，4.14(dd，1H，J＝4.9，10.4Hz)，3.66(t，1H，J＝9.0Hz)，3.54(t，1H，J＝10.2Hz)，3.45(t，1H，J＝9.3Hz)，3.37-3.27(m，2H)，3.23(d，1H，J＝5.5Hz，依賴于濃度的OH)，1.36(d，3H，J＝5.1Hz).13C NMR(CDCl3)5128.42，128.29，128.11，127.93，127.82，127.63，99.45，97.71，82.93，81.06，80.88，75.22，74.96，68.21，66.21，20.39.實施例34’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐酯(IIa)
烘箱中烘干的1升三頸圓底燒瓶內(nèi)裝有滴液漏斗、攪拌棒、溫度計、兩個隔膜和N2進氣口，瓶內(nèi)裝入4’-去甲表鬼臼脂素(I，25.00g，62.45mmol)和無水乙腈(367ml，0.17M)。將懸浮液冷卻到-10℃。加入四氯化碳(30.1ml，312.25mmol)，保持溫度-10℃。于3分鐘內(nèi)用注射器注入N，N-二異丙基乙胺(22.84ml，131.15mmol)，一次全部加入N，N-二甲氨基吡啶(0.763g，6.25mmol)，再于15分鐘內(nèi)滴加亞磷酸二芐酯(20.00ml，90.55mmol)。在加入過程中反應(yīng)略有放熱現(xiàn)象，但內(nèi)部溫度經(jīng)外部冷卻保持在-10℃。再于-10℃攪拌37分鐘。在此期間原料溶解，用HPLC監(jiān)視反應(yīng)。加入0.5M KH2PO4(150ml)，使反應(yīng)溶液溫?zé)嶂潦覝??；旌衔镉肊tOAc(1×350ml)萃取，再用水洗(2×100ml)。有機層經(jīng)硫酸鈉干燥，真空濃縮到150ml體積。加入2-丙醇(500ml)。真空蒸除溶劑(200ml)，在此期間固體析出。加入2-丙醇(500ml)，再真空蒸發(fā)除去溶劑550ml。最后再加入2-丙醇(250ml)，將混合物加熱回流直到所有固體溶解。將黃色溶液冷卻至室溫，再于0℃保持4小時。濾集白色固體，用冷2-丙醇洗滌2次，真空干燥(40℃，20mmHg)，得到37.15g(90.1％)。HPLC RtRf(10％MeOH/CH2Cl2)0.66.1H NMR(CDCl3)δ7.37-7.28(m，10H)，6.81(s，1H)，6.39(s，1H)，6.30(s，2H)，5.90(dd，2H，J＝1.0，12.7(Hz)，5.28-5.14(m，4H)，4.71(d，1H，J＝3.4Hz)，4.53(d，1H，J＝5.1Hz)，4.25(dd，1H，J＝8.7，10.7Hz)，3.63(s，6H)，3.27(dd，1H，J＝5.2，14.1Hz)，2.71-2.61(m，1H).13C NMR(CDCl3)δ175.27，151.15，151.11，148.22，147.32，137.28，136.04，135.94，132.19，131.35，128.43，128.30，128.26，127.69，127.64，110.13，109.32，107.66，101.45，69.62，69.53，69.46，67.75，66.17，56.06，43.81，40.39，38.47.實施例44-(2，3-二-O-芐基-4，6-O-亞乙基-β-D-吡喃葡糖基)-4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐酯(IVaβ)(于乙腈中偶聯(lián))向裝有攪拌棒，溫度計、隔膜和N2進氣口的烘箱中烘干的25ml二頸圓底燒瓶中加入4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐酯(IIa，1.00g，1.51mmol)，4干分子篩(1/16”小粒)(2.0g)，2，3-二-O-芐基-4，6-O-亞乙基-α，β-D-葡萄糖(IIIa，α，β，85∶15，0.702g 1.817mmol)，和無水乙腈(10.0ml)。攪拌直至溶液呈均相，然后將溶液冷卻至-20℃。于2分鐘內(nèi)滴加三氟化硼醚合物(0.50ml，4.08mmol)。保持反應(yīng)溫度-20℃80分鐘。在加入BF345分鐘后白色固體開始析出。加入吡啶(5.23ml，64.7mmol)。使懸浮液溫?zé)岬绞覝?，用CH2Cl2(10ml)稀釋。白色固體溶解。過濾溶液以除去剩余的固體。溶液用3％HCl(7ml)洗滌，水相再用CH2Cl2(10ml)反萃取。合并有機相，用水(7ml)洗滌，水相用CH2Cl2(10ml)反萃取。最后合并有機相，用飽和NaCl(7ml)洗滌。有機層用Na2SO4干燥，真空濃縮成黃/白色固體。該粗產(chǎn)物經(jīng)HPLC表明IVaβ∶IVaα為71.6∶28.4。固體物攪拌下溶解于CH2Cl2(10ml)中。加入甲醇(90ml)。不久一些固體析出。溶液攪拌下溫?zé)嶂粱亓?，此時固體溶解，然后蒸除溶劑20ml。收集19ml后固體開始結(jié)晶。使混合物冷卻至室溫，輕輕攪拌5小時。濾集白色固體，用室溫甲醇沖洗兩次。IVaβ固體真空下干燥(40℃，20mmHg)，得到0.830g(53.3％)。Rf(50％EtOAc己烷)0.36.1H NMR(CDCl3)δ7.38-7.18(m，18H)，7.00-6.98(m，2H)，6.82(s，1H)，6.54(s，1H)，6.25(s，2H)，5.97-5.89(dd，2H，J＝1.0，26.7Hz)，5.29-5.18(m，4H)，4.89-4.85(m，2H)，4.77-4.71(m，3H)，4.60-4.49(m，3H)，4.39(t，1H，J＝10.2Hz)，4.23(t，1H，J＝8.2Hz)，4.16(dd，1H，J＝4.9，10.4Hz)，3.63(s，6H)，3.55(t，1H，J＝10.2Hz)，3.45-3.34(m，2H)，3.32-3.21(m，2H)，2.89-2.80(m，1H)，1.38(d，3H，J＝5.0Hz).13C NMR(CDCl3)δ174.74，151.20，148.72，147.17，138.48，137.75，137.0，136.3，136.2，132.02，128.62，128.42，128.30，128.21，128.07，127.87，127.70，127.67，110.72，109.18，107.73，102.32，101.60，99.55，81.66，80.95，75.40，75.06，73.45，69.45，68.19，67.87，65.97，43.87，41.22，37.48，20.40.
IVa C-1”-α異構(gòu)體與一些所希望要的產(chǎn)物IVβ(IVβ∶IVα 13.7∶86.3)一起留在母液中。實施例54-(2，3-二-O-芐基-4，6-O-亞乙基-β-D-吡喃葡糖基)-4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐酯(IVaβ)(于二氯乙烷中偶聯(lián))向裝有攪拌棒、溫度計、兩個隔膜和N2進氣口的烘箱中烘干的250ml干燥的三頸燒瓶內(nèi)加入4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐酯(IIa，14.295g，21.57mmol)，干燥的4A分子篩(1/16”小粒)(28.6g)、2，3-二-O-芐基-4，6-O-亞乙基-α，β-D-葡萄糖(IIIa α，β，10.0g，25.88mmol)和無水1，2-二氯乙烷(143ml)。攪拌此溶液直到均相，然后冷卻到-20℃。于10分鐘內(nèi)滴加三氟化硼醚合物(7.15ml，58.24mmol)。反應(yīng)于-20℃保持18小時。加入吡啶(5.23ml，64.7mmol)，混合物由褐色變成黃色。使混濁的溶液溫?zé)岬绞覝?，用CH2Cl2(200ml)稀釋，過濾除去固體。溶液用3％HCl(100ml)、水(100ml)、最后用飽和NaCl(100ml)洗滌。有機層用Na2SO4干燥，真空濃縮成黃色油狀物。攪拌下加入回流甲醇(1500ml)。使混合物冷卻到室溫并放置過夜。濾集白色固體，用甲醇沖洗兩次。IVaβ的固體于真空中干燥(40℃，20mmHg)，得到8.86g(39.8％)。
C-1”-α異構(gòu)體IVaα與一些所希望要的產(chǎn)物IVaβ一起留在母液中。該剩余的偶聯(lián)產(chǎn)物經(jīng)進一步結(jié)晶和(或)層析回收。在對IVβ重結(jié)晶之前粗產(chǎn)物的β∶α的比例是54∶46。偶聯(lián)產(chǎn)物的總收率為81％。
4-(2，3-二-O-芐基-4，6-O-亞乙基-α-D-吡喃葡糖基)-4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐酯(IVaα)Rf(50％EtOAC/己烷)0.31。1H NMR(CDCl3)δ7.38-7.21(m，20H)，6.87(s，1H)，6.26(s，2H)，5.95(d，2H，J＝5.8Hz)，5.29-5.18(m，4H)，4.87(dd，3H，J＝2.3，11.1Hz)，4.79-4.74(m，2H)，4.68-4.58(m，4H)，4.11(t，1H，J＝7.9Hz)，3.95(q，1H，J＝10.6Hz)，3.86(t，1H，J＝9.2Hz)，3.63(s，6H)，3.51(dd，1H，J＝3.6，9.4Hz)，3.45(d，1H，J＝7.2Hz)，3.45-3.35(m，3H)，2.82-2.75(m，1H)，1.32(d，3H，J＝5.0Hz).13C NMR(CDCl3)δ174.91，151.22，151.18，148.44，147.02，138.56，137.83，137.05，136.27，136.18，132.19，129.27，128.59，128.45，128.34，128.24，128.12，127.96，127.89，127.72，127.69，110.44，109.81，107.85，101.61，101.08，99.59，82.07，79.36，78.59，76.76，75.09，74.69，69.52，69.46，69.41，68.18，67.04，62.95，56.15，43.82，41.10，38.41，20.40.實施例6
本實施例說明的是偶聯(lián)和結(jié)晶化步驟在同一反應(yīng)容器中進行。將具有攪拌棒的50ml三頸圓底燒瓶在烘箱中烘干，裝上兩個隔膜，在N2下冷卻。加入4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐酯(1.002g，1.51mmol)和2，3-O-芐基-4，6-O-亞乙基吡喃葡萄糖(IIa，85∶15，β∶α，0.702g，1.81mmol)。將這些固體溶解于無水乙腈(10.0ml)中，然后將溶液冷卻到-40℃。滴加入三氟化硼醚合物(0.50ml，4.1mmol)。于-40℃攪拌該溶液，用HPLC監(jiān)視反應(yīng)。在反應(yīng)過程中，一些產(chǎn)物析出。6小時后，滴加入甲醇(30ml)。混懸液攪拌下溫?zé)岬?30℃，然后于0℃放置(不攪拌)17小時。用布氏漏斗收集固體，用室溫甲醇沖洗兩次。生成0.9668g(62.0％)的IVaβ，HI為100％。實施例7依托泊甙-4’-磷酸酯(V)將50％濕重(314mg)的4％鈀/碳加到4-(2，3-二-O-芐基-4，6-O-亞乙基-β-D-吡喃葡糖基)-4’-去甲基-4-表鬼臼脂素-4’-磷酸二芐酯(IVaβ，758mg)于50/50 MeOH/THF(50ml)的溶液中。混合物于室溫下、40-50磅/英寸2氫壓下氫化3-6小時。濾除催化劑，用MeOH沖洗。真空濃縮濾液(40-60℃，吸氣器)到8-10ml。加入無水乙醇(50ml)，再將溶液濃縮到10ml。再加入乙醇(25ml)，將溶液濃縮到10ml。加入依托泊甙4’-磷酸酯二乙醇溶劑化物晶種。于30-60分鐘內(nèi)調(diào)節(jié)溶液的溫度由大約50℃到15-20℃。在15-20℃再保持30分鐘后，濾集析出的白色結(jié)晶，用5℃乙醇(5-10ml)洗滌。在高真空，25-40℃下干燥固體，得到436mg(77.8％)依托泊甙-4’-磷酸酯二乙醇溶劑化物(V)，經(jīng)HPLC測定其純度為99.2％(面積)。實施例8依托泊甙(VI)電磁攪拌下將依托泊甙-4’-磷酸酯二乙醇溶劑化物(V，410mg)溶解于1.0M Tris緩沖液(8.0ml)中。用1NNaOH調(diào)節(jié)pH由8.1到8.7。使溶液溫?zé)嶂?5℃。加入堿性磷酸酶(Sigma，目錄#p6774)于Milli Q水的溶液(2.0ml，200單位/ml)。在10分鐘內(nèi)固體析出。需要時加入1N NaOH使pH維持在8.4-8.8的范圍。該反應(yīng)用HPLC監(jiān)視。3小時后，使混合物冷卻到10℃保持15分鐘。真空過濾收集固體，用水(5-7ml)洗滌，高真空(20℃)干燥18小時，得到241mg(76％的依托泊甙(VI)，HPLC測定為95.5％(面積))。
權(quán)利要求
1.式IV的化合物，
其中R1是芐基或取代的芐基羥基保護基，R3是芐基或取代的芐基磷酸酯基保護基。
2.權(quán)利要求1的化合物，其中R1和R3是被1個或多個如下基團取代的芐基C1-4烷基、羥基、苯基、芐基、鹵素、烷氧基、硝基、羧酸及其酯。
3.獲得式IVa的C-1″-β端基異構(gòu)體的方法，
所說的方法包括式IV化合物的端基異構(gòu)體混合物在溶劑中形成溶液，
式中R1和R3是芳甲基，相同或不同，在所說的溶液中使所說的C-1″-β-端基異構(gòu)體結(jié)晶，并且回收基本純凈的式IVa的C-1″-β端基異構(gòu)體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所說的溶劑是乙腈。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所說的溶劑是醇，所說的方法包括將所說的醇加熱以溶解所說的端基異構(gòu)體混合物，冷卻所說的溶液使式IVa的C-1″-β端基異構(gòu)體結(jié)晶。
6.權(quán)利要求3的方法，該方法包括將醇直接加到所說的溶液中，加入量應(yīng)使式IVa的C-1″-β端基異構(gòu)體結(jié)晶。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所說的醇是甲醇。
全文摘要
制備依托泊甙磷酸酯的方法是在溶劑中將4’－去甲基－4－表鬼臼脂素－4’－磷酸二芐酯與2,3－二－O－芐基－4,6－O－亞乙基－α,β－D－吡喃葡萄糖反應(yīng),然后除去保護基。四芐基被保護的依托泊甙磷酸酯從甲醇中重結(jié)晶或加入甲醇直接從乙腈中結(jié)晶,生成基本純凈的C－1”－β體,用氫化方法同時除去芐基保護基以高收率生成依托泊甙磷酸酯。在另一實施方案中,用磷酸酶處理依托泊甙磷酸酯生成依托泊甙。
文檔編號A61K31/7048GK1189500SQ9712303
公開日1998年8月5日 申請日期1997年11月27日 優(yōu)先權(quán)日1993年11月4日
發(fā)明者L·J·希爾沃伯格, P·夫埃米舍逖, J·L·迪隆, J·J·猶舍爾 申請人:布里斯托爾-米爾斯·斯奎布公司