專利名稱：疫苗、免疫治療劑及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進的疫苗、預(yù)防性和／或治療性免疫個體以抵抗免疫原的改進的方法，以及改進的免疫治療性組合物和改進的免疫治療方法。
背景技術(shù)：
本申請要求了1998年2月27日提交的題目為“改進的疫苗”的美國臨時申請60／076，207的優(yōu)先權(quán)，該專利納入本文作參考。免疫治療指調(diào)節(jié)人的免疫應(yīng)答以賦予所需的治療效果。免疫治療劑指那樣一些組合物，當將它們給予個體時，它們調(diào)節(jié)個體的免疫足以減少不希望的免疫應(yīng)答所引起的癥狀和癥狀原因，或通過增加所希望的免疫應(yīng)答來緩解癥狀或消除／減少癥狀原因。在一些情況下，免疫治療是疫苗接種程序的一部分，在該程序中，給予個體一種疫苗，結(jié)果導(dǎo)致個體接觸免疫原。在這種情況下，免疫治療劑增加了免疫應(yīng)答和／或選擇性地增強了部分免疫應(yīng)答，這是治療或預(yù)防特定病情、感染或疾病所需的。在一些情況下，給予的免疫治療劑不含免疫原。在這些情況下，提供免疫治療劑是用來通過減少或抑制免疫應(yīng)答、增強或增加免疫應(yīng)答、減少或抑制部分免疫系統(tǒng)、增強或增加部分免疫系統(tǒng)、減少或抑制免疫應(yīng)答、增強或增加免疫應(yīng)答來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。在一些情況下，免疫治療劑包括抗體，當抗體在體內(nèi)給予時，它與參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的蛋白結(jié)合?？贵w與這種蛋白之間的相互作用導(dǎo)致免疫應(yīng)答發(fā)生改變。如果該蛋白參與自身免疫疾病，則該抗體能抑制其在該作用中的活性，并減少或消除癥狀或疾病。
疫苗可用于免疫個體以抵抗靶抗原，例如變應(yīng)原、病原性抗原或與參與人類疾病細胞相關(guān)的抗原。與參與人類疾病細胞相關(guān)的抗原包括癌相關(guān)性腫瘤抗原和參與自身免疫疾病的細胞相關(guān)抗原。
在設(shè)計這些疫苗中已經(jīng)認識到，能在接種個體的細胞內(nèi)產(chǎn)生靶抗原的疫苗能有效地誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的細胞免疫枝(cellular arm)。具體地說，減毒活疫苗、采用無毒力載體的重組疫苗和DNA疫苗都能在被接種個體的細胞內(nèi)產(chǎn)生抗原，由此誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的細胞免疫。另一方面，只包含蛋白的亞單位疫苗和死的或滅活的疫苗，誘導(dǎo)了體液應(yīng)答反應(yīng)，卻不能誘導(dǎo)良好的細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。
為了提供抵抗病原感染的保護作用，為治療病原感染、癌癥或自身免疫疾病而提供有效的免疫介導(dǎo)的治療，常常需要有細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此，較佳的是能夠在免疫接種個體的細胞內(nèi)產(chǎn)生靶抗原的疫苗，例如減毒活疫苗、采用無毒力載體的重組疫苗和DNA疫苗。
雖然這些疫苗通過預(yù)防性或治療性免疫接種個體，常能有效地抵抗病原感染或人體疾病，但仍然需要改進的疫苗，仍然需要產(chǎn)生增強性免疫應(yīng)答反應(yīng)的組合物和方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及包含免疫調(diào)節(jié)蛋白或編碼該蛋白的核酸分子的增強和／或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的組合物，以及應(yīng)用這些蛋白和核酸分子的方法。免疫調(diào)節(jié)蛋白的輸送可用于免疫治療，并可結(jié)合疫苗輸送結(jié)合增強或定向調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。免疫調(diào)節(jié)蛋白可以是趨化因子，包括MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8和RANTES；粘附分子，包括選擇蛋白，如L-選擇蛋白、P-選擇蛋白和E-選擇蛋白，粘蛋白樣分子，如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1，整聯(lián)蛋白家族的成員，如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150．95，免疫球蛋白超家族的成員，如PECAM、ICAM類(如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3)、CD2和LFA-3；細胞因子，包括M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變型；共同刺激分子，如CD40和CD40L；生長因子，包括血管生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子和血管內(nèi)皮生長因子；受體分子，包括Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6；其它，包括蛋白酶類(Caspase(ICE))。
本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與其在真核細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連，該質(zhì)粒還包含編碼一種免疫原的核苷酸序列，該序列與其在真核細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連。該免疫原宜為一種病原抗原、癌癥相關(guān)抗原或與自身免疫疾病相關(guān)細胞關(guān)聯(lián)的抗原。
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)個體內(nèi)產(chǎn)生抵抗免疫原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予該個體一種質(zhì)粒的步驟，該質(zhì)粒包含編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連，該質(zhì)粒還包含編碼一種免疫原的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連。
本發(fā)明涉及一種免疫個體以抵抗病原體、癌癥或自身免疫疾病的方法，該方法包括給予該個體一種質(zhì)粒的步驟，該質(zhì)粒包含編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連，該質(zhì)粒還包含編碼一種免疫原的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連，其中該免疫原是病原抗原、癌癥相關(guān)抗原或與自身免疫疾病相關(guān)細胞關(guān)聯(lián)的抗原。
本發(fā)明涉及一種組合物，該組合物包含第一質(zhì)粒和第二質(zhì)粒，第一質(zhì)粒包含編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與其在真核細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連，第二質(zhì)粒包含編碼一種免疫原的核苷酸序列，該序列與其在真核細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連。在一些較佳的實施方案中，免疫原是病原抗原、癌癥相關(guān)抗原或與自身免疫疾病相關(guān)細胞關(guān)聯(lián)的抗原。
本發(fā)明涉及一種免疫個體抵抗病原體、癌癥或自身免疫疾病的方法，該方法包括給予該個體一種組合物的步驟，該組合物包含第一質(zhì)粒和第二質(zhì)粒，第一質(zhì)粒包含編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連，第二質(zhì)粒包含編碼一種免疫原的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連，其中該免疫原是病原抗原、癌癥相關(guān)抗原或與自身免疫疾病相關(guān)細胞關(guān)聯(lián)的抗原。
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)抵抗免疫原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予該個體一種組合物的步驟，該組合物包含第一質(zhì)粒和第二質(zhì)粒，第一質(zhì)粒包含編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連，第二質(zhì)粒包含編碼一種免疫原的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連。
本發(fā)明涉及一種改進的重組疫苗載體，它包含編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與其在真核細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連，它還包含編碼一種靶抗原的核苷酸序列，該序列與其在真核細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連。在較佳的實施方案中，該靶抗原是病原抗原、癌癥相關(guān)抗原或與自身免疫疾病相關(guān)細胞關(guān)聯(lián)的抗原。
本發(fā)明涉及一種免疫個體抵抗病原體、癌癥或自身免疫疾病的方法，該方法包括給予該個體一種重組疫苗載體的步驟，該載體包含編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連，它還包含編碼一種靶抗原的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連，其中該靶抗原是病原抗原、癌癥相關(guān)抗原或與自身免疫疾病相關(guān)細胞關(guān)聯(lián)的抗原。
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)抵抗靶抗原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予該個體一種重組疫苗載體的步驟，該載體包含編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連，它還包含編碼一種靶抗原的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連。
本發(fā)明涉及一種改進的減毒活疫苗，它包含編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與其在真核細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連。
本發(fā)明涉及一種免疫個體抵抗病原體、癌癥或自身免疫疾病的方法，該方法包括給予該個體一種減毒疫苗的步驟，該疫苗包含編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連。
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)個體內(nèi)產(chǎn)生抵抗免疫原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予該個體一種減毒疫苗的步驟，該疫苗包含編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與其在個體細胞中表達所需的調(diào)控元件操作性相連。
本發(fā)明涉及用來調(diào)節(jié)個體免疫系統(tǒng)的組合物和方法。本發(fā)明的方法包括將一種免疫調(diào)節(jié)蛋白給予該個體，其方法是給予免疫調(diào)節(jié)蛋白，或給予編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，作為表達載體的一部分或能將核苷酸序列以可表達形式輸送給個體的其它載體的一部分。
本發(fā)明涉及用來治療患自身免疫疾病個體的組合物和方法。本發(fā)明的方法包括給予這些個體一種組合物，該組合物包含與包括MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8和RANTES在內(nèi)的趨化因子特異性結(jié)合的抗體。
附圖簡述

圖1A和1B顯示了實施例2中討論的預(yù)加工的和成熟的IL-18。
圖2顯示了將ICAM-1(pCICAM-1)、LFA-3(pCLFA-3)、和VCAM-1(pCVACM-1)的基因克隆到pCDNA3表達載體中。
較佳實施方案詳述本發(fā)明得自特定蛋白能增強和／或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的發(fā)現(xiàn)。因此，這些蛋白可以作為免疫治療劑或疫苗組分來輸送。
本文所用的術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)蛋白”指本發(fā)明的增強和／或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的蛋白和核酸分子表達產(chǎn)物。因此，免疫調(diào)節(jié)蛋白可作為免疫治療劑或疫苗組分來輸送。
免疫調(diào)節(jié)蛋白包括趨化因子、粘附分子、細胞因子、共同刺激分子、生長因子和受體分子。
作為免疫調(diào)節(jié)蛋白的趨化因子包括MIP-1α、MIP-1β、RANTES、IL-8和MCP-1。
作為免疫調(diào)節(jié)蛋白的粘附分子包括選擇蛋白家族成員、粘蛋白樣分子、整聯(lián)蛋白家族成員以及免疫球蛋白超家族成員。
作為免疫調(diào)節(jié)蛋白的選擇蛋白家族成員包括L-選擇蛋白、P-選擇蛋白和E-選擇蛋白。
粘蛋白樣分子是選擇蛋白家族成員的配體。作為免疫調(diào)節(jié)蛋白的粘蛋白樣分子包括CD34、GlyCAM-1和MAdCAM-1。
作為免疫調(diào)節(jié)蛋白的整聯(lián)蛋白家族成員包括LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150．95。
作為免疫調(diào)節(jié)蛋白的免疫球蛋白超家族成員包括PECAM、ICAM類、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2和LFA-3。
作為免疫調(diào)節(jié)蛋白的細胞因子包括M-CSF、GM-CSF、G-CSF、CSF、IL-4和IL-18的突變型，該突變型缺失了原型蛋白而不是成熟型蛋白上的開頭大約35個氨基酸殘基。
作為免疫調(diào)節(jié)蛋白的共同刺激分子包括CD40和CD40配體(CD40L)。
作為免疫調(diào)節(jié)蛋白的生長因子包括血管生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子和血管內(nèi)皮生長因子。
作為免疫調(diào)節(jié)蛋白的受體分子包括Fas″死亡基因″表達產(chǎn)物、腫瘤壞死因子TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6；其它，包括蛋白酶類(ICE)。
其它分子包括蛋白酶類-1(ICE)。
根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，免疫調(diào)節(jié)蛋白的輸送是通過給予核酸分子來實現(xiàn)的，該核酸分子在被細胞吸收后受表達產(chǎn)生了該免疫調(diào)節(jié)蛋白。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，免疫調(diào)節(jié)蛋白的輸送是通過給予蛋白本身來實現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，免疫調(diào)節(jié)蛋白的輸送是通過給予核酸分子或蛋白來實現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，免疫調(diào)節(jié)蛋白的輸送是通過同時給予該核酸分子和該蛋白來實現(xiàn)的。
根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，給予免疫調(diào)節(jié)蛋白(無論是蛋白還是編碼該蛋白的核酸分子)作為疫苗組合物的一個組分或與疫苗組合物聯(lián)合使用的一種補充物。疫苗可以是亞單位疫苗、死的疫苗、減毒活疫苗、細胞疫苗、重組疫苗或核酸或DNA疫苗。在減毒活疫苗、細胞疫苗、重組疫苗或核酸或DNA疫苗的情況下，免疫調(diào)節(jié)蛋白可以由這些疫苗的核酸分子編碼。
免疫調(diào)節(jié)蛋白可用來誘導(dǎo)并增強細胞毒性T細胞(CTL)應(yīng)答，和／或誘導(dǎo)并增強抗體應(yīng)答，和／或誘導(dǎo)和增強T細胞增殖反應(yīng)。
誘導(dǎo)并增強CTL應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)蛋白在與抵抗胞內(nèi)病原、或自身免疫疾病或癌癥相關(guān)細胞的疫苗聯(lián)合或作為其一部分給藥時特別有用。能誘導(dǎo)并增強CTL應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)蛋白在與減毒活疫苗、細胞疫苗、重組疫苗和核酸／DNA疫苗聯(lián)合給藥時特別有用?；蛘撸苷T導(dǎo)并增強CTL應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)蛋白可用作免疫治療劑，將其給予患有癌癥或胞內(nèi)感染的患者。能誘導(dǎo)并增強CTL應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)蛋白可用來給予無免疫應(yīng)答的患者。
在與抵抗細菌、其它胞外病原體、或引起保護性抗體應(yīng)答的那些病毒(如乙型肝炎病毒)的疫苗聯(lián)合或作為其一部分給藥時，能誘導(dǎo)并增強抗體應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)蛋白是特別有用的。能誘導(dǎo)并增強抗體應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)蛋白在與亞單位疫苗聯(lián)合給藥時是特別有用的。另外，能誘導(dǎo)并增強抗體應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)蛋白可用作免疫治療劑，來給予患不希望的CTL免疫應(yīng)答的患者?；颊呙庖呦到y(tǒng)的這些變遷減少了CTL應(yīng)答引起的病理學(xué)損害。誘導(dǎo)并增強抗體應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)蛋白在給予無免疫應(yīng)答患者時是有用的。
能誘導(dǎo)并增強T細胞增殖反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)蛋白在與疫苗聯(lián)合或作為其一部分給藥時是特別有用的。另外，能誘導(dǎo)并增強T細胞增殖反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)蛋白可用作免疫治療劑。誘導(dǎo)并增強T細胞增殖反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)蛋白在給予無免疫應(yīng)答患者時是有用的。
趨化因子給予趨化因子或編碼該趨化因子的核酸分子將導(dǎo)致趨化因子的細胞表達增加。
MCP-1可特別用于誘導(dǎo)并增強CD8+CTL。
MIP-1α可特別用于誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。
IL-8可特別用于誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，并且是T輔助細胞應(yīng)答的強誘導(dǎo)物。
RANTES誘導(dǎo)TH1以及CTL應(yīng)答。
還可采用MIP-1β，如已經(jīng)克隆到pCDNA3中產(chǎn)生pCDNA3-MIP-1β的構(gòu)建物。
粘附分子選擇蛋白家族的成員L-選擇蛋白P-選擇蛋白E-選擇蛋白。
粘蛋白樣分子CD34GlyCAM-1，例如已經(jīng)克隆到pCDNA3中產(chǎn)生pCDNA3-GlyCAM-1的構(gòu)建物MadCAM-1整聯(lián)蛋白家族的成員
LFA-1VLA-1Mac-1p150．95免疫球蛋白超家族的成員PECAMICAM類ICMA-1ICAM-2ICAM-3CD2LFA-3。
在以核酸分子給藥時，粘附分子最有用。
在以核酸分子的形式、與疫苗(尤其是減毒活疫苗、細胞疫苗、重組疫苗和核酸／DNA疫苗)聯(lián)合或作為其一部分給予時，粘附分子是最有用的。
粘附分子可作為核酸分子用于輸送到腫瘤內(nèi)或病灶內(nèi)。
較佳的粘附分子包括ICAM-1、LFA-3和E-選擇蛋白。
ICAM-1對于CTL和增殖反應(yīng)而言是最佳的。
細胞因子M-CSFG-CSFCSF IL-4IL-18的突變型共同刺激分子CD40，例如可以采用將編碼CD40的cDNA克隆到pCDNA3中產(chǎn)生pCDNA3-CD40的構(gòu)建物CD40L生長因子血管生長因子，例如可以采用將編碼血管生長因子的cDNA克隆到pCDNA3中產(chǎn)生pCDNA3-VGF的構(gòu)建物IL-7神經(jīng)生長因子血管內(nèi)皮生長因子受體分子Fas″死亡基因″表達產(chǎn)物TNF受體FltApo-1p55WSL-1DR3TRAMPApo-3AIRLARDNGRFDR4DR5KILLERTRAIL-R2TRICK2DR6其它蛋白酶類(ICE)表1中列出了上述每一個免疫調(diào)節(jié)蛋白以及CD86(B7．2)的核苷酸和氨基酸序列的GENBANK登錄號和引用的雜志。
DNA疫苗在PCT／US90／01515、PCT／US93／02338、PCT／US93／048131、PCT／US94／00899以及其中引用的優(yōu)先權(quán)申請中有所描述，這些申請的每一個均納入本文作參考。除了這些申請中描述的輸送方法外，美國專利4，945，050和5，036，006中還描述了輸送DNA的其它方法，這些專利也都納入本文作參考。
本發(fā)明的一些方面涉及將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入個體的細胞中以便誘導(dǎo)針對該遺傳物質(zhì)編碼的蛋白和肽的免疫應(yīng)答的方法。該方法包括將將以下物質(zhì)給予所述個體的組織的步驟單個核酸分子，它包含了編碼所需肽和蛋白的核苷酸序列以及編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列；或是具有兩個核酸分子的組合物，一個核酸分子包含編碼所需肽或蛋白的核苷酸序列，另一個核酸分子包含編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。該核酸分子可以質(zhì)粒DNA的形式、重組載體的核酸分子形式、或作為減毒疫苗或細胞疫苗中提供的遺傳物質(zhì)之一部分的形式提供。另外，在一些實施方案中，免疫調(diào)節(jié)蛋白可以蛋白形式輸送。
根據(jù)一些實施方案，可將兩種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白的組合給予個體。在一些實施方案中，作為疫苗接種程序的一部分，可將編碼兩種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白之組合的基因與編碼免疫原和／或免疫原性蛋白的基因一起給予個體。在一些實施方案中，作為疫苗接種程序的一部分，可將免疫調(diào)節(jié)蛋白和編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因的組合與編碼免疫原和／或免疫原性蛋白的基因一起給予個體。在一些實施方案中，作為疫苗接種程序的一部分，可將兩種或多種蛋白的組合與編碼免疫原和／或免疫原性蛋白的基因一起給予個體。
根據(jù)一些實施方案，將免疫調(diào)節(jié)蛋白共同刺激分子CD86(B7．2)聯(lián)合給予個體。在一些實施方案中，作為疫苗接種程序的一部分，可將編碼CD86以及一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白的組合的基因與編碼免疫原和／或免疫原性蛋白的基因一起給予個體。在一些實施方案中，可將CD86蛋白和編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的基因的組合與編碼免疫原和／或免疫原性蛋白的基因一起給予個體，作為疫苗接種程序的一部分。在一些實施方案中，可將免疫調(diào)節(jié)蛋白和編碼CD86蛋白的基因的組合與編碼免疫原和／或免疫原性蛋白的基因一起給予個體，作為疫苗接種程序的一部分。在一些實施方案中，將CD86和一種或多種免疫調(diào)節(jié)蛋白的組合與編碼免疫原和／或免疫原性蛋白的基因一起給予個體，作為疫苗接種程序的一部分。在一些實施方案中，將編碼CD86和一種或多種趨化因子和／或粘附分子的組合的基因與編碼免疫原和／或免疫原性蛋白的基因一起給予個體，作為疫苗接種程序的一部分。在一些實施方案中，將編碼CD86和ICAM-1的組合的基因與編碼免疫原和／或免疫原性蛋白的基因給予個體，作為疫苗接種程序的一部分。
本發(fā)明的一些方面提供了用于預(yù)防性和／或治療性免疫個體以抵抗病原體、異常的疾病相關(guān)細胞的組合物和方法。遺傳物質(zhì)編碼的肽或蛋白具有待靶向的細胞或病原體上所見的免疫原性蛋白的至少一個相同的表位，以及該遺傳物質(zhì)編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白?；蛘?，在一些實施方案中，免疫調(diào)節(jié)蛋白可作為蛋白來輸送。
遺傳物質(zhì)由個體細胞所表達，并作為引發(fā)免疫應(yīng)答的免疫原性靶標。導(dǎo)致的免疫應(yīng)答有廣泛的基礎(chǔ)除了體液免疫應(yīng)答外，還引起了細胞免疫應(yīng)答兩枝(arm)。本發(fā)明的方法可用來提供預(yù)防性和治療性免疫力。因此，免疫方法包括抵抗免疫原從而(例如)保護個體以抵抗病原攻擊、或特異性細胞發(fā)生增殖的方法，以及治療患有病原感染、過度增殖疾病或自身免疫疾病的個體的方法。
本文所用的術(shù)語“靶蛋白”指由本發(fā)明基因構(gòu)建物編碼的肽和蛋白，它們起著免疫應(yīng)答反應(yīng)的靶蛋白的作用?！鞍械鞍住焙汀懊庖咴笨苫Q，指能夠引發(fā)針對它的免疫反應(yīng)的蛋白。靶蛋白是免疫原性蛋白，它與病原或不良細胞類型(例如癌細胞或與自身免疫疾病有關(guān)的需要對其免疫的細胞)的蛋白至少具有一個相同表位。針對靶蛋白的免疫反應(yīng)將保護和治療個體以抵御與靶蛋白有關(guān)的特定感染或疾病。
本發(fā)明可用于引發(fā)針對某靶蛋白(即與病原體、變應(yīng)原或個體自身的“異?！奔毎禺愋韵嚓P(guān)的蛋白)的廣泛的免疫應(yīng)答。本發(fā)明可用于免疫個體以抵抗病原性物質(zhì)和生物，由此，針對某病原蛋白的免疫應(yīng)答提供了抵抗該病原的保護性免疫力。本發(fā)明可用于抵抗過度增殖性疾病和紊亂(例如癌癥)，即引發(fā)針對與過度增殖細胞特異性相關(guān)的靶蛋白的免疫應(yīng)答。本發(fā)明可通過引發(fā)針對與參與自身免疫疾病的細胞特異性相關(guān)的靶蛋白的免疫應(yīng)答來抵抗自身免疫疾病和紊亂。
根據(jù)本發(fā)明的某些方面，編碼靶蛋白和免疫調(diào)節(jié)蛋白的DNA或RNA導(dǎo)入個體的組織細胞中，在其中表達，由此產(chǎn)生靶蛋白。編碼靶蛋白和免疫調(diào)節(jié)蛋白的DNA或RNA序列與其在個體細胞內(nèi)表達所需的調(diào)控元件相連接。DNA表達所需的調(diào)控元件包括啟動子和聚腺苷酸化信號。此外，此基因構(gòu)建物中還可包含諸如Kozak區(qū)之類的其它元件。
本文所用的術(shù)語“基因構(gòu)建物”指DNA或RNA分子，它包含一種核苷酸序列(該序列編碼靶蛋白，并包括與調(diào)控元件操作性相連的起始和終止信號(包括能指導(dǎo)接種疫苗個體細胞表達的啟動子和聚腺苷酸化信號))和／或一個核苷酸序列(該序列編碼了一種免疫調(diào)節(jié)蛋白，并包括與調(diào)控元件操作性相連的起始和終止信號(包括能指導(dǎo)接種疫苗個體細胞表達的啟動子和聚腺苷酸化信號))。在一些實施方案中，發(fā)現(xiàn)編碼靶蛋白的可表達形式序列與編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的可表達形式序列在輸送給個體的同一核酸分子中。在一些實施方案中，編碼靶蛋白的可表達形式序列和編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的可表達形式序列在不同的核酸分子中。在這些情況下，將兩種分子均輸送給該個體。
本文所用的術(shù)語“可表達形式”，指這樣的基因構(gòu)建物，它包含與靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼序列操作性相連的必需的調(diào)控元件，從而能夠在個體的細胞內(nèi)表達編碼序列。
本文所用的術(shù)語“有一個相同的表位”指蛋白含有至少一個表位與另一蛋白的表位完全相同或基本相似。
本文所用的術(shù)語“基本相似的表位”指該表位所具有的結(jié)構(gòu)與某蛋白的表位不相同，但是能夠引發(fā)與該蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的細胞或體液免疫應(yīng)答。
基因構(gòu)建物包含一個編碼靶蛋白和／或免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與基因表達所需的調(diào)控元件操作性相連。本發(fā)明還提供基因構(gòu)建物的組合，其中一個包含可表達形式的編碼靶蛋白的核苷酸序列，另一構(gòu)建物包含可表達形式的編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。將包含基因構(gòu)建物組合的DNA或RNA分子引入活細胞，使DNA或RNA表達并產(chǎn)生靶蛋白和免疫調(diào)節(jié)蛋白。結(jié)果增強了針對靶蛋白的免疫應(yīng)答。
當遺傳構(gòu)建物被細胞攝取時，它們可留在細胞內(nèi)作為功能性的染色體外分子，和／或整合到細胞的染色體DNA中?？梢詫NA以質(zhì)粒形式作為分離的遺傳物質(zhì)引入細胞?；蛘?，可將能夠與染色體整合的線性DNA引入細胞。在將DNA引入細胞后，可以加入促進DNA整合到染色體中的試劑。也可以在DNA分子內(nèi)包含促進整合的DNA序列?；蛘?，可以將RNA引入細胞。也可以考慮提供一種線性小染色體形式的遺傳構(gòu)建物，它具有著絲粒、端粒和復(fù)制起點?；驑?gòu)建物可以作為部分遺傳物質(zhì)留在生活于細胞內(nèi)的減毒活微生物或重組微生物載體內(nèi)?；驑?gòu)建物可以是重組病毒疫苗的基因組部分，此時，遺傳物質(zhì)或者整合到細胞染色體內(nèi)，或者留存在染色體外。
遺傳構(gòu)建物包括核酸分子基因表達所需的調(diào)控元件。這些元件包括啟動子、起始密碼子、終止密碼子和聚腺苷酸化信號。此外，為了編碼靶蛋白或免疫調(diào)節(jié)蛋白的序列的基因表達，常需要增強子。這些元件必須與編碼所需蛋白的序列操作性相連，而且這些調(diào)控元件必須在所給予的個體內(nèi)可操作。
起始密碼子和終止密碼子一般認為是編碼所需蛋白的核苷酸序列的一部分。但是，這些元件在給予基因構(gòu)建物的個體內(nèi)必須是有功能的。起始密碼子和終止密碼子必須與編碼序列在同一讀碼框內(nèi)。
所用的啟動子和聚腺苷酸化信號在個體的細胞內(nèi)必須是有功能的。
用于實施本發(fā)明，尤其是用于產(chǎn)生人用基因疫苗的啟動子例子包括但不限于猿病毒40(SV40)的啟動子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)的啟動子、人免疫缺陷病毒(HIV)的啟動子如HIV長末端重復(fù)序列(LTR)的啟動子、Moloney病毒啟動子、ALV啟動子、巨細胞病毒(CMV)的啟動子例如CMV立即早期啟動子、EB病毒的啟動子、Rous肉瘤病毒(RSV)的啟動子和例如人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸、人金屬硫蛋白等人基因的啟動子。
用于實施本發(fā)明，尤其是用于生產(chǎn)人用基因疫苗的聚腺苷酸化信號的例子包括但不限于牛生長激素聚腺苷酸化信號、SV40聚腺苷酸化信號和LTR聚腺苷酸化信號。特別是，本發(fā)明使用的是位于pCEP4質(zhì)粒(Invitrogen，San Diego CA)內(nèi)的SV40聚腺苷酸化信號，文中稱為SV40聚腺苷酸化信號。
除了DNA表達必需的調(diào)控元件外，DNA分子內(nèi)還可以包含其它元件。這些附加的元件包括增強子。增強子可以選自但不限于人肌動蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌酸和諸如CMV、RSV和EBV等病毒的增強子。
為了使構(gòu)建物保留在染色體外并在細胞內(nèi)產(chǎn)生構(gòu)建物的多個拷貝，可以提供具有哺乳動物復(fù)制起點的遺傳構(gòu)建物。Invitrogen(San Diego CA)的質(zhì)粒pCEP4和pREP4含有EB病毒復(fù)制起點和編碼核抗原EBNA-1的區(qū)域，它們產(chǎn)生高拷貝游離復(fù)制產(chǎn)物而不整合。在一些實施方案中，將編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的cDNA插入pCDNA3中。
在有關(guān)免疫接種應(yīng)用的較佳實施方案中，輸送的核酸分子包括編碼靶蛋白、免疫調(diào)節(jié)蛋白和進一步加強針對這些靶蛋白的免疫應(yīng)答的蛋白的基因的核苷酸序列。這些基因的例子是編碼其它細胞因子和淋巴因子的基因，例如編碼α干擾素、γ干擾素、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNF、上皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12的基因。在一些實施方案中，用于免疫接種組合物的遺傳構(gòu)建物中宜包含GM-CSF的基因。
如果出于某種原因需要消除接受該遺傳構(gòu)建物的細胞，可以加入作為細胞自毀靶子的其它元件。可以在遺傳構(gòu)建物中加入可表達形式的皰疹胸苷激酶(tk)基因。可以給予個體藥物甘克洛福(gangcyclovir)，該藥將選擇性地殺滅所有產(chǎn)生tk的細胞，從而提供了選擇性破壞具有該遺傳構(gòu)建物的細胞的方法。
為了盡可能擴大蛋白的生產(chǎn)，可以選擇調(diào)控序列使得它們很好地適合于在給予構(gòu)建物的細胞內(nèi)表達基因。而且，可以選擇在細胞內(nèi)最有效轉(zhuǎn)錄的密碼子。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠制造在細胞內(nèi)具有功能的DNA構(gòu)建物。
給藥途徑包括，但不局限于，肌內(nèi)、鼻內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、眼內(nèi)和口服，以及外用、透皮、通過吸入或栓劑或至粘膜組織，例如灌洗陰道、直腸、尿道、口腔頰部和舌下組織。較佳的給藥途徑包括粘膜組織、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)和皮下注射給藥。遺傳構(gòu)建物的給藥手段包括但不局限于，傳統(tǒng)的注射器、無針注射裝置或“微粒轟擊基因槍”。
本發(fā)明的藥物組合物含有大約1毫微克至2000微克DNA。在一些較佳的實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物含有大約5毫微克至1000微克DNA。在一些較佳的實施方案中，該藥物組合物含有大約10毫微克至800微克DNA。在一些較佳的實施方案中，該藥物組合物含有大約0．1至500微克DNA。在一些較佳的實施方案中，該藥物組合物含有大約1至350微克DNA。在一些較佳的實施方案中，該藥物組合物含有大約25至250微克DNA。在一些較佳的實施方案中，該藥物組合物含有大約100至200微克DNA。
本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)所用的給藥方式來配制。當藥物組合物是可注射的藥物組合物時，它們是無菌、無熱原和無顆粒的。宜采用等滲的制劑。通常，等滲性添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露糖、山梨糖和乳糖。在一些情況下，等滲溶液如磷酸緩沖鹽溶液是較佳的。穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。在一些實施方案中，在制劑中加入血管收縮劑。
在有些實施方案中，將核酸分子與多核苷酸功能增強劑或遺傳疫苗促進劑一起輸送給細胞。多核苷酸功能增強劑在1993年1月26日提交的美國專利申請08／008，342，1993年3月11日提交的美國專利申請08／029，336，1993年9月21日提交的美國專利申請08／125，012以及1994年1月26日提交的國際專利申請PCT／US94／00899中有所描述，以上申請均被納入本文作為參考。遺傳疫苗促進劑在1994年4月1日提交的美國專利申請08／221，579中有所描述，該文也被納入本文作參考。與核酸分子聯(lián)合給予的輔助劑可以與核酸分子混合給予，或者在給予核酸分子的同時、之前或之后分開給予。此外，具有轉(zhuǎn)染劑和／或復(fù)制劑和／或促炎劑功能并能和GVF一同給予的其它物質(zhì)包括生長因子、細胞因子和淋巴因子，例如α干擾素、γ干擾素、血小板衍生生長因子(PDGF)、TNF、上皮生長因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12以及成纖維細胞生長因子，表面活性劑(如免疫刺激性復(fù)合物(ISCOMS))，弗氏不完全佐劑，LPS類似物(包括單磷酸脂A(MPL))，胞壁酰肽，醌類似物和諸如角鯊烯和角鯊烯之類的泡囊，和透明質(zhì)酸，它們可以和遺傳構(gòu)建物聯(lián)合給予。在一些實施方案中，免疫調(diào)節(jié)蛋白可用作GVF。
輸送給本發(fā)明的細胞的核酸分子可作為起預(yù)防性和／或治療性免疫劑作用的蛋白的遺傳模板。在較佳的實施方案中，核酸分子包含有該編碼區(qū)在動物細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的調(diào)控序列。
本發(fā)明可用來免疫個體以抵抗所有病原體，例如病毒、原核生物以及病原性真核生物(如單細胞病原性生物和多細胞病原性寄生蟲)。本發(fā)明可特別用來免疫個體以抵抗能感染細胞且沒有莢膜的那些病原體，例如病毒、原核生物(如淋病菌、李斯特菌和志賀氏菌)。另外，本發(fā)明還可用來免疫個體以抵抗原生動物病原體，它們在原生動物生命周期中的一個階段是胞內(nèi)病原體。本文所用的術(shù)語“細胞內(nèi)病原體”指這樣的病毒或病原性生物，它的至少一部分繁殖或生命周期存在于宿主細胞內(nèi)，并在其中產(chǎn)生或?qū)е庐a(chǎn)生病原體蛋白。表2提供了可制得本發(fā)明的疫苗的一些病毒家族和病毒屬的清單。在疫苗中可采用這樣的DNA構(gòu)建物，該構(gòu)建物包含的DNA序列所編碼的肽包含至少一個與病原體抗原(如表中列出的那些抗原)上展示的表位相同或基本相似的表位。另外，本發(fā)明還可用來免疫個體以抵抗其它病原體，它們包括例如表3中列出的原核生物和真核原生動物病原體以及多細胞寄生生物。
為了生產(chǎn)提供抗病原感染保護作用的基因疫苗，必需在基因構(gòu)建物中包括編碼免疫原性蛋白的基因編碼序列作為靶蛋白的編碼序列，所述的免疫原性蛋白能夠引起針對它的保護性免疫應(yīng)答。不論病原是胞內(nèi)感染(對此，本發(fā)明尤其適用)還是胞外感染，不可能所有的病原性抗原都引發(fā)保護性應(yīng)答。因為DNA和RNA都較小，而且較容易生產(chǎn)，本發(fā)明還提供了多價病原性抗原免疫接種的額外優(yōu)點。用于基因疫苗的基因構(gòu)建物可以包括編碼多種病原性抗原的基因物質(zhì)。例如，可將數(shù)個病毒基因包括在一個構(gòu)建物中，由此提供了多種靶標。
表2和表3列出了一些病原性因子和生物的名單，可以制備針對它們的基因疫苗以保護個體避免被它們感染。在某些優(yōu)選的實施方案中，免疫個體抵抗病原的方法所針對的是HIV、HTLV或HBV。
本發(fā)明的另一方面提供了一種給予基礎(chǔ)廣泛的保護性免疫應(yīng)答來抵抗以過度增殖性疾病為特征的過度增殖性細胞的方法，還涉及治療過度增殖性疾病患者的方法。本文所用的術(shù)語“過度增殖性疾病”指以細胞的過度增殖為特征的疾病或紊亂。過度增殖性疾病的例子包括所有形式的癌癥和牛皮癬。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將包含編碼免疫原性“過度增殖細胞”相關(guān)蛋白的核苷酸序列的基因構(gòu)建物引入個體細胞，導(dǎo)致在個體的受接種細胞內(nèi)產(chǎn)生了這些蛋白。本文所用的術(shù)語“過度增殖性相關(guān)蛋白”指與過度增殖性疾病相關(guān)的蛋白。為了免疫接種以抵抗過度增殖性疾病，需給予個體包含編碼過度增殖性疾病相關(guān)蛋白的核苷酸序列的基因構(gòu)建物。
為了使過度增殖相關(guān)蛋白成為有效的免疫原性靶標，該蛋白必需只在過度增殖細胞內(nèi)產(chǎn)生，或在過度增殖細胞內(nèi)的產(chǎn)生水平高于正常細胞。靶抗原包括這樣的蛋白、其片段和肽，它們至少包含上述蛋白中的一個表位。有時，過度增殖相關(guān)蛋白是編碼某蛋白的基團發(fā)生突變的產(chǎn)物。突變基因編碼的蛋白與正常蛋白幾乎相同，僅因細微的氨基酸序列差異產(chǎn)生了一個正常蛋白上沒有的不同表位。這樣的靶蛋白包括由諸如myb，myc，fyn之類的致癌基因和轉(zhuǎn)位基因bcr／abl，ras，src，P53，neu，trk編碼的蛋白和EGRF。除了作為靶抗原的致癌基因產(chǎn)物之外，用于抗癌治療和保護性治療的靶蛋白還包括B細胞淋巴瘤產(chǎn)生的抗體的可變區(qū)和T細胞淋巴瘤的T細胞受體的可變區(qū)，在一些實施方案中，它們也可用作自身免疫疾病的靶抗原。還可以用其它腫瘤相關(guān)蛋白作為靶蛋白，例如在腫瘤細胞內(nèi)含量較高的蛋白，包括單克隆抗體17-1A識別的蛋白和葉酸結(jié)合蛋白。
雖然本發(fā)明可用于免疫個體以抵抗一種或多種形式的癌癥，但本發(fā)明尤其適用于對個體進行預(yù)防性免疫接種，所述個體具有發(fā)生某種癌癥的傾向或曾經(jīng)患有癌癥因而易復(fù)發(fā)。遺傳學(xué)和基因技術(shù)以及流行病學(xué)的發(fā)展使得確定個體發(fā)生癌癥的可能性和進行這方面的風(fēng)險評估成為可能。用遺傳篩選和／或家族健康史，有可能預(yù)測特定個體發(fā)生數(shù)種癌癥中任何一種的可能性。
類似的，那些已經(jīng)患癌癥的個體和已接受治療去除癌癥的或處于緩解期的個體尤其易復(fù)發(fā)。作為治療方法的一部分，為了戰(zhàn)勝復(fù)發(fā)，可以針對已確診的癌癥對個體進行免疫接種。這樣，一旦得知某個體曾患有某種癌癥并有復(fù)發(fā)的危險，就可對他們進行免疫接種，使其免疫系統(tǒng)作好準備以抵抗任何將出現(xiàn)的癌癥。
本發(fā)明提供了一種治療過度增殖性疾病患者的方法。在這些方法中，引入的基因構(gòu)建物起免疫治療劑的作用，引導(dǎo)和促進個體的免疫系統(tǒng)戰(zhàn)勝產(chǎn)生靶蛋白的過度增殖細胞。
本發(fā)明提供了治療患自身免疫疾病和紊亂的個體的方法，方法是賦予基礎(chǔ)廣泛的保護性免疫應(yīng)答以抵抗與自身免疫相關(guān)的靶抗原，包括細胞受體和產(chǎn)生針對“自身”的(self-derected)抗體的細胞。
T細胞介導(dǎo)的自身免疫疾病包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)，多發(fā)性硬化(MS)，Sjogren綜合征，肉樣瘤病，胰島素依賴性糖尿病(IDDM)，自身免疫甲狀腺炎，反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，僵硬性脊椎炎，硬皮病，多肌炎，皮肌炎，牛皮癬，脈管炎，韋格納氏肉芽腫病，Crohun疾病和潰瘍性結(jié)腸炎。上述疾病的特征均在于T細胞受體結(jié)合內(nèi)源性抗原，由此引發(fā)與自身免疫疾病有關(guān)的炎性級聯(lián)反應(yīng)。針對T細胞可變區(qū)的疫苗接種將引發(fā)包括CTL在內(nèi)的免疫應(yīng)答，以消除那些T細胞。
在RA中，已經(jīng)特征性地描述了參與該疾病的T細胞受體(TCR)的數(shù)個特異性可變區(qū)。這些TCR包括Vβ-3，Vβ-14，Vβ-17和Vα-17。這樣，用編碼這些蛋白至少之一的DNA構(gòu)建物作疫苗接種，將引發(fā)針對參與RA的T細胞的免疫應(yīng)答。參見Howell，M．D．等，1991 Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8810921-10925；Paliard，X．等，1991Science 253，325-329；Williams．W．C．等1992．J．Clin．Invest．90326-333；以上均被納入本文作參考。
在MS中，已經(jīng)特征性地描述了參與該疾病的TCR的數(shù)種特異性可變區(qū)。這些TCR包括Vβ-7和Vα-10。這樣，用編碼這些蛋白至少之一的DNA構(gòu)建物作疫苗接種，將引發(fā)針對參與MS的T細胞的免疫應(yīng)答。參見Wucherpfennig，K．W．等，1990Science 2481016-1019；Oksenberg，J．R．等，1990 Nature 345344-346；以上均被納入本文作參考。
在硬皮病中，已經(jīng)特征性地描述了參與該疾病的TCR的數(shù)種特異性可變區(qū)。這些TCR包括Vβ-6，Vβ-8，Vβ-14和Vα-16，Vα-3C，Vα-7，Vα-14，Vα-15，Vα-16，Vα-28和Vα-12。這樣，用編碼這些蛋白至少之一的DNA構(gòu)建物接種，將引發(fā)針對參與硬皮病的T細胞的免疫應(yīng)答。
為了治療T細胞介導(dǎo)的自身免疫疾病患者，尤其是TCR可變區(qū)尚待特性分析的疾病患者，可以進行滑液活檢?？梢蕴崛『蠺細胞的樣品，用標準技術(shù)鑒定那些TCR的可變區(qū)。利用以上信息就可以制備基因疫苗。
B細胞介導(dǎo)的自身免疫疾病包括狼瘡(SLE)，格雷夫斯病，重癥肌無力，自身免疫溶血性貧血，自身免疫血小板減少癥，哮喘，冷球蛋白血癥、原發(fā)性膽管硬化和惡性貧血。這些疾病的特征均在于抗體結(jié)合內(nèi)源抗原，并引發(fā)與自身免疫疾病相關(guān)的炎性級聯(lián)反應(yīng)。用針對這些抗體可變區(qū)的疫苗接種，將引發(fā)包括CTL在內(nèi)的免疫應(yīng)答，從而消滅產(chǎn)生這些抗體的B細胞。
為了治療B細胞介導(dǎo)的自身免疫疾病患者，必須鑒定出參與自身免疫活動的那些抗體的可變區(qū)。可以進行活檢，取炎癥部位的抗體樣品。用標準技術(shù)鑒定那些抗體的可變區(qū)。利用這一信息就可以制備出基因疫苗。
在SLE情況下，一個抗原被認為是DNA。這樣，可以在待接受抗SLE免疫的患者中篩選其血清抗DAN抗體，然后制備出包括編碼血清中抗DNA抗體可變區(qū)的DNA構(gòu)建物的疫苗。
TCR和抗體的可變區(qū)的共同結(jié)構(gòu)特征是眾所周知的。通常可用下列熟知的方法來找到編碼特定TCR或抗體的DNA序列，這些方法例如在Kabat等，1987，“免疫學(xué)感興趣的蛋白的序列”U．S．Department of Health and Human Services，Bethesda MD中有所描述，本文將其納入作為參考。此外，克隆克隆功能性可變區(qū)的常用方法可在Chaudhary，V．K．等，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 871066中找到，本文將其納為參考。
除了用可表達形式的免疫調(diào)節(jié)蛋白編碼序列來改進基因疫苗外，本發(fā)明還涉及改進的減毒活疫苗和利用重組載體輸送編碼抗原的外源基因的改良疫苗。減毒活疫苗和利用重組載體輸送外源抗原的疫苗的實例可參見美國專利4，722，848；5，017，487；5，077，044；5，110，587；5，112，749；5，174，993；5，223，424；5，225，336；5，240，703；5，242，829；5，294，441；5，294，548；5，310，668；5，387，744；5，389，368；5，424，065；5，451，499；5，453，364；5，462，734；5，470，734和5，482，713，以上這些專利均納入本文作參考。本發(fā)明提供的基因構(gòu)建物包括編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與可在受接種者體內(nèi)有效實現(xiàn)表達功能的調(diào)控序列操作性相連。將基因構(gòu)建物摻入減毒活疫苗和重組疫苗中，產(chǎn)生本發(fā)明的改良疫苗。
本發(fā)明提供了一種免疫接種個體的改進方法，它包括將基因構(gòu)建物作為疫苗組合物的一部分輸送給個體細胞的步驟，該疫苗組合物包括DNA疫苗，減毒活疫苗和重組疫苗。基因構(gòu)建物包括編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，該序列與能在受免疫者體內(nèi)有效實現(xiàn)表達功能的調(diào)控序列操作性相連。此改良疫苗可產(chǎn)生加強的細胞免疫應(yīng)答。
本發(fā)明的另一方面涉及GM-CSF或編碼GM-CSF的核酸分子或兩種與一DNA疫苗之組合的應(yīng)用，針對所述DNA疫苗的強抗體應(yīng)答或輔助性T細胞應(yīng)答是特別希望的。這種疫苗的一個例子是針對乙型肝炎病毒的疫苗。其它例子包括胞外病原體和變應(yīng)原。GM-CSF、編碼GM-CSF的核酸分子或兩者與一種DNA疫苗組合的給藥也適用于鑒定為無免疫應(yīng)答的個體的疫苗接種。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及抗趨化因子抗體治療自身免疫疾病患者的應(yīng)用。自身免疫疾病如上所述?？冠吇蜃涌贵w包括對MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8或RANTES有特異性的抗體?？梢越o予懷疑患這些疾病的患者治療有效量的抗趨化因子抗體，以減少或緩解癥狀。
治療自身免疫疾病的藥物組合物包括對趨化因子有特異性的抗體以及藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)較佳的實施方案，組合物是可注射的。無菌的、無熱原的無顆粒的可注射組合物包括一種或多種對趨化因子有特異性的抗體以藥學(xué)上可接受的載體或注射載體。
抗體用制備單抗的常規(guī)方法制得。載體可選自本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的那些載體。載體的一個例子是無菌鹽水。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能用標準技術(shù)和容易獲得的原料來生產(chǎn)特異性結(jié)合MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8或RANTES的單克隆抗體。生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)在Harlow，E．和D．Lane，(1988)《抗體實驗手冊》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor NY中有所描述，該文被納入本文作參考，其中提供了關(guān)于生產(chǎn)特異性結(jié)合靶蛋白的雜交瘤和單克隆抗體的詳細指導(dǎo)。
簡言之，將趨化因子注射入小鼠中。取出小鼠的脾臟，分離脾細胞并與無限增殖的小鼠細胞融合。培養(yǎng)雜交的細胞或雜交瘤，選出分泌抗體的那些細胞。分析抗體，如果發(fā)現(xiàn)與感興趣蛋白特異性結(jié)合，則培養(yǎng)產(chǎn)生它們的雜交瘤，以產(chǎn)生持續(xù)供應(yīng)的抗原特異性抗體。
根據(jù)本發(fā)明，可用對MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8或RANTES的特異性抗體來治療自身免疫疾病。因此，用CMP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8或RANTES來產(chǎn)生雜交瘤。編碼這些蛋白的基因是眾所周知的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易獲得。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠制備用來實施本發(fā)明的抗體。除了嚙齒類抗體外，本發(fā)明還涉及人抗體、人化抗體、Fab和嵌合抗體以及與MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8或RANTES結(jié)合的Fab，它們可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用常規(guī)方法來生產(chǎn)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能容易地確定患有或易患自身免疫疾病的個體。
組合物可包括額外的組分來使它們更有效。例如，本發(fā)明的組合物可包含多種抗趨化因子抗體，包括對不同趨化因子有特異性的抗體以及對同一趨化因子的不同表位有特異性的抗體。
可以給予約5微克至5000毫克的抗體。在一些較佳的實施方案中，可以給予50微克至500毫克。在其它較佳的實施方案中，可以給予500微克至50毫克。在一個較佳的實施方案中，可以給予5毫克抗體。
可通過合適的途徑給予該組合物，例如口服、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給藥。在一些實施方案中，靜脈內(nèi)給藥是較佳的。
在初次給藥后，可以再次給藥來強化個體。在一些較佳的實施方案中，進行多次給藥。
實施例實施例1引言為了從分子上仔細研究趨化因子在免疫應(yīng)答中的具體作用，我們將編碼α-趨化因子IL-8的cDNA以及編碼β-趨化因子MIP-1α、RANTES和MCP-1的cDNA各個克隆到表達載體中，將它們與編碼HIV-1包膜蛋白或gag／pol蛋白的DNA免疫原一起共同免疫接種。用這些DNA疫苗構(gòu)建物作為模型抗原，我們通過分析這樣免疫后誘導(dǎo)的抗原特異性體液和細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答來檢查趨化因子基因表達在免疫應(yīng)答發(fā)展中的具體作用。我們發(fā)現(xiàn)趨化因子在激活和調(diào)節(jié)抗原特異性免疫應(yīng)答中有具體的可鑒定的作用。
結(jié)果DNA疫苗接種誘導(dǎo)趨化因子用50微克pCDNA3(對照)、pCEnv或pCGag／pol免疫小鼠。兩周后，處死小鼠，收獲它們的脾臟，分離獲得它們的淋巴細胞。通過抗原-特異性刺激(用固定的重組牛痘感染的刺激細胞)在體外刺激這些細胞5天。我們從效應(yīng)細胞中收集培養(yǎng)上清液，測試它們釋放趨化因子MIP1-α、MIP1-β和RANTES的情況。我們發(fā)現(xiàn)，用pCEnv或pCGag／pol的DNA免疫所誘導(dǎo)的β-趨化因子MIP1-α、MIP1-β和RANTES的表達水平明顯高于對照載體。該增加早在第一次免疫后兩周就已出現(xiàn)，提示β-趨化因子可能調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫應(yīng)答。為了確定趨化因子對于抗原特異性應(yīng)答的影響，然后我們研究了它們對于DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的影響。
趨化因子表達盒的構(gòu)建用Kim，J．J．，D．B．Weiner(1997)Spring Sem Immunopathol 19 174-195；Kim，J．J．等人，(1997)Nature Biot．15，641-645；和Kim，J．J．，等人(1997)J．Immunol．158，816-826中描述的方法(這些內(nèi)容均納入本文作參考)，將趨化因子IL-8、MIP1-α、MCP-1和RANTES的基因分別克隆到pCDNA3質(zhì)粒表達載體中。通過對完整插入物(包括5′和3′側(cè)接序列)進行序列分析，驗證這些趨化因子表達盒。另外，將這些趨化因子構(gòu)建物體外轉(zhuǎn)染入RD細胞，通過采用有關(guān)抗體的免疫沉淀或通過趨化因子ELISA驗證這些構(gòu)建物的表達。IL-8、MIP1-α、MCP-1和RANTES的表達構(gòu)建物也用作疫苗來免疫接種到小鼠體內(nèi)。經(jīng)材料和方法中描述的體內(nèi)表達技術(shù)確定，這些構(gòu)建物在小鼠肌肉組織體內(nèi)表達了它們所編碼的趨化因子。
IL-8是一種T輔助細胞應(yīng)答的強誘導(dǎo)物單獨分析各種趨化因子對于疫苗誘導(dǎo)的應(yīng)答的影響。收集pCEnv和pCEnv+IL-8免疫小鼠的抗血清，用ELISA分析針對HIV-1 gp120蛋白的特異性抗體應(yīng)答。測定在DNA免疫后0、2、4和6周收集的血清的gp120-特異性抗體滴度。在1∶128稀釋度下，pCEnv+IL-8免疫組的血清顯示出針對gp120的抗體應(yīng)答比單用pCEnv的免疫組高。用pCGag／pol免疫的組觀察到了相似的結(jié)果。另外，測定和IL-8共同給予所誘導(dǎo)的gp120-特異性IgG的亞類。IgG1型的產(chǎn)生由Th2型細胞因子誘導(dǎo)，而IgG2a型的產(chǎn)生由Th1型細胞因子誘導(dǎo)。測定IgG1與IgG2a(Th2與Th1)的相對比值。pCEnv免疫組的IgG1與IgG2的比值為1．3。另一方面，pCEnv+IL-8的共注射將該相對比值減少至0．9，這表明向Th1型應(yīng)答移動。因此，IL-8影響抗原特異性應(yīng)答的質(zhì)和量。
還檢查IL-8表達對T輔助細胞增殖反應(yīng)的影響。IL-8與HIV-1免疫原(pCEnv或pCGag／pol)的共表達產(chǎn)生了水平明顯的抗原特異性T輔助細胞增殖反應(yīng)。增殖的增加在4至6倍之間，抗原特異性應(yīng)答的這種增加是顯著的。另外，還調(diào)查了IL-8共表達對所誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答的影響。在對照動物中發(fā)現(xiàn)了本底水平的特異性殺傷作用，而單用pCEnv免疫的動物顯示出小而恒定水平的CTL應(yīng)答。IL-8的共給予對于抗原特異性CTL應(yīng)答沒有任何增強作用。從pCGag／pol+IL-8的共免疫觀察到了相似的CTL結(jié)果。
在免疫應(yīng)答期間，細胞因子在指引和靶向免疫細胞中起關(guān)鍵作用。例如，IFN-γ復(fù)雜地參與調(diào)節(jié)T細胞介導(dǎo)的細胞毒性免疫應(yīng)答，而IL-4在B細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起主要作用。TNF-α由激活的巨噬細胞和單核細胞、中性粒細胞、激活的淋巴細胞和NK細胞產(chǎn)生，已有人提出TNF-α在調(diào)節(jié)其它促炎性細胞因子合成中起關(guān)鍵作用。我們分析了用于CTL試驗的體外刺激的效應(yīng)細胞的上清液，并測試它們釋放細胞因子IFN-γ、IL-4和TNF-α的情況。我們發(fā)現(xiàn)，IL-8的表達只稍稍增加了TNF-γ的水平，但它沒有影響細胞因子IL-4和TNF-α的水平。這多少有點令人驚奇，因為IL-8的共輸送對于體液應(yīng)答的顯著作用可能預(yù)計對IL-4有顯著的作用。然而，并沒有觀察到這種情況。
MIP1-α是抗體應(yīng)答的強誘導(dǎo)物MIP1-α的共表達在誘導(dǎo)抗原特異性體液應(yīng)答中顯示出比IL-8更顯著的影響。PCEnv+MIP1-α的共免疫導(dǎo)致包膜特異性抗體應(yīng)答顯著增加。用pCGag／pol免疫的組也看到了相似的結(jié)果。測定共給予pCEnv+MIP1-α后IgG1與IgG2a的相對比值。pCEnv免疫組的IgG1與IgG2a比值為1．3。另一方面，pCEnv+MIP1-α的共注射使該相對比值減少至1．7，這表明向Th2-型應(yīng)答移動。MIP1-α與HIV-1免疫原(pCEnv或PCGag／pol)的共表達導(dǎo)致抗原特異性T輔助細胞增殖反應(yīng)增強。相反，MIP1-α的免疫接種對抗原特異性CTL應(yīng)答或細胞因子的誘導(dǎo)的作用很小。同樣，如分析IL-8對于細胞因子產(chǎn)生的影響中所觀察到的那樣，注意到對IL-4水平?jīng)]有影響。
RANTES誘導(dǎo)Th1和CTL應(yīng)答然后，我們檢查了RANTES的共輸送對疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的影響。與IL-8或MIP1-α不同，RANTES與pCEnv的共表達沒有增強HIV-1包膜特異性抗體應(yīng)答。另外，pCEnv-RANTES的共免疫對于IgG1-IgG2a比值(與單用pCEnv免疫的組相比)沒有影響。與抗體應(yīng)答相反，RANTES與HIV-1免疫原(pCEnv或pCGag／pol)共同疫苗接種導(dǎo)致抗原特異性T輔助細胞增殖反應(yīng)顯著增加。另外，在pCEnv和RANTES共給予的組中注意到Th1細胞因子IFN-γ和TNF-α的表達水平高出兩倍。與pCEnv+IL-8或pCEnv-MIP-1α的共注射導(dǎo)致對CTL活性的影響很小所不同的是，在用pCEnv+RANTES共注射后，注意到對感染表達HIV-1包膜的牛痘(vMN462)的靶細胞的特異性殺傷作用有更為顯著的增加。在效靶(E∶T)之比為50∶1時，共注射pCEnv和RANTES后，注意到靶細胞有36％以上特異性裂解。同樣，用pCGag／pol+RANTES免疫小鼠，結(jié)果導(dǎo)致感染表達HIV-1 gag／pol的牛痘(vVK1)的靶細胞的抗原特異性CTL裂解明顯增強。RANTES的共輸送看來使所得應(yīng)答向Th1型表型移動，因為再次發(fā)現(xiàn)對IL-4無影響。
MCP-1誘導(dǎo)CTL應(yīng)答下面觀察MCP-1 cDNA的佐劑性能。MCP-1看來對pCEnv免疫所誘導(dǎo)的特異性抗體結(jié)合的影響很小。另外，MCP-1與HIV-1免疫原(pCEnv或pCGag／pol)的共表達對于抗原特異性T輔助細胞增殖反應(yīng)有正的增強作用，但該增強作用較小(兩倍)。測定共給予pCEnv+MCP-1后IgG1與IgG2a的相對比值。pCEnv免疫組的IgG1與IgG2a比值為1．3。另一方面，pCEnv+MCP-1的共注射使該相對比值減少至1．0，這表明向Th1-型應(yīng)答移動。在用pCEnv+MCP-1共注射后，注意到特異性殺傷作用有更顯著的增加。在效靶(E∶T)之比為50∶1時，共注射pCEnv和MCP-1后，觀察到靶細胞有36％以上的特異性裂解。同樣，用pCGag／pol+MCP-1免疫小鼠，結(jié)果導(dǎo)致表達HIV-1 gag／pol的靶細胞的抗原特異性CTL裂解明顯增加。pCEnv+MCP-1免疫的小鼠釋放的IFN-γ水平明顯高于pCEnv免疫組或?qū)φ战M。同樣，所有組釋放的IL-4的水平是相似的。而且，pCEnv+MCP-1免疫組釋放的TNF-α水平明顯高于pCEnv免疫組或?qū)φ战M。這些細胞因子釋放數(shù)據(jù)支持了我們的CTL結(jié)果，即說明了MCP-1在激活CD8+CTL中的作用。
CTL應(yīng)答中CD8局限性的確定為了確定靠MCP-1和RANTES的共表達所增加的CTL應(yīng)答是否局限于CD8+T細胞，用HIV-1包膜肽(RIHIGPGRAFYTTKN)進行CTL試驗，該肽已證明是balb／c小鼠的MHCⅠ型限制性CTL的特異性表位。讓小鼠接受相隔兩周的兩次各50微克DNA構(gòu)建物的免疫接種，在第二次免疫后1周收獲它們的脾臟。在用包膜特異性肽體外刺激后，對分離的脾細胞進行CTL試驗。我們觀察到，在E∶T比為50∶1時，MCP-1以及RANTES共注射后的CTL應(yīng)答均有明顯增強，特異性殺傷作用分別為35％和26％。我們驗證了該觀察結(jié)果，方法是在通過補體溶解從效應(yīng)細胞群中除去CD8+T細胞后測定CTL活性。CD8+T細胞的除去導(dǎo)致與MCP-1以及與RANTES共注射后所見的抗原特異性CTL增強被抑制。這些結(jié)果表明，溶細胞活性的增強是抗原特異性的，Ⅰ類限制性的，并且依賴于CD8+T細胞。
趨化因子表達的增強重要的是要確定那些特異性趨化因子輔助的免疫原對于趨化因子產(chǎn)生本身的影響(如果有的話)。我們檢查了從受免疫動物收集得到的受刺激細胞的趨化因子MIP1-α、MIP1-β、RANTES和MCP-1的表達。趨化因子的共注射以趨化因子特異性方式調(diào)節(jié)了趨化因子的產(chǎn)生。我們作了幾個重要的觀察。另外，我們發(fā)現(xiàn)，與趨化因子基因的共免疫導(dǎo)致受刺激細胞的趨化因子表達增加。例如，我們發(fā)現(xiàn)，通過用pCEnv+MIP1-α共免疫，MIP1-α表達可顯著增加超過單用pCEnv免疫時的表達水平。另外，我們發(fā)現(xiàn)pCEnv+MCP-1和pCEnv+RANTES(兩種CTL應(yīng)答最明顯的誘導(dǎo)物)的免疫大大增加了MIP1-β的表達。另外，pCEnv+MIP1-α、pCEnv+MCP-1以及pCEnv+RANTES的共免疫導(dǎo)致受刺激細胞的RANTES表達顯著增強。最后，用pCEnv+MIP1-α和pCEnv+MCP-1共免疫獲得的MCP-1表達最高。
討論炎性反應(yīng)的免疫啟動是一個復(fù)雜的過程，它涉及細胞粘附分子、細胞因子和趨化因子的密切協(xié)調(diào)的表達。在白細胞從血管移動到宿主防御機制外周部位的分子調(diào)節(jié)中，趨化因子是尤其重要的。趨化因子超家族由20個以上的相關(guān)蛋白組成。根據(jù)保守的半胱氨酸殘基的存在和位置，趨化因子可廣泛地分為三個家族C-X-C(α)、C-C(β)和C(γ)。在α家族的成員中，前兩個半胱氨酸被另一個氨基酸隔開，而β家族的前兩個半胱氨酸是彼此毗鄰的。目前只鑒定出γ家族中的兩個成員，它們的N端均含有一個而不是兩個半胱氨酸。
每個亞家族的成員具有獨特的以及重疊的活性。盡管確切的生理和病理性功能還未清楚確定，但是從文獻中可以找到某些簡化的概括。總之，已經(jīng)報道說，C-X-C家族的成員是多形核白細胞(包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞)的化學(xué)引誘物和激活劑。相反，C-C家族的成員起單個核細胞(如單核細胞和淋巴細胞)的趨化因子作用。另一方面，據(jù)報道C-X-C趨化因子IL-8和IP-10對T淋巴細胞有趨化性，而C-C趨化因子MCP-1、MPC-3、RANTES和MIP-1α對嗜堿性粒細胞也有趨化性?？傊吇蜃拥墓δ芸磥硎窃谘仔圆课荒技图せ畎准毎?。
除了它們在炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答中的功能外，一些趨化因子在導(dǎo)致AIDS的HIV1型和2型病毒的傳播和進展中起關(guān)鍵作用。早在10年前，就已經(jīng)預(yù)計到HIV包膜糖蛋白gp120與CD4的結(jié)合不足以導(dǎo)致病毒融合和進入，這提示HIV感染還需要附加的細胞表面協(xié)同因子。最近研究鑒定出親T細胞性和親巨噬細胞性病毒與它們的靶細胞的融合所需要的協(xié)同受體分別是CXCR-4和CCR-5。
CXCR-4，也稱為融合(fusion)或LESTR，最初被發(fā)現(xiàn)是結(jié)構(gòu)與趨化因子受體相似的孤兒受體。隨后，鑒定出CXCR-4是親T細胞性HIV病毒進入CD4+細胞所必需的輔因子。β-趨化因子SDF-1是CXCR-4的配體，它是一種親T細胞型HIV-1病毒株感染的強效抑制劑。類似地，β趨化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES是CCR-5的天然配體，它們是CD8+T細胞產(chǎn)生的針對親巨噬細胞性、而不是親T細胞性HIV分離株的主要HIV抑制性因子。
在這些研究中，在注射DNA免疫原后觀察到了水平顯著的趨化因子表達。這些結(jié)果暗示了它們作為免疫應(yīng)答的重要激活劑和調(diào)節(jié)劑的潛在作用。為了闡明這些趨化因子在免疫誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)中的具體作用，我們利用趨化因子DNA表達盒的共輸送作為抗原輸送模型。DNA共免疫是研究趨化因子體內(nèi)功能的合適模型，因為DNA疫苗通過MHC Ⅰ類和Ⅱ類通道誘導(dǎo)了體液和細胞免疫應(yīng)答。另外，我們和其它人已經(jīng)證明，對于DNA疫苗的抗原特異性免疫應(yīng)答可以通過共注射協(xié)同刺激分子和細胞因子基因與DNA免疫原盒來調(diào)節(jié)。因此，我們克隆了趨化因子表達載體，并與HIV-1DNA免疫原一起共免疫，并檢查趨化因子表達對于免疫激活的作用。我們觀察到，α-趨化因子IL-8和β-趨化因子MIP-1α、RANTES和MCP-1對抗原特異性免疫應(yīng)答的激活有特異性的可鑒定的作用。
例如，IL-8是中性粒細胞的趨化因子，它誘導(dǎo)中性粒細胞離開血流遷移進入周圍組織。我們發(fā)現(xiàn)IL-8是CD4+T細胞的強誘導(dǎo)物(通過強的T輔助細胞增殖反應(yīng)以及抗體應(yīng)答來表明)。IgG1與IgG2a的比值減少以及IFN-γ的表達增強表明，IL-8的共表達還調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答向Th1型移動。另一方面，IL-8的共給予對CD8+T細胞沒有顯著的影響，因為它不增強對CTL應(yīng)答。
MIP-1α能化學(xué)引誘嗜酸性粒細胞并使其脫顆粒。MIP-1α還誘導(dǎo)嗜堿性粒細胞和肥大細胞釋放組胺，并且是嗜堿性粒細胞和B細胞的趨化因子。這些報道支持了我們的觀察結(jié)果，即MIP-1α對抗體應(yīng)答具有最大的影響。另外，MIP-1α還是CD4+T細胞的強誘導(dǎo)物，具有良好的T輔助細胞增殖反應(yīng)。MIP-1α共表達還調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答向Th2型移動(通過IgG1與IgG2a的比值增加表明)。相反，MIP1-α的共免疫對CD8+T細胞應(yīng)答的影響很小。
與IL-8和MIP-1α的作用不同，RANTES的共免疫對抗體應(yīng)答的影響很小。RANTES是單核細胞的化學(xué)引誘物。另外，RANTES能化學(xué)引誘未受刺激的CD4+／CD45RO+記憶T細胞以及受刺激的CD4+和CD8+T細胞。我們發(fā)現(xiàn)，RANTES能將CD4+和CD8+T細胞化學(xué)吸引到DNA免疫部位，在誘導(dǎo)T輔助細胞增殖反應(yīng)和CTL應(yīng)答中起重要作用。Th1細胞因子IFN-γ和TNF-α的表達增加支持了Th1應(yīng)答激活的加強。已經(jīng)確定RANTES表達所誘導(dǎo)的高水平的CTL應(yīng)答是Ⅰ類限制性的和依賴于CD8+T細胞。
作為單核細胞的一種強效趨化因子，認為MCP-1是慢性炎性疾病的最重要的趨化因子之一。MCP-1誘導(dǎo)單核細胞從血流中遷移出來，變成組織巨噬細胞。發(fā)現(xiàn)MCP-1化學(xué)吸引激活的記憶亞組的T淋巴細胞。在所有檢測的趨化因子中，MCP-1是CD8+CTL的最強效的激活劑。MCP-1表達所誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答的增強經(jīng)確定是Ⅰ類限制性的，并且依賴于CD8+T細胞。增強的CTL結(jié)果得到Th1細胞因子IFN-γ和TNF-α的表達增加以及IgG1與IgG2a比值減少的支持。與RANTES不同的是，MCP-1對T輔助細胞增殖反應(yīng)具有明確的、但適中的影響。和RANTES一樣，MCP-1的共給予對抗體應(yīng)答的影響很小。這種比較強調(diào)了體液應(yīng)答、T輔助細胞應(yīng)答和T細胞毒性應(yīng)答的誘導(dǎo)可被相互獨立地調(diào)節(jié)。
除了它們對免疫應(yīng)答的直接作用外，趨化因子基因的共表達以自分泌方式導(dǎo)致表達增加。例如，我們發(fā)現(xiàn)，pCEnv和MIP1-α的共免疫可以使MIP1-α表達大幅增加超過單用pCEnv免疫時的表達水平。從RANTES的共輸送發(fā)現(xiàn)RANTES有類似的增加，且MCP-1增加。
另外，趨化因子的共表達還導(dǎo)致其它趨化因子的表達增強。這些結(jié)果暗示，這些趨化因子不僅具有直接調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用，而且還具有控制其它趨化因子產(chǎn)生的作用。
一個重要的發(fā)現(xiàn)是趨化因子RANTES和MCP-1在誘導(dǎo)TNF-α表達中所起的作用。TNF-α由激活的巨噬細胞和單核細胞、中性粒細胞、激活的淋巴細胞和NK細胞產(chǎn)生，而TNF-β由淋巴細胞產(chǎn)生。TNT-α還涉及注射革蘭陰性菌后的膿毒性休克和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。另外，TNF-α在調(diào)節(jié)其它促炎性細胞因子合成中起關(guān)鍵作用。由于TNF-α在各種疾病中起著關(guān)鍵作用，因此作了許多努力來減少體內(nèi)TNF-α的水平作為治療病情(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的潛在方法。在我們的試驗中，我們發(fā)現(xiàn)RANTES或MCP-1的共表達導(dǎo)致TNF-α的表達增加。這些結(jié)果暗示，抑制RANTES和MCP-1可能作為抑制體內(nèi)TNF-α表達的一種相關(guān)策略。
感興趣的是Th1對Th2表型看來獨立于其它免疫功能而分開。IL-8加強了體液應(yīng)答，但將這些應(yīng)答向Th1表型移動，使IgG1／IgG2a值減半。而MIP-1α(可能是最強的血清學(xué)驅(qū)動物)使IgG1／IgG2a比值向Th2應(yīng)答方向顯著移動。顯然，這種控制作用能使主要的抗原特異性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)向所需的表型以及免疫球蛋白同種型相互獨立地移動。另外，細胞應(yīng)答的誘導(dǎo)相對于較高的體液應(yīng)答的誘導(dǎo)看來是相對極化的免疫功能。對體液應(yīng)答最有顯著影響的那些趨化因子(IL-8和MIP-1α)表現(xiàn)出對CTL應(yīng)答的影響很小，而介導(dǎo)對CTL應(yīng)答最顯著作用的那些趨化因子(RANTES和MCP-1)對血清學(xué)的影響很小。相同的CTL驅(qū)動性趨化因子RANTES和MCP-1均刺激產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α，而體液應(yīng)答物對免疫激活的這些細胞因子制造者的影響很小。
實施例2
當將編碼IL-18的核苷酸序列作為疫苗或免疫治療劑的一部分輸送給某些細胞時，其效果較低，因為它在全長形式下是無活性的，只有被加工成成熟形式后才變得有活性。如圖1A所示，IL-18的開頭35個氨基酸被蛋白酶類-1(ICE)斷裂。構(gòu)建突變型IL-18核苷酸序列，它被翻譯成圖1B所示的突變體IL-18。該IL-18突變型作為本發(fā)明有效的免疫調(diào)節(jié)蛋白運作。編碼突變體IL-18的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致T輔助細胞應(yīng)答增強。編碼該突變型的核苷酸序列可以插入pCDNA3中。
實施例3編碼CD40的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致CTL應(yīng)答增強。
編碼CD40的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼CD40L的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致CTL應(yīng)答增強。
編碼Fas的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致CTL應(yīng)答增強。
編碼ICAM-1的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致CTL應(yīng)答增強。
編碼ICAM-1的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼LFA-3的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致CTL應(yīng)答增強。
編碼LFA-3的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼VCAM-1的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼PECAM-1的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼E-選擇蛋白的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼M-CSF的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致CTL應(yīng)答增強。
編碼G-CSF的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致CTL應(yīng)答增強。
編碼M-CSF的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼G-CSF的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼IL-4的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼E-選擇蛋白的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼IL-7的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致CTL應(yīng)答增強。
編碼NGF的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致CTL應(yīng)答增強。
編碼VEGF的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致CTL應(yīng)答增強。
編碼IL-7的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼NGF的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼VEGF的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼MCP-1的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致CTL應(yīng)答增強。
編碼RANTES的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致CTL應(yīng)答增強。
編碼MCP-1的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。編碼RANTES的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
編碼MIP1-α的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。編碼IL-8的核苷酸序列與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致輔助T細胞應(yīng)答增強。
MCP-1、RANTES、MIP-1α和IL-8中的任一個與編碼免疫原的核苷酸序列的聯(lián)合輸送導(dǎo)致抗體應(yīng)答增強。
MCP-1或RANTES之任一個的輸送導(dǎo)致TNF-α的產(chǎn)生增強。
MCP-1、RANTES、MIP-1α和IL-8之任一個與編碼免疫原的核苷酸序列的輸送導(dǎo)致IFN-γ的產(chǎn)生增強。
實施例4我們檢查了在M-CSF(巨噬細胞-集落刺激因子)、G-CSF(粒細胞-CSF)和GM-CSF(粒細胞／單核細胞-CSF)的基因表達盒與HIV-1 DNA免疫原構(gòu)建物共輸送后對于抗原特異性免疫應(yīng)答的影響。將這些細胞因子的基因單獨克隆到表達載體中處于巨細胞病毒(CMV)啟動子的控制下。然后將基因質(zhì)粒表達盒與HIV-1免疫原的DNA疫苗盒一起注射到小鼠體內(nèi)。我們分析了用這些基因佐劑表達盒的共注射對于抗原特異性免疫應(yīng)答的方向和數(shù)量的免疫學(xué)影響；將這些結(jié)果與我們用原型預(yù)防性Th1和Th2型細胞因子(分別為IL-12和IL-4)的基因共輸送后觀察到的結(jié)果比較。用這些DNA疫苗構(gòu)建物作為模型抗原，我們發(fā)現(xiàn)CSF基因能清楚明顯地調(diào)節(jié)體內(nèi)的抗原特異性免疫應(yīng)答，并以疫苗特異性方式推動β-趨化因子的產(chǎn)生。
材料和方法DNA質(zhì)粒如Boyer，J．D．等人(1997)Nature Med．3，526-532所述的那樣(該內(nèi)容納入本文作參考)，制備表達HIV-1包膜蛋白和gag／pol蛋白的DNA疫苗構(gòu)建物pCEnv和pCGag／pol。如Kim，J．J．等人(1998)Eur．J．Immunol．28，1089-1103和Kim，J．J．，等人(1998)J．Clin．Invest．102，1112-1124所述的那樣(這些內(nèi)容納入本文作參考)，將人G-CSG和M-CSF以及小鼠GM-CSF的基因克隆到pCDNA3表達載體(Invitrogen，Inc．，San Diego，CA)中。已報道人G-CSF和M-CSF在小鼠細胞中有活性。用Qiagen MaxiPrep試劑盒(Qiagen，Santa Clara，CA)在細菌內(nèi)生產(chǎn)質(zhì)粒DNA并純化。
試劑和細胞系小鼠肥大細胞瘤p815細胞系獲自ATCC(Rockville，MD)。表達HIV-1包膜、gag／pol和半乳糖苷酶的的重組痘苗vMN462、vVK1和vSC8獲自NIH AIDS Researchand Reference Reagent Program。重組gp120或p24蛋白購自ImmunoDiagnostics，Inc．(Bedford，MA)。
小鼠DNA接種在6至8周齡雌性BALB／c小鼠(Harlan Sprague Dawley，Inc．，Indianapolis，IN)的股四頭肌部位注射50μg各種感興趣的DNA構(gòu)建物，這些構(gòu)建物配制在磷酸鹽緩沖液(PBS)和0．25％布吡卡因-HCl(Sigma，St．Louis，MO)中。各種基因表達盒的共同給予包括將所選質(zhì)粒混合，然后注射。對照小鼠用50微克pCDNA3載體免疫。每組研究進行三次，提供一組典型的結(jié)果。小鼠接受的兩次DNA免疫(各50毫克)相隔兩周。在加強注射后一周，處死小鼠，取出脾臟，分離淋巴細胞，測試細胞(Th或CTL)應(yīng)答。所有動物飼養(yǎng)在賓西法尼亞大學(xué)的溫度控制、光照循環(huán)的設(shè)備中，并按國立衛(wèi)生研究院和賓西法尼亞大學(xué)指導(dǎo)護理。
ELISAp24或gp120蛋白稀釋在0．1M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH9．5)中至濃度為2毫克／毫升，取50微升4℃過夜吸附到微量滴定板的孔上。該板用PBS-0．05％吐溫-20洗滌，在37℃用3％BSA(PBS配)和0．05％吐溫-20封閉1小時。用0．05％吐溫-20稀釋小鼠抗血清，并37℃培育1小時，然后與HRP-偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(Sigma，St．Louis，MO)一起培育。用3′3′5′5′TMB(Sigma)緩沖液洗滌板并顯影。為了測定gp120-特異性IgG亞類的相對水平，用HRP偶聯(lián)的抗鼠IgG1和IgG2a(Zymed，San Francisco，CA)代替抗鼠IgG-HRP。然后加入ABTS底物溶液(Chemicon，Temecula，CA)。在每一步驟中，用洗滌緩沖液(PBS+0．05％吐溫-X)洗滌3次。在Dynatech MR5000測試板讀數(shù)儀上讀取諸板在450nm處的光密度值。
T輔助細胞增殖試驗從脾臟收獲淋巴細胞，去除紅細胞并用新鮮培養(yǎng)液洗滌數(shù)次制備效應(yīng)細胞。將分離細胞重懸至濃度為5×106細胞／毫升。取含5×105細胞的100微升等份立即加入96孔平底微量滴定板各孔內(nèi)。在孔中加入重組p24或gp120蛋白至最終濃度分別為5μg／ml和1μg／ml，一式三份。這些細胞在5％CO2中37℃培養(yǎng)3天。在各孔中加入1mCi氚化胸苷，37℃培養(yǎng)細胞12至18小時。收獲測試板，在β測試板讀數(shù)儀(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上測定摻入的氚化胸苷量。用以下公式計算刺激指數(shù)刺激指數(shù)(SI)=(試驗計數(shù)／自發(fā)計數(shù))自發(fā)計數(shù)的測試孔內(nèi)包括作為非相關(guān)蛋白對照的10％胎牛血清。
細胞毒性T淋巴細胞試驗用牛痘感染的靶細胞進行5小時的51鉻釋放CTL試驗。用體外效應(yīng)物刺激進行試驗，用相關(guān)牛痘(包膜為vMN462和gag／pol為vVK1)感染的細胞刺激效應(yīng)細胞，該感染細胞用0．1％戊二醛在CTL培養(yǎng)基中以5×106細胞／毫升下固定5天。用CTL培養(yǎng)基非特異性地刺激效應(yīng)細胞兩天，該CTL培養(yǎng)基由RPMI 1640(Gibco-BRL，GrandIsland，NY)、10％胎牛血清(Gibco-BRL)和10％不含Con A的RAT-T-STIM(BectonDickinson Labware，Bedford，MA)組成。在37℃以10至20的感染復(fù)數(shù)(MOI)對3×106個P815細胞進行5至12小時的感染，制備牛痘感染的靶細胞。進行標準鉻釋放試驗，用100μCi／ml Na251CrO2標記靶細胞60至120分鐘，用于和受刺激的效應(yīng)脾細胞一起37℃培育4至6小時。在效∶靶(E∶T)比50∶1至12．5∶1下測定CTL裂解。收獲上清液，在LKB CliniGamma γ計數(shù)儀上計數(shù)。用以下公式測定特異性裂解百分比100×(試驗釋放量-自發(fā)釋放量)÷(最大釋放量-自發(fā)釋放量)最大釋放量以含1％Triton X-100的培養(yǎng)基裂解靶細胞來測定。如果“自發(fā)釋放”計數(shù)值超過“最大釋放”計數(shù)的20％，則該試驗視為無效。
CD8+T細胞的補體溶解通過α-CD8單克隆抗體(Pharmingen，San Diego，CA)處理，然后與家兔補體(Sigma)一起37℃培育45分鐘，將CD8+T細胞從脾細胞中除去。
細胞因子／趨化因子表達分析在第6天收集用于CTL試驗的受刺激效應(yīng)細胞的上清液，用檢測IFN-γ和IL-4(Biosource International，Inc．，Camarillo，CA)和MIP-1α(R & D Systems，Minneapolis，MN)、MIP-1β和RANTES(Intergen，Pace，NY)的ELSIA試劑盒測定各上清液的細胞因子和趨化因子分布圖。
結(jié)果細胞因子表達盒的構(gòu)建將細胞因子基因分別克隆到pCDNA3質(zhì)粒表達載體內(nèi)。為了測試細胞因子構(gòu)建物是否表達了其相關(guān)蛋白，我們將它們轉(zhuǎn)染到RD肌細胞系中，用細胞因子ELISA分析這些構(gòu)建物的表達。結(jié)果證實每個表達盒均產(chǎn)生特異性的細胞因子(G-CSF～40-60pg／ml；GM-CSF＞70pg／ml；M-CSF～60-70-pg／ml)。
G-CSF誘導(dǎo)T輔助細胞應(yīng)答增強G-CSF是由巨噬細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和骨髓基質(zhì)細胞產(chǎn)生的一種生長因子。G-CSF激活中性粒細胞、內(nèi)皮細胞和血小板，但是認為它對抗原呈遞細胞的直接影響很少。我們檢查了G-CSF共表達對于抗原特異性抗體應(yīng)答的作用。從pCEnv和pCEnv+G-CSF免疫的小鼠收集抗血清，并用ELISA分析針對HIV-1 gp120蛋白的特異性抗體應(yīng)答。測定DNA免疫6周后收集的血清的gp120-特異性抗體滴度。G-CSF的共免疫對gp120-特異性抗體應(yīng)答的水平?jīng)]有顯著影響。用pCGag／pol免疫的組觀察到類似的結(jié)果。另外，測定G-CSF基因共給予所誘導(dǎo)的gp120-特異性IgG的亞類。已有報道說，IgG1型的產(chǎn)生由Th2型細胞因子誘導(dǎo)，而IgG2a型的產(chǎn)生由Th1型細胞因子誘導(dǎo)。測定IgG2a與IgG1(Th1和Th2)的相對比值。pCEnv免疫組的IgG2a與IgG1比值為0．8。另一方面，原型Th1細胞因子IL-12基因的共免疫使該比值增加至1．28，而與Th2細胞因子IL-4基因的共注射導(dǎo)致該比值減少至0．68。G-CSF的共給予使該相對比值增加至1．1，這表明向Th1型應(yīng)答移動。
還測定了G-CSF的共表達對T輔助細胞增殖反應(yīng)的影響。T輔助淋巴細胞在通過B細胞誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和通過CD8+細胞毒性T細胞誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵的作用。IL-12基因的共免疫顯著增加了抗原特異性Th增殖反應(yīng)的水平。相反，與IL-4基因的共注射對于Th增殖反應(yīng)的影響很小。G-CSF與HIV-1免疫原的共表達導(dǎo)致抗原特異性T輔助細胞增殖反應(yīng)明確增強。
另外，還調(diào)查了細胞因子共表達對CTL應(yīng)答的影響。從對照動物觀察到有本底水平的特異性殺傷作用，而用pCEnv或pCGag／pol免疫的動物顯示出抗原特異性CTL應(yīng)答低的但明確的水平。用IL-12基因的共注射顯著增加了該抗原特異性CTL應(yīng)答的水平。相反，用IL-4基因共免疫對于該應(yīng)答的影響卻很小。類似的，G-CSF的共給予對抗原特異性CTL應(yīng)答沒有任何增強作用。
在免疫應(yīng)答期間，細胞因子在指引和靶向免疫細胞中起關(guān)鍵作用。例如，IFN-γ復(fù)雜地參與調(diào)節(jié)T細胞介導(dǎo)的細胞毒性免疫應(yīng)答，而IL-4在B細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起主要作用。我們分析了用于CTL試驗的體外刺激的效應(yīng)細胞的上清液，并測試其細胞因子IFN-γ和IL-4的釋放情況。我們發(fā)現(xiàn)，G-CSF的表達增加了IFN-g的水平(2倍)，但是它沒有影響IL-4的產(chǎn)生水平。
GM-CSF是抗體應(yīng)答和T輔助細胞應(yīng)答的強誘導(dǎo)物GM-CSF激活并分化粒細胞，并起著內(nèi)皮細胞、類紅細胞、巨核細胞和T輔助細胞生長因子的作用。尚不清楚GM-CSF是否對殺傷性T細胞有影響。與G-CSF共表達相反，GM-CSF的共表達在誘導(dǎo)抗原特異性體液應(yīng)答中具有顯著的增強作用(在所有組中最高)。與IL-4共注射類似，GM-CSF的共免疫導(dǎo)致最高水平的包膜特異性抗體應(yīng)答。用pCGag／pol免疫的組看到了類似的結(jié)果。另一方面，與單用pCEnv免疫的組相比，pCEnv+GM-CSF的共免疫對于IgG2a／IgG1比值沒有任何影響。另外，和IL-12的共免疫一樣，GM-SF和HIV-1免疫原(pCEnv或pCGag／pol)的共表達產(chǎn)生了最高水平的抗原特異性T輔助細胞增殖反應(yīng)。我們還發(fā)現(xiàn)GM-CSF表達增加了FIN-γ的水平(2倍)，但是它不影響IL-4的產(chǎn)生水平。相反，GM-CSF的共免疫對抗原特異性CTL應(yīng)答只稍有影響。
M-CSF是CTL應(yīng)答的強誘導(dǎo)物M-CSF是巨噬細胞以及巨噬細胞先祖細胞的強激活劑。M-CSF受體具有受限制的表達方式，同樣局限于巨噬細胞。因此可以評價M-CSF的共輸送對于此APC群的直接作用。與GM-CSF不同，M-CSF和pCEnv的共表達對HIV-1包膜特異性抗體應(yīng)答具有明確的增強作用(但低于IL-4或GM-CSF)。測定了共給予pCEnv和M-CSF后IgG2a與IgG1的相對比值。pCEnv免疫組的IgG2a與IgG1比值為0．8。另一方面，pCEnv和M-CSF的共注射使該相對比值增加至1．2，這表明向Th1型應(yīng)答明顯移動。另外，M-CSF和HIV-1免疫原(pCEnv或pCGag／pol)的共表達導(dǎo)致抗原特異性T輔助細胞增殖反應(yīng)明顯增加。與導(dǎo)致對CTL活性影響很小的pCEnv+G-CSF或pCEnv+GM-CSF的共注射不同，在共注射了pCEnv和M-CSF后，觀察到感染了表達HIV-1包膜的牛痘(vMN642)的靶細胞的特異性殺傷作用有更為顯著的增加。在效靶(E∶T)之比為50∶1時，共注射pCEnv和M-CSF后，觀察到靶細胞有幾乎40％的特異性裂解。同樣，用pCGag／pol和M-CSF免疫小鼠，結(jié)果導(dǎo)致感染了表達HIV-1gag／pol的牛痘(vVK1)的靶細胞的抗原特異性CTL裂解明顯增強。用pCEnv和M-CSF免疫的小鼠的IFN-γ的釋放水平明顯高于pCEnv免疫組或?qū)φ战M的水平。另一方面，這些組的IL-4水平是相似的。
M-CSF共免疫對CTL應(yīng)答的增強作用局限于CD8T細胞為了確定M-CSF共表達而增強的CTL應(yīng)答是否局限于CD8+T細胞，用HIV-1包膜肽(RIHIGPGRAFYTTKN)進行CTL試驗，該肽已經(jīng)證明是balb／c小鼠的MHC Ⅰ類限制性CTL的特異性表位。讓小鼠接受相隔兩周的兩次各50微克DNA構(gòu)建物的免疫接種，在第二次免疫后1周收獲它們的脾臟。在用所述的包膜特異性肽體外刺激后的分離的脾細胞上進行CTL試驗。我們觀察到，在E∶T比為50∶1時，與M-CSF共注射后CTL應(yīng)答均有明顯增強，特異性殺傷作用為40％。我們驗證了該觀察結(jié)果，方法是在通過補體溶解從效應(yīng)細胞群中除去CD8+T細胞后測定CTL活性。CD8+T細胞的除去導(dǎo)致M-CSF共注射后所見的抗原特異性CTL增強作用被抑制。這些結(jié)果表明，溶細胞活性的增強是抗原特異性的，Ⅰ類限制性的，并且依賴于CD8+T細胞。
M-CSF基因的共輸送調(diào)節(jié)受刺激T細胞產(chǎn)生β趨化因子我們檢查了受刺激T細胞的β-趨化因子(MIP-1α、MIP-1β和RANTES)的表達情況。這些β-趨化因子是由CD8+T細胞針對親巨噬細胞性病毒而非親T細胞性病毒而產(chǎn)生的主要HIV抑制因子。另外，這些CD8+T細胞產(chǎn)生的趨化因子已經(jīng)證明在外周的細胞免疫擴張(immune expansion)起關(guān)鍵作用。具體地說，我們發(fā)現(xiàn)用pCEnv的DNA免疫誘導(dǎo)出β-趨化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES。另外，我們發(fā)現(xiàn)，與造血細胞因子基因的共免疫導(dǎo)致受刺激T細胞的趨化因子表達增加。例如，我們發(fā)現(xiàn)通過pCEnv和G-CSF的共免疫可使MIP-1α表達明顯增加超過單用pCEnv免疫所表達的水平。另外，我們發(fā)現(xiàn)，pCEnv和M-CSF的共免疫顯著增加了MIP-1β的表達。另一方面，pCEnv和M-CSF、pCEnv和G-CSF以及pCEnv和GM-CSF的共免疫卻沒有使受刺激效應(yīng)細胞的RANTES表達明顯增加超過單用DNA疫苗盒所誘導(dǎo)出的水平。然而，感興趣的是，M-CSF看來下調(diào)了MIP-1α的水平，甚至低于基因免疫本身所誘導(dǎo)的水平。該信息提示，MIP-1α不直接參與推動CTL應(yīng)答，實際上可能干擾了其誘導(dǎo)。
討論局部免疫環(huán)境(可能在注射部位的局部淋巴結(jié)外周或肌肉中)的控制可能影響免疫應(yīng)答的程度和方向。我們研究了作為DNA疫苗分子佐劑的G-CSF、GM-CSF和M-CSF的基因共輸送所產(chǎn)生的免疫效果。
我們發(fā)現(xiàn)G-CSF、GM-CSF和M-CSF cDNA構(gòu)建物均以獨特的方式調(diào)節(jié)了DNA疫苗的免疫效果。G-CSF是一種多效細胞因子，最為人知的是其對中性粒細胞譜系的造血細胞的增殖、分化和激活的特異性作用。它主要由單核細胞和巨噬細胞在受各種刺激(包括內(nèi)毒素、IL-1、TNF-α和IFN-γ)激活后而產(chǎn)生。它調(diào)節(jié)中性粒細胞前體的增殖和成熟，并直接作用于成熟的中性粒細胞以增強吞噬作用、ADCC、超氧化物的產(chǎn)生、趨化性和細胞-表面粘附分子的表達。G-CSF的體外給予能刺激骨髓造血先祖細胞形成嗜中性集落。在臨床上，最通常的是給予G-CSF來治療化療和放療誘導(dǎo)產(chǎn)生的中性粒細胞減少。我們發(fā)現(xiàn)G-CSF的共免疫總體上對抗體應(yīng)答的影響很小。IgG2a／IgG1比值增加和IFN-γ的表達增加表明，G-CSF的共表達調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答向Th1型移動。另外，G-CSF的共表達導(dǎo)致T輔助細胞增殖反應(yīng)有適度增加?？傮w上，G-CSF對抗原特異性免疫應(yīng)答最多有適中的影響(不應(yīng)直接影響抗原呈遞)。
GM-CSF是一種能刺激各種造血細胞增殖、成熟和發(fā)揮功能的多效細胞因子。首先認識到GM-CSF能刺激中性粒細胞、單核細胞／巨噬細胞以及嗜酸性粒細胞集落形成。它由各種類型的細胞(包括T細胞、B細胞、巨噬細胞、肥大細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞)對細胞因子或免疫和炎性刺激反應(yīng)中產(chǎn)生的。我們發(fā)現(xiàn)，強的T輔助細胞增殖反應(yīng)以及抗體應(yīng)答的加強表明GM-CSF是CD4+Th細胞的強誘導(dǎo)物。另一方面，pCEnv和GM-CSF的共免疫對IgG2a／IgG1比值沒有任何影響。另外，GM-CSF的共給予似乎對CD8+T細胞沒有顯著的效果，其表現(xiàn)為對抗原特異性的CTL應(yīng)答的誘導(dǎo)缺乏影響。因此，該細胞因子產(chǎn)生的疫苗輔佐作用全部集中在T輔助細胞上。這些結(jié)果支持并擴大了以前關(guān)于GM-CSF cDNA構(gòu)建物作為分子佐劑的應(yīng)用研究。已經(jīng)報道，表達狂犬病毒糖蛋白的質(zhì)粒和編碼小鼠GM-CSF的質(zhì)粒肌內(nèi)共接種增強了B細胞和T輔助細胞的活性。類似的，我們報道說，GM-CSF cDNA和DNA疫苗構(gòu)建物的共免疫增加了抗原特異性抗體和Th-細胞增殖反應(yīng)。相反，在這些研究中，沒有發(fā)現(xiàn)GM-CSF的基因?qū)TL誘導(dǎo)有任何影響。用GM-CSF與編碼流感核蛋白(NP)的DNA免疫原共輸送報道了相似的發(fā)現(xiàn)。我們還將GM-CSF cDNA構(gòu)建物與編碼HSV-2 gD蛋白的DNA表達構(gòu)建物一起共輸送。然后，我們分析了HSV致死性攻擊后疫苗對所得免疫表型以及受免疫動物的死亡率和發(fā)病率的調(diào)節(jié)作用。我們發(fā)現(xiàn)，GM-CSF基因的共給予不僅提高了存活率，而且還減少了HSV陰道內(nèi)攻擊后皰疹性病損的頻率和嚴重程度。
已經(jīng)顯示，M-CSF是單核吞噬細胞的生長、分化和發(fā)揮功能的調(diào)劑物。它還增加了粘附分子和Fc受體的表達，增加了殺腫瘤活性，增強了包括IL-1、TNF-α和IFN-γ在內(nèi)的細胞因子的次級釋放。M-CSF最初發(fā)現(xiàn)于血清、尿液和其它生物體液中作為能刺激骨髓造血先祖細胞形成巨噬細胞集落的一種因子。M-CSF可以由多種細胞產(chǎn)生，這些細胞包括成纖維細胞、子宮內(nèi)膜分泌性上皮細胞、骨髓基質(zhì)細胞、腦星形膠質(zhì)細胞、成骨細胞、腎血管系膜細胞、角質(zhì)細胞和LPS或細胞因子激活的巨噬細胞、B細胞、T細胞和內(nèi)皮細胞。在研究的CSF類物質(zhì)中，M-CSF是CD8+CTL的最強效激活劑。M-CSF表達誘導(dǎo)的CTL應(yīng)答增強既為MHCⅠ類限制性，又依賴于CD8+T細胞。此種增強的CTL結(jié)果得到IFN-γ產(chǎn)生的增加以及IgG2a／IgG1比值增加的支持。與GM-CSF的作用不同，M-CSF的共免疫對抗體應(yīng)答的影響微弱。與GM-CSF的作用類似，M-CSF和HIV-1免疫原的共表達導(dǎo)致抗原特異性T輔助細胞增殖反應(yīng)增強，但是程度較低。看來該細胞因子為CTL通道特別提供了益處。
感興趣的是比較了Th1／Th2型細胞因子與CSF基因的免疫調(diào)節(jié)作用。例如，GM-CSF的共注射類似于IL-4共免疫那樣明確調(diào)節(jié)了抗體應(yīng)答的水平。另一方面，IL-4共免疫導(dǎo)致更呈Th2型的應(yīng)答(從IgG2a／IgG1比值顯著減少看出)。另外，GM-CSF共注射對Th增殖反應(yīng)的顯著增強作用只與IL-12共給予相匹配。另一方面，M-CSF(不是G-CSF或GM-CSF)基因的共輸送導(dǎo)致CD8+T細胞限制性的CTL應(yīng)答明顯增強。這些結(jié)果表明在免疫激活部位產(chǎn)生這些生長因子能調(diào)節(jié)體內(nèi)DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的水平。另外，這些結(jié)果暗示這些生長因子能在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答級聯(lián)反應(yīng)中起著更活躍的作用，這在以前被認為是在傳統(tǒng)的Th1和Th2型細胞因子的范圍內(nèi)。
除了分析細胞為基礎(chǔ)的應(yīng)答外，我們還檢查了CSF基因共表達導(dǎo)致的對趨化因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用。趨化因子是免疫和炎性應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)劑。在白細胞從血管移動到宿主防御機制外周部位的分子調(diào)節(jié)中，趨化因子是尤其重要的。另外，一些趨化因子已證明在調(diào)節(jié)外周的免疫擴張(expansion)中起關(guān)鍵作用。我們發(fā)現(xiàn)CD8+效應(yīng)T細胞在引發(fā)免疫應(yīng)答時增加了趨化因子表達水平，這表明這些期末的效應(yīng)細胞在抗原特異性免疫應(yīng)答的擴張期起調(diào)節(jié)作用。除了它們在炎性和免疫應(yīng)答中的功能外，一些趨化因子可能在AIDS的傳播和進展中起關(guān)鍵作用。早在10年前，就已經(jīng)預(yù)計到HIV包膜糖蛋白gp120與CD4的結(jié)合不足以導(dǎo)致病毒融合和進入，這提示HIV感染還需要額外的細胞-表面輔因子。最近的研究已經(jīng)確定，親T細胞性和親巨噬細胞性HIV病毒株與其靶細胞融合所需的協(xié)同受體分別是CXCR-4和CCR-5。β-趨化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES是CCR-5的天然配體，它們是CD8+T細胞針產(chǎn)生的對親巨噬細胞性、而不是親T細胞性HIV分離株的主要HIV抑制性因子。
我們研究了體內(nèi)受疫苗刺激細胞的MIP-1α、MIP-1β和RANTES的表達，發(fā)現(xiàn)與CSF基因共免疫導(dǎo)致受抗原刺激的T細胞的趨化因子表達增加。我們發(fā)現(xiàn)，通過pCEnv和G-CSF的共免疫，MIP-1α的產(chǎn)生可明顯增加超過單用pCEnv免疫所產(chǎn)生的水平。特別是，我們發(fā)現(xiàn)pCEnv和M-CSF共免疫顯著增加了MIP-1β表達。相反，沒有一種共注射策略導(dǎo)致受刺激效應(yīng)細胞的RANTES表達顯著增加。發(fā)現(xiàn)的另一個新作用是RANTES和MIP-1β的顯著增加以及同時MIP-1α的降低。實際上，M-CSF誘導(dǎo)的MIP-1α水平低于對照水平。該數(shù)據(jù)提示MIP-1α信號傳導(dǎo)通過CCR1、CCR4和CCR5產(chǎn)生了一個信號，該信號與RANTES或MIP-1β通過CCR3或CCD9輸送產(chǎn)生的信號不同。
這些數(shù)據(jù)表明，生長因子cDNA構(gòu)建物的共輸送調(diào)節(jié)了體液免疫應(yīng)答和細胞(包括產(chǎn)生趨化因子)免疫應(yīng)答。特別是，與M-CSF的共注射對于抗原特異性CTL誘導(dǎo)和趨化因子產(chǎn)生最具調(diào)節(jié)作用。
實施例5ICAM-1提供了T細胞共同刺激和趨化因子產(chǎn)生我們研究檢查了由趨化因子密切調(diào)節(jié)的三種特異性粘附分子的免疫調(diào)節(jié)作用。我們利用DNA疫苗技術(shù)來研究ICAM-1、LFA-3和VCAM-1在體內(nèi)免疫激活中所起的作用。具體地說，我們將ICAM-1、LFA-3和VCAM-1的基因分別克隆到表達載體中處于巨細胞病毒(CMV)啟動子的控制下。然后將這些構(gòu)建物與編碼HIV-1包膜或gag／pol抗原的DNA免疫原一起共免疫。我們分析了與這些粘附分子表達盒的共注射對抗原特異性免疫應(yīng)答水平的免疫學(xué)效果。
我們發(fā)現(xiàn)，DNA免疫原和粘附分子ICAM-1和LFA-3的共表達能增強抗原特異性T細胞應(yīng)答。然而，ICAM-1和LFA-3看來在抗原特異性體液應(yīng)答的表達中沒有作用。相反，它們看來特異性地影響T細胞應(yīng)答。LFA-3增強CD4+T細胞應(yīng)答并顯示出對CD8+T細胞功能有更次要的影響。更重要的是，ICAM-1共給予顯著增加了CD4+和CD8+T細胞應(yīng)答。ICAM-1共表達還顯著增加了抗原特異性β-趨化因子的產(chǎn)生，提示LFA-1的連接在外周T細胞擴張中起重要作用。這些分子的激活表型看來與原型CD80／CD86共同刺激分子不同。這些結(jié)果支持了這樣一個觀點，即細胞因子、趨化因子和粘附分子的外周網(wǎng)絡(luò)協(xié)同調(diào)節(jié)了效應(yīng)物功能部位的效應(yīng)T細胞應(yīng)答。
材料和方法DNA質(zhì)粒如Kim，J．J．，等人Nature Biot．15641-645所述的那樣(該內(nèi)容納入本文作參考)，制備表達HIV-1包膜蛋白和gag／pol蛋白的DNA疫苗構(gòu)建物pCEnv和pCGag／pol。將ICAM-1、LFA-3和VCAM-1的基因克隆到pCDNA3表達載體(Invitrogen，Inc．，San Diego，CA)中，如Kim，J．J．，等人Eur．J．Immunol．281089-1103所述的那樣產(chǎn)生了純凈的質(zhì)粒DNA。
試劑和細胞系人橫紋肌肉瘤(RD)和小鼠肥大細胞瘤P815細胞系獲自ATCC(Rockville，MD)。表達HIV-1包膜、gag／pol和半乳糖苷酶的的重組疫苗vMN462、vVK1和vSC8獲自NIH AIDS Research and Reference Reagent Program。重組gp120或p24蛋白購自ImmunoDiagnostics，Inc．(Bedford，MA)。
粘附分子表達構(gòu)建物的表達將ICAM-1、LFA-3、VCAM-1構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到RD細胞中，分析這些構(gòu)建物的表達。轉(zhuǎn)染72小時后收獲細胞，用異硫氰酸熒光素(FITC)-偶聯(lián)的抗ICAM-1、LFA-3、VCAM-1的單克隆抗體(Pharmingen，San Diego，CA)進行FACS分析，測試表達情況。
小鼠DNA接種在6至8周齡雌性BALB／c小鼠(Harlan Sprague Dawley，Inc．，Indianapolis，IN)的股四頭肌部位注射50μg各種感興趣的DNA構(gòu)建物，這些構(gòu)建物配制在磷酸鹽緩沖液(PBS)和0．25％布吡卡因-HCl(Sigma，St．Louis，MO)中。各種基因表達盒的共給予包括將所選質(zhì)?；旌?，然后注射。對照小鼠用50微克pCDNA3載體免疫。每組研究進行三次，提供一組典型的結(jié)果。小鼠接受的兩次DNA免疫(各50微克)相隔兩周。在加強注射后一周，處死小鼠，取出脾臟，分離淋巴細胞，測試細胞(Th或CTL(細胞毒性T淋巴細胞))應(yīng)答。
ELISAp24或gp120蛋白稀釋在0．1M碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液(pH9．5)中至濃度為2微克／毫升，取50微升4℃過夜吸附到微量滴定板的孔上。該板用PBS-0．05％吐溫-20洗滌，在37℃用3％BSA(PBS配)和0．05％吐溫-20封閉1小時。用0．05％吐溫-20稀釋小鼠抗血清，并37℃培育1小時，然后與HRP-偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG(Sigma，St．Louis，MO)一起培育。用3′3′5′5′TMB(Sigma)緩沖液洗滌測試板并顯影。在DynatechMR5000測試板讀數(shù)儀上讀取板在450nm處的光密度值。
T輔助細胞增殖試驗從脾臟收獲淋巴細胞，去除紅細胞并用新鮮培養(yǎng)液洗滌數(shù)次制成效應(yīng)細胞。將分離的細胞懸液重懸至濃度為5×106細胞／毫升。取含5×105細胞的100毫升等份立即加入96孔平底微量滴定板各孔內(nèi)。在孔中加入重組p24或gp120蛋白至最終濃度分別為5μg／ml和1μg／ml，一式三份。這些細胞在5％CO2中37℃培養(yǎng)3天。在各孔中加入1mCi氚化胸苷，37℃培養(yǎng)細胞12至18小時。收獲測試板，在β測試板讀數(shù)儀(Wallac，Turku，F(xiàn)inland)上測定摻入的氚化胸苷量。用以下公式計算刺激指數(shù)刺激指數(shù)(SI)=(試驗計數(shù)／自發(fā)計數(shù))自發(fā)計數(shù)的測試孔內(nèi)包括作為非相關(guān)蛋白對照的10％胎牛血清。此外，pCEnv或?qū)φ彰庖叩膭游镆话銓r55蛋白的SI為1。類似地，pCGag／pol或?qū)φ找话銓p120蛋白的SI為1。為了確保細胞健康，將PHA或con A(Sigma)用作多克隆刺激劑陽性對照。PHA或con A對照樣品的SI為20至40。
細胞毒性T淋巴細胞試驗用牛痘感染的靶細胞進行5小時的51鉻釋放CTL試驗。用體外效應(yīng)物刺激進行試驗，其中用相關(guān)的牛痘感染的細胞(包膜為vMN462和gag／pol為vVK1)刺激效應(yīng)細胞，此種感染細胞用0．1％戊二醛在CTL培養(yǎng)基中以5×106細胞／毫升下固定5天。用CTL培養(yǎng)基非特異性地刺激效應(yīng)細胞兩天，該CTL培養(yǎng)基由RPMI 1640(Gibco-BRL，Grand Island，NY)、10％胎牛血清(Gibco-BRL)和10％不含Con A的RAT-T-STIM(Becton Dickinson Labware，Bedford，MA)組成。在37℃以10至20的感染復(fù)數(shù)(MOI)對3×106個P815細胞進行5至12小時的感染，制備牛痘感染的靶細胞。進行標準鉻釋放試驗，用100μCi／ml Na251CrO4對靶細胞標記60至120分鐘，并用來和受刺激的效應(yīng)脾細胞一起37℃培育4至6小時。在效∶靶(E∶T)之比從50∶1至12．5∶1下測定CTL裂解。收獲上清液，在LKB CliniGammaγ計數(shù)儀上計數(shù)。用以下公式測定特異性裂解百分比100×(試驗釋放量-自發(fā)釋放量)÷(最大釋放量-自發(fā)釋放量)最大釋放量由含1％Triton X-100培養(yǎng)基中靶細胞的裂解來測定。如果“自發(fā)釋放”計數(shù)超過“最大釋放”計數(shù)的20％，則該試驗視為無效。
CD8+T細胞的補體溶解通過α-CD8單克隆抗體(Pharmingen，San Diego，CA)處理，然后與家兔補體(Sigma)一起37℃培育45分鐘，將CD8+T細胞從脾細胞中除去。
細胞因子／趨化因子表達分析在第6天收集用于CTL試驗的受刺激效應(yīng)細胞的上清液，用針對IFN-γ和IL-4以及MIP-1α、MIP-1β和RANTES的ELSIA試劑盒(Biosource Camarillo，CA；R & DSystems，Minneapolis，MN；Intergen，Purchase，NY)測試表達。
結(jié)果ICAM-1、LFA-3和VCAM-1可以由轉(zhuǎn)染的細胞表達將ICAM-1、LFA-3和VCAM-1的基因pCICAM-1、pCLFA-3和pCVCAM-1分別克隆到pCDNA3表達載體中(圖2)。為了測試pCICAM-1、pCLFA-3和pCVCAM-1構(gòu)建物是否能表達其相關(guān)的蛋白，我們將它們體內(nèi)轉(zhuǎn)染到人橫紋肌肉瘤(RD)細胞中。利用FACS分析，我們發(fā)現(xiàn)CICAM-1、pCLFA-3和pCVCAM-1表達盒的轉(zhuǎn)染分別導(dǎo)致ICAM-1、LFA-3和VCAM-1的特異性表達。我們還發(fā)現(xiàn)，兩個DNA表達盒的肌內(nèi)共免疫導(dǎo)致體內(nèi)同一肌細胞共表達兩種編碼的蛋白。
粘附分子的共表達不影響Ag特異性的體液免疫應(yīng)答然后，我們調(diào)查了粘附分子的共表達對抗原特異性免疫應(yīng)答誘導(dǎo)作用的影響。對于所有實驗，在第0周和第2周將50微克各種DNA表達構(gòu)建物肌內(nèi)注射入BALB／c小鼠。第一個測定的免疫參數(shù)是抗原特異性體液應(yīng)答。在第0、2和6周收集受免疫小鼠的抗血清，用ELISA分析針對HIV-1 gp120蛋白的特異性抗體應(yīng)答。ICAM-1、LFA-3或VCAM-1的共表達看來對pCEnv免疫誘導(dǎo)的特異性抗體結(jié)合分布圖有最小的影響。用與pCGag／pol共免疫的組看到了類似的結(jié)果。
ICAM-1或LFA-3的共表達增強了Ag-特異性的Th增殖反應(yīng)還研究了粘附分子共表達對細胞免疫應(yīng)答程度的影響。CD4+T輔助細胞增殖反應(yīng)的誘導(dǎo)是很重要的，因為Th細胞在通過B細胞誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和通過CD8+T細胞誘導(dǎo)CTL應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。測定了用pCGag／pol免疫的小鼠以及與pCICAM-1、pCLFA-3或pCVCAM-1共免疫的小鼠的Th增殖反應(yīng)。將重組gp120 HIV-1包膜蛋白(5微克／毫升和1微克／毫升)接種到各孔中，以便特異性刺激T細胞增殖。我們還用非相關(guān)蛋白分析了這些組中T細胞的非特異性刺激，發(fā)現(xiàn)非特異性抗原不誘導(dǎo)體外T細胞增殖反應(yīng)。用對照載體免疫的對照組中只有本底水平的增殖，在單用pCEnv免疫的組中發(fā)現(xiàn)有中等水平的增殖。相反，在與PCICAM-3或pCLFA-3免疫的組中有明顯較高水平的增殖反應(yīng)。另一方面，用VCAM-1基因共免疫的組未顯示抗原特異性Th應(yīng)答有任何增強。用pCGag／pol共免疫的組觀察到相似的結(jié)果。在用兩免疫原之一的重復(fù)實驗中，與pCICAM-1或pCLFA-3共輸送導(dǎo)致抗原特異性增殖反應(yīng)增加3至4倍。
ICAM-1或LFA-3的共表達增強了Ag-特異性CTL應(yīng)答為了進一步研究細胞免疫力的增強情況，我們用經(jīng)pCEnv和pCGag／pol共免疫的小鼠的脾細胞進行CTL試驗。試驗的進行是體外刺激效應(yīng)脾細胞，然后測定特異性以及非特異性牛痘感染的或肽處理的靶細胞的鉻釋放。為了計算靶細胞的特異性溶解，從特異性靶細胞溶解百分比中減去不相關(guān)靶細胞的溶解百分比。從經(jīng)pCDNA3、pCICAM-1、pCLFA-3或pCVCAM-1免疫的對照動物中觀察到本底水平的特異性殺傷作用，而經(jīng)pCEnv免疫的動物顯示出低水平的CTL應(yīng)答。另一方面，pCEnv和pCICAM-1的共免疫導(dǎo)致CTL活性顯著增加。在效靶(E∶T)比為50∶1下，在pCEnv和pCICAM-1共免疫后發(fā)現(xiàn)HIV-1包膜牛痘(vMN462)感染的靶細胞的特異性殺傷高于40％。在E∶T比為12．5∶1下，CTL活性滴度為20％特異性溶解。相反，pCEnv和pCLFA-3的共免疫導(dǎo)致CTL活性有較中等程度的增加。pCGag／pol和pCICAM-1以及pCGag／pol和pCLFA-3的共免疫后觀察到相似的CTL結(jié)果。
為了確定與pCICAM-1以及與pCLFA-3共表達后CTL應(yīng)答的增加是否局限于CD8+T細胞，進行CTL試驗，方法是在補體溶解除去效應(yīng)細胞群中的CD8+T細胞以及不除去該細胞的情況下，測定CTL活性。CD8+T細胞的除去導(dǎo)致與pCICAM-1和pCLFA-3共注射后所見的抗原特異性CTL增強作用受到抑制。這些結(jié)果表明，溶細胞活性的增強是抗原特異性的，并且依賴于CD8+T細胞。
ICAM-1或LFA-3的共表達增加了受刺激T細胞產(chǎn)生IFN-γ對免疫動物中受刺激CTL的細胞因子產(chǎn)生的分析，支持了所觀察到的CTL結(jié)果。在免疫應(yīng)答發(fā)展期間，細胞因子在指引和靶向免疫細胞中起關(guān)鍵作用。例如，IFN-γ復(fù)雜地參與調(diào)節(jié)T細胞介導(dǎo)的細胞毒性免疫應(yīng)答，而IL-4在B細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起主要作用。我們分析了用于CTL試驗的體外刺激的效應(yīng)細胞的上清液，并測試它們釋放細胞因子IFN-γ和IL-4的情況。我們發(fā)現(xiàn)，與pCICAM-1的共注射顯著增加了IFM-γ的水平。與pCLFA-3的共免疫導(dǎo)致IFN-γ的產(chǎn)生較適中的增加。另一方面，所有動物組釋放IL-4的水平相似。
ICAM-1的共表達顯著增加了受刺激T細胞的β-趨化因子產(chǎn)生最近我們報道了CD8+效應(yīng)T細胞通過在感染部位周圍產(chǎn)生特異性趨化因子而擴展了體內(nèi)的抗原特異性應(yīng)答。因此，我們分析受刺激CTL產(chǎn)生β-趨化因子的情況。我們分析了用于CTL試驗的體外刺激的效應(yīng)細胞的上清液，并測試了它們釋放β-趨化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES的情況。如我們以前所注意到的那樣，我們發(fā)現(xiàn)pCEnv的DNA免疫誘使MIP-1α、MIP-1β和RANTES的表達水平明顯高于對照載體。另外，我們注意到pCEnv和pCLFA-3的共注射使β-趨化因子生產(chǎn)水平高于pCEnv免疫組的水平。還要顯著的是，pCEnv與pCICAM-1的共免疫導(dǎo)致MIP-1α、MIP-1β和RANTES的產(chǎn)生比pCEnv免疫組有大幅度增加(2至4倍)。相反，pCVCAM-1的共給予沒有增強趨化因子的表達水平。這些結(jié)果支持了這樣一個結(jié)論，即ICAM-1和LFA-2提供了直接的T細胞共同刺激作用。
ICAM-1和CD86的共表達協(xié)同增強Ag-特異性CTL應(yīng)答認為B7(CD80和CD86)通道是輸送關(guān)鍵的第二信號引導(dǎo)和擴展T細胞應(yīng)答的主要共刺激通道。已經(jīng)在作為調(diào)節(jié)劑的DNA疫苗意義上檢測了這些分子。在此意義上，看來當CD86分子作為疫苗佐劑輸送時，它在CD8+細胞毒性T淋巴細胞的抗原特異性誘導(dǎo)中起著顯著的作用。CD86 cDNA與DNA免疫原的共給予顯著增加了抗原特異性CD8+CTL應(yīng)答。ICAM-1以及LFA-3的效應(yīng)可能依賴于B7-CD28信號，或它們可能代表另一個推動體內(nèi)CTL誘導(dǎo)的協(xié)同通道。因此，我們進一步研究了ICAM-1和LFA-3分子在與CD86分子共表達時是否能協(xié)同增強CTL誘導(dǎo)水平。我們發(fā)現(xiàn)ICAM-1和CD86分子的共表達能協(xié)同增強抗原特異性CTL應(yīng)答。另一方面，LFA-3和CD86分子的共表達沒有提高CTL應(yīng)答的水平。這些結(jié)果表明ICAM-1／LFA-1通道提供了獨立于CD86／CD28通道的T細胞共同刺激信號，它們能協(xié)同作用來擴展體內(nèi)T細胞應(yīng)答。
受刺激CTL產(chǎn)生IFN-γ以及β-趨化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES的水平進一步支持了這些結(jié)果，表明ICAM-1／LFA-1信號獨立于CD86／CD28信號起作用，并協(xié)調(diào)地擴展了T細胞應(yīng)答。當我們用上述方法分析效應(yīng)T細胞的上清液時，我們注意到LFA-3和CD86基因的共給予導(dǎo)致IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β和RANTES的水平明顯較高。這些結(jié)果進一步暗示ICAM-1和CD86在T細胞激活中的協(xié)同性質(zhì)。
討論在免疫或炎性應(yīng)答期間，淋巴細胞移動至接觸抗原的部位。淋巴細胞和內(nèi)皮細胞上的粘附分子在提供直接細胞接觸以及指引白細胞遷移中起著重要的作用。另外，粘附分子在T淋巴細胞與APC結(jié)合時起著重要作用。ICAM-1(CD54)是90-114kD的分子，它表達在內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和樹突細胞上，并與LFA-1和Mac-1結(jié)合。在所有的白細胞(包括T淋巴細胞)中均表達LFA-1，而Mac-1表達更局限于單核細胞、巨噬細胞和粒細胞。LFA-3(CD58)是55-70kD的表面分子，它由包括APCs的各種類型細胞表達(Springer，T．A．，等人，1987 Ann．Rev．Immunol．5223-252，納入本文作參考)。血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)是一種110kD的表面分子，它表達在激活的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞上(Osborn，L．等人，1989．Cell．591203-1211，納入本文作參考)。VCAM-1識別并結(jié)合極遲(very late)抗原-4(VLA-4)，該抗原組成型表達在大多數(shù)單核白細胞(包括嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和嗜堿性粒細胞)上，但在中性粒細胞上沒有(Elices，M．J．，等人1990 Cell．60577-584，納入本文作參考)。VCAM-1／VLA-4相互作用在白細胞遷移和血細胞滲出中起重要作用。
在此研究中，我們利用一種DNA免疫原模型來研究這些細胞表面粘附分子在提供T細胞激活和擴展所需刺激信號中的作用。在一個雙信號T細胞激活模型中，第一激活信號通過抗原性肽-MHC復(fù)合物與T細胞受體連接而介導(dǎo)。第二共刺激信號通過CD80／CD86共同刺激分子與存在于T細胞上的其受體(CD28／CTLA-4)連接來提供。盡管該雙信號模型在概念上是易懂的，且得到實驗結(jié)果的很好支持，但是T細胞激活過程中提供的共同刺激信號可能不僅僅局限于B7(CD80／CD86)分子。其它細胞表面分子如APC上的粘附分子也可能具有提供共同刺激作用的重要功能，它們在向CD4+和CD8+T細胞提供直接的信號中所起的作用有待研究。
粘附分子在白細胞移動、炎性細胞募集以及免疫監(jiān)視中很重要。最近已經(jīng)提出粘附分子在T細胞激活中有作用。我們用均能與T細胞配體結(jié)合的一個粘附分子亞組研究了該作用。我們選出三個相關(guān)的分子ICAM01(CD54)、LFA-3(CD58)和VCAM-1(CD106)。利用編碼ICAM-1、LFA-3和VCAM-1的DNA表達盒與我們的DNA免疫原，我們嘗試鑒定了這些粘附分子與抗原共表達的特異性作用。我們注意到，DNA免疫原和粘附分子ICAM-1以及LFA-3的共表達可以增強抗原特異性T細胞(CD4+和CD8+T細胞)應(yīng)答。ICAM-1或LFA-3分子與DNA免疫原的共表達導(dǎo)致Th細胞增殖反應(yīng)明顯增強。另外，與pCICAM-1的共免疫導(dǎo)致局限于CD8的CTL應(yīng)答顯著增加(與pCLFA-3的共免疫較為適中)。這些觀察進一步支持了這樣一個發(fā)現(xiàn)，即與LFA-3的共注射增加了受刺激CD8+T細胞產(chǎn)生IFN-γ以及β-趨化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES的水平。更令人印象深刻的是，與ICAM-1的共免疫導(dǎo)致IFN-γ和β-趨化因子的增加幅度更大。重要的是注意到單單增加細胞接觸或細胞并置不足以增強抗原特異性T細胞-介導(dǎo)的應(yīng)答。即使ICAM-1和VCAM-1具有相似的分子大小，但和VCAM-1的共注射對T細胞應(yīng)答卻沒有可測得的影響。另一方面，ICAM-1共表達顯著增加了CD4+和CD8+T細胞應(yīng)答的水平。這些結(jié)果暗示，T細胞刺激作用并不是它們的粘附性質(zhì)或分子大小所固有的。令人感興趣的是，增強CTL的CTL推動型粘附分子(ICAM-1和LFA-3)均在各種APC上表達。實際上，最佳的CTL誘導(dǎo)型粘附分子ICAM-1在樹突細胞上表達可能是很重要的。
我們還比較了增強的CTL誘導(dǎo)與靠CD86表達而增強的CTL誘導(dǎo)。我們發(fā)現(xiàn)CD86分子與ICAM-1(不是LFA-3)表達的組合能增強抗原特異性CTL應(yīng)答。在外周的免疫激活中起重要作用的IFN-γ以及β-趨化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES的產(chǎn)生顯著增加進一步支持了這些結(jié)果。盡管闡述這些分子的生物學(xué)意義需要進一步的研究，但是最近的一份研究發(fā)現(xiàn)了趨化因子MIP-1β和RANTES與CTL應(yīng)答之間的關(guān)系。雖然附加的研究能更深入地了解這些分子的共同刺激作用，但這些結(jié)果表面ICAM-1分子能通過獨立于CD86的通道提供T細胞共同刺激信號，并且它們能協(xié)同作用以增加提供給T細胞的共同刺激信號總水平?？傊@些結(jié)果支持粘附分子ICAM-1和LFA-3可能提供重要的共同刺激信號，這表明簡單的T細胞激活雙信號模型盡管在概念上是有用的，但可能不完整，應(yīng)進一步考慮和研究具有多個共同刺激來源的更新的模型。這些結(jié)果表明，以采用其它細胞表面分子的T細胞共同刺激功能為目標的進一步研究是有理由的。
關(guān)于這些研究的一個重要問題是具有增強細胞免疫應(yīng)答功能的這些分子確切地在那里。最近研究報道，注射質(zhì)粒DNA能低效率地轉(zhuǎn)染駐留的APC(包括巨噬細胞和樹突細胞)。用骨髓嵌合體的研究進一步支持了這些結(jié)果，該研究描述了骨髓衍生的細胞引發(fā)DNA免疫應(yīng)答的需求。與文獻相符的是在我們的研究中發(fā)現(xiàn)的一些共同刺激可能通過轉(zhuǎn)染以及駐留的專職APC增強的T細胞引發(fā)而發(fā)生。
和以前的報道一樣，這些結(jié)果支持了ICAM-1和LFA-3在T細胞共同刺激中的作用?？磥鞮FA-3對Ⅱ類應(yīng)答有特別的作用，而通常ICAM-1是CTL誘導(dǎo)以及CD8+效應(yīng)功能的非常強的推動物(通過β-趨化因子產(chǎn)生的增強而證明)。這些結(jié)果也支持了關(guān)于T效應(yīng)細胞在外周募集和擴展的協(xié)調(diào)性假設(shè)。最近，我們報道說，除了它們的化學(xué)引誘功能外，趨化因子還調(diào)節(jié)了外周部位的抗原特異性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)和擴增。我們注意到CD8+T效應(yīng)細胞在引發(fā)免疫應(yīng)答時控制著趨化因子的表達水平。因此，在趨化作用中，趨化因子通過濃度梯度調(diào)節(jié)淋巴細胞的移動。另外，粘附分子表達的相應(yīng)的重新分布在指引淋巴細胞至外周中提供了直接的細胞-細胞接觸。另外，粘附分子的表達受各種炎性細胞因子和趨化因子調(diào)節(jié)。例如，IFN-γ和TNF-α己證明能上調(diào)內(nèi)皮細胞和肌細胞的ICAM-1表達。
因此，CD8+T效應(yīng)細胞合成了募集更多APC和T細胞至炎性部位的趨化因子。這些T細胞將受β趨化因子產(chǎn)生的刺激而增強粘附分子的表達，而粘附分子的作用是推動IFN-γ的產(chǎn)生，并使T細胞受到共刺激。因此，一旦處于炎性部位，這些效應(yīng)CTL可能通過特異性趨化因子以及能擴展效應(yīng)細胞功能水平的粘附分子的表達而受到進一步調(diào)節(jié)。這些結(jié)果進一步支持了這樣一個觀點，即在抗原特異性免疫應(yīng)答的擴展期中、期末T效應(yīng)細胞能通過這些分子的協(xié)同表達和釋放來指導(dǎo)它們的命運。
實施例6粘附分子和共同刺激分子誘導(dǎo)不同抗原特異性免疫應(yīng)答并增強體內(nèi)抵抗單純皰疹病毒2型的保護性免疫力CD40配體和T細胞上的白細胞功能相關(guān)蛋白(LFA)分別與CD40和APC上的胞間粘附分子(ICAM)相互作用。我們用共同刺激分子CD40和CD40配體，以及粘附分子LAF-3和ICAM-1進行共免疫，然后分析對gD質(zhì)粒疫苗以及抵抗HSV-2致死性攻擊的保護力的免疫調(diào)節(jié)作用。我們發(fā)現(xiàn)，與LFA-3的共注射明顯增加了全身性gD-特異性IgG的產(chǎn)生。然而，與CD40、CD40配體和ICAM-1的共注射卻幾乎未發(fā)現(xiàn)IgG產(chǎn)生有所改變。另外，Th1型細胞應(yīng)答由CD40配體推動，而Th1和Th2型免疫應(yīng)答由LFA-3推動。與CD40配體以及LFA-3的共輸送還增強了致死性HSV-2攻擊后的存活率。這些研究證實共同刺激分子和粘附分子具有不同的共同刺激通道，它們能在產(chǎn)生抗原特異性保護性免疫力中起重要作用。
測試了共同刺激分子和粘附分子在誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答中的具體作用，以及用共同刺激分子和粘附分子作為質(zhì)粒一部分的疫苗效果，其中在小鼠HSV-2攻擊模型系統(tǒng)中輸送該質(zhì)粒來推動DNA疫苗誘導(dǎo)的保護性免疫力。我們發(fā)現(xiàn)共同刺激分子和粘附分子差異性地調(diào)節(jié)了抗原特異性免疫應(yīng)答。具體地說，與共同刺激分子CD40配體以及與粘附分子LFA-3的共輸送以依賴于抗原的方式誘導(dǎo)出明顯的CD4+T細胞活性，并增強了HSV-2致死性攻擊后的存活。
材料和方法小鼠-雌性4至6周齡BALB／c小鼠購自Harlan Sprague-Dawley(Indianapolis，Ind．)。按照國立衛(wèi)生研究院(Bethesda，Md．)和賓西法尼亞大學(xué)1ACUC(Philadelphia，Pa．)的指導(dǎo)進行護理。
試劑-HSV-2病毒株186(Philadelphia，Pa．賓西法尼亞大學(xué)的Schaffer教授慷慨贈與)繁殖在Vero細胞系中(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Md．)。在這些研究中，用重組HSV-2 gD蛋白作為重組抗原。人橫紋肌肉瘤(RD)細胞系獲自ATCC(Rockville，Md．)。
質(zhì)粒和DNA制備-如Pachuk，等人．1998 Current topics Microbiol．Immunol．226，79中所述的那樣(該文納入本文作參考)，制備編碼HSV-2 gD蛋白的DNA疫苗pAPL-gD2。將CD40、CD40配體、LFA-3和ICAM-1的cDNA克隆到表達載體pCDNA3中，分別產(chǎn)生pCDNA3-CD40、pCDNA3-CD40配體、pCDNA3-LFA和pCDNA3-ICAM-1。質(zhì)粒DNA在細菌中產(chǎn)生，用雙條帶CsCl制備法純化。
CD40和CD40配體基因構(gòu)建物的體外表達-將CD40、CD40配體、LFA-3和ICAM-1構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到RD細胞中，分析它們的表達。轉(zhuǎn)染72小時后收獲細胞，用異硫氰酸熒光素(FITC)-偶聯(lián)的針對LFA-3、ICAM-1、CD40和CD40配體的單克隆抗體(Pharmingen，San Diego，CA)進行FACS分析，測試表達情況。
小鼠DNA接種-通過28號針頭(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，N．J．)向BALB／c小鼠的四頭肌注射以100微升磷酸鹽緩沖液和0．25％布吡卡因-HCl(Sigma，St．Louis，MO)配制的gD DNA構(gòu)建物。將各種趨化因子和細胞因子基因表達盒樣品與pgD質(zhì)粒溶液混合，然后注射。
ELISA-用HRP偶聯(lián)的抗鼠IgG1和IgG2a(Zymed，San Francisco，CA)進行酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，以測定gD-特異性的IgG亞類的相對水平。ELISA滴度確定為顯示出光密度與原初小鼠血清相同的最高血清稀釋度的倒數(shù)。
趨化因子、Th1和Th2型細胞因子-在24孔測試板的孔中加入含有6×106脾細胞的1毫升等份。然后，在各孔中加入1微克HSV-2 gD蛋白／毫升。在5％CO2中37℃培育2天后，獲得細胞上清液，然后用市售的細胞因子試劑盒(Biosource，Intl．，Camarillo，Ca．和R & D Systems，Minneapolis，Md．)檢測上清液中IL-2、IL-10、IFN-γ、RANTES、MCP-1、和MIP-1α的水平，方法是將胞外液體加入細胞因子或趨化因子特異性的ELISA測試版中。
HSV-2陰道內(nèi)攻擊-在接種病毒前，用曾浸泡在0．1M NaOH溶液中的帶棉花塞頭的涂藥器(Hardwood Products Company，Guiford，ME)拭抹陰道內(nèi)區(qū)域，然后用干的棉花涂藥器清潔。然后每日檢查小鼠以評價存活率。
統(tǒng)計學(xué)分析-用配對的斯圖登特t測試和ANOVA進行統(tǒng)計學(xué)分析。比較不同免疫組之間的數(shù)值。p值小于0．05視為有意義。
結(jié)果CD40、CD40配體、LFA-3和ICAM-1能由轉(zhuǎn)染的細胞表達-將CD40、CD40配體、LFA-3和ICAM-1的基因個別克隆到pCDNA3表達載體中。為了測試CD40、CD40配體、LFA-3和ICAM-1構(gòu)建物是否能表達其相關(guān)蛋白，我們將它們體外轉(zhuǎn)染到人RD細胞中。利用FACS分析，我們發(fā)現(xiàn)CD40、CD40配體、LFA-3和ICAM-1表達盒的轉(zhuǎn)染分別導(dǎo)致CD40、CD40配體、LFA-3和ICAM-1的特異性表達。用pCDNA3(對照)、或表達CD40、CD40配體、LFA-3和ICAM-1的pCDNA3轉(zhuǎn)染RD細胞。轉(zhuǎn)染后3天，從測試版中取出細胞，用α-CD40、α-CD40配體、α-LFA-3、αICAM-1抗體通過FACS分析檢測轉(zhuǎn)染基因產(chǎn)物的表達。
LFA-3增強系統(tǒng)性IgG應(yīng)答-為了確定gD基因疫苗與CD40、CD40配體、LFA-3和ICAM-1表達載體的共注射是否能影響抗gD的系統(tǒng)性IgG應(yīng)答，以ELISA測試了DNA接種后稀釋度為100的血清。每組小鼠(n=8)用gD DNA疫苗(60微克)和共同刺激分子的基因(40微克)免疫兩次。在第二次注射DNA后2周，取出小鼠的血液，然后將血清1∶100稀釋，以便和gD反應(yīng)。gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)與CD40或CD40配體質(zhì)粒DNA(每只小鼠40微克)的共注射對整體IgG水平?jīng)]有顯著影響。系列稀釋每組等份合并的血清，以測定ELISA的滴度。還確定第二次免疫后2周等份合并的ELISA滴度為6400(CD40)、6400(CD40配體)和6400(單用gD DNA疫苗)。當我們對共注射gD DNA疫苗(每只小鼠10微克)加上這些共同刺激分子(每只小鼠40微克)一次后1個月時所得的血清進行測試時，也觀察到類似的結(jié)果。
在第0和2周用gD DNA疫苗(60微克)加上LFA-3粘附分子基因(40微克)對小鼠組(n=8)進行免疫。每兩周對小鼠取血，然后將血清1∶100稀釋來與gD反應(yīng)。與LFA-3 cDNA的共注射使系統(tǒng)性IgG應(yīng)答明顯高于單用gD DNA疫苗時的應(yīng)答，而與ICAM-1 cDNA的共注射發(fā)現(xiàn)幾乎沒有變化。系列稀釋每組等份合并的血清，以測定ELISA滴度。在405nm測定光密度。數(shù)值和柱圖代表平均值(n=8)和標準偏差。ELISA滴度確定為顯示出與原初小鼠血清的光密度相同的最高稀釋度的倒數(shù)。第二次免疫兩周后等份合并血清的ELISA滴度也確定為25600(LFA-3)、6400(ICAM-1)和6400(單用gD DNA疫苗)。
CD40配體和LFA-3影響IgG同種型方式。IgG亞類表明所誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的Th1對Th2的性質(zhì)。我們分析了與CD40、CD40配體、LFA-3以及ICAM-1共注射而誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG亞類。測定DNA載體免疫的小鼠中g(shù)D特異性IgG同種型的水平。每組小鼠(n=8)用gD DNA疫苗(60微克)加上共同刺激分子基因(40微克)或粘附分子基因(40微克)免疫兩次。在第二次DNA注射后2周，對小鼠取血，然后將每組等份合并的血清1∶100稀釋，以便與gD反應(yīng)。在405nm下測定光密度。與CD40配體的共同注射使gD特異性的IgG2a對IgG1的相對產(chǎn)量增加，而與CD40基因的共注射顯示出IgG同種型方式與單用gD DNA疫苗相似。IgG產(chǎn)生的這種偏移說明只有與CD40配體cDNA共同注射才誘導(dǎo)了更偏向Th1型的應(yīng)答。然而，與LFA-3共同注射使IgG1和IgG2a同種型均明顯高于單用gD DNA疫苗或ICAM-1共注射。這種增加表明LFA-3 cDNA的共注射誘導(dǎo)了Th1型以及Th2型應(yīng)答。
CD40配體和LFA-3增強了Th細胞增殖反應(yīng)-T輔助細胞分別在通過Ag刺激的B細胞擴展以及CD8+T細胞擴展而引發(fā)體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答中起重要作用。作為CD4+激活的特異性指標，測定T細胞增殖。重要的是在與細胞因子基因共免疫后當用特異性抗原體外刺激時測定所得的T細胞增殖水平。用gD-2蛋白(1和5微克／毫升)作為特異性刺激T細胞的抗原。對于陽性對照，用5微克／毫升PHA作為多克隆刺激物。在陰性對照中發(fā)現(xiàn)低本底水平的Th細胞增殖。然而，gD DNA疫苗接種誘導(dǎo)的Th細胞增殖反應(yīng)比陰性對照高得多。當與CD40配體和LFA-3 cDNA共同注射時，Th細胞增殖水平得到進一步加強。然而，在共注射了CD40和ICAM-1 cDNA的動物中幾乎未檢測到Th細胞應(yīng)答增加。注意到這種趨勢存在于測試的兩種不同的gD抗原濃度，反映出該作用是由CD40配體和LFA-3介導(dǎo)的。gD質(zhì)粒疫苗接種不產(chǎn)生CTL應(yīng)答，因為在Balb／c本底中缺少CTL表位。然而，為了更詳細地評價細胞效應(yīng)，下面我們測定細胞因子產(chǎn)生的情況。
CD40配體和LFA-3影響Th1和Th2型細胞因子的產(chǎn)生。Th1細胞因子(IL-2和IFN-γ)和Th2細胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)是我們了解免疫應(yīng)答極化現(xiàn)象的主要依據(jù)。認為Th1型免疫應(yīng)答推動細胞免疫力的誘導(dǎo)產(chǎn)生，而Th2型免疫應(yīng)答優(yōu)先推動體液免疫力。因此，我們研究了有和沒有共同刺激分子的gD DNA疫苗接種是否誘導(dǎo)Th1或Th2型免疫應(yīng)答。測定與共同刺激分子或粘附分子共免疫的小鼠的脾細胞中IL-2、IL-10、IFN-γ、RANTES、MIP-1α和MCP-1的產(chǎn)生水平。在第0和2周，用gD DNA疫苗(60微克)加上共同刺激分子基因或粘附分子基因(40微克)對每組小鼠(n=2)進行免疫。在最后一次注射DNA后兩周，處死兩只小鼠，合并脾細胞。用1微克／毫升gD-2蛋白刺激脾細胞2天。與CD40配體cDNA的共同注射顯著增加了IL-2和IFN-γ的產(chǎn)生，而此共注射同時減少了IL-10的產(chǎn)生。然而，在該試驗中，CD40加gD基因的共注射有稍稍增加IFN-γ的作用。但是，與LFA-3 cDNA共注射使IL-2、IL-10以及IFN-γ的產(chǎn)生均明顯超過gD DNA疫苗，而ICAM-1加gD基因的共注射在該試驗中只有稍稍增加的作用。這證實，CD40配體推動免疫應(yīng)答向Th1表型移動，而LFA-3則影響到體內(nèi)Th1和Th2兩種免疫表型。
CD40配體和LFA3影響β趨化因子的產(chǎn)生-β趨化因子(CC型)包括RANTES(活化后可調(diào)節(jié)的、正常T細胞表達和分泌的)、MIP(巨噬細胞炎性蛋白)-1α和MCP(單核細胞趨化蛋白)。MCP-1特別是化學(xué)引誘單核性吞噬細胞，并激活T細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞和單核吞噬細胞以及各種其它可溶性免疫調(diào)節(jié)物。與MCP-1相比，也有報告RANTES和MIP-1α是主要的HIV抑制因子。認為這些分子在調(diào)節(jié)炎性免疫應(yīng)答中是重要的。然而，它們在感染性疾病中的直接作用正在研究。CD40、CD40配體、LFA-3和ICAM-1分子作為疫苗佐劑與體內(nèi)趨化因子產(chǎn)生的關(guān)系仍不清楚。我們研究了gD DNA疫苗與CD40配體、CD40、LFA-3和ICAM-1 cDNA共注射所誘導(dǎo)產(chǎn)生的趨化因子(RANTES，MCP-1和MIP-1α)水平。單用gD DNA疫苗以抗原特異性方式增強了RANTES、MCP-1和MIP-1α的產(chǎn)生。另外，與CD40配體cDNA的共注射使RANTES和MIP-1α的生產(chǎn)明顯高于單用gD DNA疫苗。相反，MCP-1的產(chǎn)生則不受CD40配體共注射的影響。然而，與CD40分子的共注射顯示只稍稍增加了β趨化因子的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表明，與LFA-3 cDNA共注射使RANTES和MIP-1α的產(chǎn)生明顯高于單用gD DNA疫苗。類似的，ICAM-1共注射增加了RANTES和MIP-1α的產(chǎn)生。相反，MCP-1的產(chǎn)生被ICAM-1共注射所抑制。這種調(diào)節(jié)作用表明，共同刺激分子和粘附分子可能對β趨化因子家族個別成員的產(chǎn)生有特異性的作用。
CD40配體和LFA-3增強了抵抗HSV陰道內(nèi)(i．vag．)攻擊的保護作用。前面已測定了HSV-2(186)的致死劑量(LD)50。為了確定在gD基因疫苗接種中用CD40、CD40配體、LFA-3和ICAM-1 cDNA作為分子佐劑是否能影響抵抗HSV-2攻擊的保護作用，用DNA疫苗和各個共同刺激分子以及粘附分子的cDNA免疫，然后用4 LD50的HSV-2作陰道內(nèi)攻擊。選擇陰道內(nèi)感染途徑是因為HSV-2通過粘膜皮膚感染并引起泌尿道感染。測定用gD DNA疫苗以及共同刺激分子或粘附分子基因免疫兩次的小鼠的存活率。每組小鼠(n=10)用gD DNA疫苗(10微克)加共同刺激分子或粘附分子基因(40微克)免疫一次。DNA免疫4周后，用4 LD50的HSV-2病毒株186(1．4×104pfu)陰道內(nèi)攻擊小鼠。當用gD DNA疫苗免疫小鼠后，注意到有60％存活，但是在病毒攻擊后13天內(nèi)原初小鼠全部死亡。然而，與CD40配體的共注射使存活率增加至100％(保護比例增加40％)，而與CD40 cDNA的共注射顯示出與單用gD DNA疫苗相比只有很小的保護作用。另外，與LFA-3 cDNA共同注射使小鼠存活率增加至90％。然而，與ICAM-1 cDNA的共注射顯示出對于抵抗HSV-2感染的保護作用只有稍微好些的作用。
討論在抗原呈遞期間，APC的共同刺激分子對于T細胞應(yīng)答的啟動和分化是重要的。具體地說，CD40L-CD40的相互作用誘導(dǎo)APC表達出B7和IL-12。IL-12也增強T細胞表達CD40配體，而IFN-γ抑制CD40配體的表達，這表明T細胞上誘導(dǎo)CD40配體可能有一個自身調(diào)節(jié)的機制。另外，細胞因子、IL-2和IL-4也增強抗-CD3刺激的T細胞上CD40配體的表達，這表明在介導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答時，共同刺激分子和細胞因子之間有一種協(xié)同調(diào)節(jié)。另外，CD40-CD40配體的相互作用增加了Th細胞依賴型抗體應(yīng)答和促炎性細胞因子的產(chǎn)生，并且是巨噬細胞殺腫瘤和殺微生物活性所需的。具體地說，休眠T細胞并不表達CD40配體，而是由CD3-TCR觸發(fā)過程誘導(dǎo)的。CD40(45-50kDa糖蛋白)是TNF受體超家族的成員，它表達在B細胞、單核細胞和樹突細胞上。然而，其配體CD40配體(gp39)是一種Ⅱ型跨膜蛋白，它與TNF-α有序列同源性，并瞬時表達于激活的T細胞上。然而，T細胞上的粘附分子LFA-3與APC上的ICAM-1的相互作用受到對ICAM-1有高親和力和親合力的LFA-3的構(gòu)型變化的高度調(diào)控。已經(jīng)知道，LFA-3與CD3單克隆抗體或Ⅱ類加上抗原的共同刺激導(dǎo)致T細胞增殖，且T細胞產(chǎn)生各種細胞因子的水平更高。另外，LFA-3和ICAM-1的相互作用觸發(fā)了信號傳導(dǎo)通道。與共同刺激CD40／CD40配體分子相比，這些粘附分子與抗CD3或抗TCR抗體共同定位在表面上是將適當信號傳導(dǎo)給T細胞所需的。
APC刺激性或吸引性分子與DNA疫苗共注射導(dǎo)致免疫力兩分枝的誘導(dǎo)更為有效。在肌內(nèi)(i．m．)注射時，DNA被攝取到肌纖維內(nèi)，隨后內(nèi)源性表達，使天然形式的抗原呈遞給免疫系統(tǒng)。分泌的抗原被吞噬細胞攝取，然后由巨噬細胞以肽-MHC Ⅱ復(fù)合物的形式呈遞，它能提供刺激原初T細胞所需的第一激活信號、共同刺激配體和細胞因子。最近的證據(jù)還支持在肌內(nèi)或皮膚輸送DNA疫苗后體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染APC。DNA疫苗與共同刺激分子(如B7．1和B7．2)的共注射明顯增強了抗原特異性細胞免疫應(yīng)答，如Th細胞增殖反應(yīng)和細胞毒性T細胞活性。類似的，與GM-CSF基因的共注射在病毒性DNA疫苗模型中增強了抗體應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答。pLcaZ和CD40配體cDNA的共注射以依賴于抗原的方式增強了體液和細胞免疫應(yīng)答、尤其是CTL應(yīng)答。然而，還沒有通過共輸送共同刺激分子和粘附分子的HSV攻擊研究。比較誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答和抵抗HSV-2的保護性免疫力的過程中這兩種不同的通道也是令人感興趣的。
我們注意到，通過用CD40和CD40配體基因調(diào)節(jié)疫苗，gD特異性IgG的產(chǎn)生沒有顯著增加。然而，這與以前的發(fā)現(xiàn)(即，與CD40配體的共注射增強了針對和DNA載體一起輸送的某抗原(β-半乳糖苷酶)的抗體產(chǎn)生)不一致。這種差異可能是由于受測試抗原的性質(zhì)所致。然而，有一個相似的發(fā)現(xiàn)，即與CD40配體的共注射誘導(dǎo)出相似的IgG同種型產(chǎn)生方式。在我們的研究中，和CD40配體一同輸送誘導(dǎo)的IgG 2a產(chǎn)生(認為它由Th1型免疫應(yīng)答介導(dǎo))與IgG1同種型相比顯著增加。這暗示，通過共注射推動CD40配體表達的質(zhì)粒載體，可以實現(xiàn)gD特異性免疫應(yīng)答向Th1型極化。相反，發(fā)現(xiàn)與LFA-3共注射后的gD-特異性IgG的產(chǎn)生與單用gD DNA疫苗或ICAM-1共注射相比有明顯增加。這表明LFA-3能增強體內(nèi)抗體應(yīng)答。我們還注意到，LFA-3共注射使得Th1和Th2同種型的產(chǎn)生均有所增加(表現(xiàn)為IgG1和IgG2a同種型的產(chǎn)生有所增加)，暗示LFA-3能推動體內(nèi)的Th1和Th2免疫應(yīng)答。
Th細胞增殖的增加可通過共注射編碼CD40配體的質(zhì)粒DNA來實現(xiàn)。這再次與以前在其它模型中的發(fā)現(xiàn)一致，即CD40配體分子增加了抗原特異性Th細胞增殖和IFN-γ產(chǎn)生以及CTL應(yīng)答。這種方式與我們發(fā)現(xiàn)的細胞因子產(chǎn)生水平符合，因為與CD40配體cDNA的共注射增強了IL-2和IFN-γ的分泌，但抑制了IL-10的產(chǎn)生。因此，在gD DNA疫苗接種中采用CD40配體cDNA可有效地使免疫應(yīng)答向Th1表型極化，增加細胞介導(dǎo)的免疫力。然而，與LFA-3的共注射增強了IL-2、IL-10和IFN-γ的產(chǎn)生，而與ICAM-1的共注射稍稍增加了細胞因子的產(chǎn)生。這支持了LFA-3推動免疫應(yīng)答向Th1和Th2表型轉(zhuǎn)化的IgG同種型方式。
最近已經(jīng)報道，趨化因子以類似于細胞因子的方式在免疫和炎性應(yīng)答中起重要作用。通過局部給予Th2型細胞因子蛋白(IL-10)，HSV感染介導(dǎo)的眼部炎性疾病被抑制。這種應(yīng)用導(dǎo)致趨化因子產(chǎn)生受到抑制。該疾病(眼部炎癥)還可通過注射抗MIP-1α(而不是MCP-1)來改善，這再次表明MIP-1α是Th1型趨化因子。然而，趨化因子對感染狀況的作用正在研究。在本研究中，共輸送CD40配體使得RANTES和MIP-1α的產(chǎn)生增加超過共輸送CD40，提示CD40配體分子在調(diào)節(jié)T細胞產(chǎn)生β趨化因子中起重要作用。LFA-3和ICAM-1均增加了MIP-1α和RANTES的產(chǎn)生。相反，MCP-1的產(chǎn)生不受LFA-3的影響，或被ICAM-1抑制，表明該粘附分子也能調(diào)節(jié)體內(nèi)的β趨化因子的產(chǎn)生。
已有報道說體液免疫應(yīng)答、細胞免疫應(yīng)答或這兩者可能承擔(dān)了抵抗HSV感染的保護性免疫力。用HSV-特異性單克隆抗體的被動免疫導(dǎo)致抵抗致死性HSV感染的保護作用。在病毒感染期間，中和抗體能滅活游離的病毒顆粒，但是不能抑制胞內(nèi)HSV感染?？磥硪蕾囉诳贵w的、補體介導(dǎo)的以及依賴于抗體的細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)不足以控制HSV感染。因此，有人提出HSV-特異性細胞介導(dǎo)免疫力可能起著根除HSV-感染細胞并控制HSV感染的主要效應(yīng)功能。CD4+和／或CD8+T細胞介導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答在控制HSV感染上的重要性已詳細記載于文獻中。
我們發(fā)現(xiàn)與CD40配體分子的共注射誘導(dǎo)了抵抗HSV-2感染引起的死亡率的保護作用明顯增強。這提示保護性免疫力與Th1型細胞免疫力之間成正相關(guān)，共注射CD40配體分子后Th細胞增殖反應(yīng)以及IFN-γ產(chǎn)生水平的增加支持了這點。我們的觀察結(jié)果與以前的發(fā)現(xiàn)是一致的，即與CD40配體的共注射增強了抵抗主要利什曼原蟲(Leishmania major)或轉(zhuǎn)移性腫瘤表達抗原攻擊的保護性免疫力。我們還發(fā)現(xiàn)LFA-3誘導(dǎo)了抵抗HSV-2感染引起的死亡率的保護作用明顯增強。LFA-3增強細胞和／或體液免疫力似乎導(dǎo)致該系統(tǒng)中HSV-2引起的死亡率減少。還可能是CD40配體或LFA-3所誘導(dǎo)的IFN-γ部分承擔(dān)了體內(nèi)抗HSV-2活性。因此，CD40配體和LFA-3推動的細胞或體液介導(dǎo)的免疫力看來與抵抗HSV感染的保護力有關(guān)。
總之，這里顯示的數(shù)據(jù)提示共同刺激分子和粘附分子在誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答中具有不同的共同刺激通道。具體地說，CD40配體推動免疫應(yīng)答向Th1型轉(zhuǎn)化，而LFA-3對Th1和Th2免疫類型均是有利的。這些活性在以前只與細胞因子有關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，共同刺激分子和細胞因子一樣在誘導(dǎo)抗原特異性免疫力中起主要作用。另外，CD40配體和LFA-3在gD DNA疫苗接種中使抵抗HSV-2致死性攻擊的保護作用增強。該發(fā)現(xiàn)拓寬了我們對付感染性疾病的武器。
實施例7我們分析了趨化因子(IL-8、IP-10、RANTES、MCP-1、MIP-1α)對免疫表型以及抵抗HSV-2致死性攻擊的保護力的調(diào)節(jié)作用。我們發(fā)現(xiàn)IL-8和RANTES的共注射顯著增強了抗原特異性免疫應(yīng)答以及抵抗HSV-2致死性攻擊的保護作用。然而，MCP-1以及IP-10的共注射增加了受攻擊小鼠的死亡率。這些研究證實趨化因子能以類似于細胞因子的方式控制并推動免疫應(yīng)答，在產(chǎn)生抗原特異性保護性免疫力中起重要作用。
免疫或炎性反應(yīng)的啟動是一個復(fù)雜的過程，它涉及共同刺激分子、粘附分子、細胞因子和趨化因子的協(xié)同表達。具體地說，趨化因子在免疫細胞移動至宿主防御機制外周部位的分子調(diào)節(jié)中很重要。根據(jù)兩個半胱氨酸殘基中存在(α家族)或不存在(β家族)一個氨基酸序列，該趨化因子超家族可分為兩個亞家族。已經(jīng)證明α和β趨化因子能誘導(dǎo)各種類型的免疫細胞(包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和單核細胞)的直接遷移。最近，α趨化因子家族(CXC型，白細胞介素(IL)-8和干擾素-γ可誘導(dǎo)的蛋白(IP)-10)和β趨化因子家族(CC型，RANTES(活化后可調(diào)節(jié)的、正常T細胞表達和分泌的因子)、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1以及巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-1α)已經(jīng)顯示能化學(xué)引誘T淋巴細胞。具體地說，IL-8和IP-10表現(xiàn)為化學(xué)引誘中性粒細胞，誘導(dǎo)它們離開血流遷移進入周圍組織中。類似的，RANTES化學(xué)引誘單核細胞、未受刺激的CD4+／CD45RO+記憶性T細胞以及受刺激的CD4+和CD8+T細胞。MIP-1α已知能化學(xué)引誘嗜酸性粒細胞并使其脫粒。MIP-1α還誘導(dǎo)嗜堿性粒細胞和肥大細胞釋放組胺，并化學(xué)引誘嗜堿性粒細胞和B細胞。MCP-1是慢性炎性疾病中的一種重要的趨化因子。MCP-1誘導(dǎo)單核細胞從血流中遷移出來并變成組織巨噬細胞。MCP-1還化學(xué)引誘激活的記憶亞組的T淋巴細胞。最近的研究表明，趨化因子受體標記T細胞亞組和趨化因子可能涉及抗原特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。
為了研究免疫應(yīng)答和保護性免疫力的調(diào)節(jié)，我們將編碼HSV-2 gD蛋白的DNA表達構(gòu)建物與編碼趨化因子(IL-8、IP-10、RANTES、MCP-1、MIP-1α)的質(zhì)粒一同輸送。然后，我們分析了它們在抗原特異性免疫誘導(dǎo)和抵抗攻擊的保護力中的調(diào)節(jié)作用。首先，我們研究了所選趨化因子對抗原特異性免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的體內(nèi)影響。我們用gD疫苗和2種促炎性細胞因子TNF家族基因(TNF-α和TNF-β)免疫動物作為對照。研究這些促炎細胞因子，因為認為它們以相似的方式參與早期免疫應(yīng)答，應(yīng)視作正對照。用ELISA測定經(jīng)DNA載體免疫的Balb／c小鼠系統(tǒng)性gD-特異性IgG的水平。每組小鼠(n=10)在第0和2周用gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)加趨化因子基因(每只小鼠40微克)或TNF基因(每只小鼠40微克)免疫。表達gD抗原和趨化因子的DNA構(gòu)建物以前已被克隆(Pachuk，等人，1988 Current topics Microbiol．Immunol．226，79；Kim，等人1988 J．Clin．Invest．102，1112；和Kim等人，1998 Eur．J．Immunol．28，1089)。第二次免疫后2周取小鼠血液，然后系列稀釋每組等份合并的血清與gD反應(yīng)。ELISA滴度確定為顯示與原初小鼠血清光密度相同的最高血清稀釋度的倒數(shù)。測定405nm下的吸收值(O．D．)。第二次免疫后兩周收集的等份合并血清的ELISA滴度確定為12800(IL-8)、6400(IP-10)、6400(RANTES)、6400(MCP-1)、12800(MIP-1α)、25600(TNF-α)、6400(TNF-β)以及6400(單用gD DNA疫苗)。這表明與IL-8和MIP-1α基因的共注射導(dǎo)致gD特異性IgG抗體有適中但不顯著的增加。相反，IP-10、RANTES或MCP-1顯示出抗體應(yīng)答水平與單用pgD疫苗接種的水平相似。TNF-αcDNA對照導(dǎo)致系統(tǒng)性IgG水平明顯高于單用gD DNA疫苗的水平。
已經(jīng)報道說，IgG1同種型由Th2型細胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生，而IgG2a同種型的產(chǎn)生則受Th1型細胞因子的影響和體內(nèi)推動。這已被用作確定免疫應(yīng)答是否在Th1或Th2細胞因子控制下的指標。我們分析了共注射所誘導(dǎo)的IgG亞類。測定每個免疫組誘導(dǎo)的IgG同種型。每組小鼠(n=10)在第0和2周用gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)加趨化因子基因(每只小鼠40微克)或TNF基因(每只小鼠40微克)免疫。在最后一次免疫后2周對小鼠取血，然后1∶100稀釋血清用于和gD反應(yīng)。為了確定gD特異性IgG亞類的相對水平，用偶聯(lián)HRP(Zymed，San Francisco，CA)的抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3代替抗鼠IgG-HRP。測定405nm下吸收值(O．D．)。相對光密度計算成每種IgG亞類的光密度／總光密度。柱條圖代表每種小鼠IgG亞類的相對光密度的平均值(n=10)。測定IgG2a與IgG1(Th1與Th2)的相對比值。pgD免疫組的IgG2a與IgG1比值為0．62。與IL-8、RANTES或TNF-α基因共注射使gD特異性IgG2a與IgG1的相對比值增加至0．8。另一方面，與IP-10和MIP-1α的共注射使IgG2a與IgG1的相對比值降低至0．3和0．4，而與MCP-1或TNF-β基因的共免疫導(dǎo)致IgG亞型方式與單用pgD疫苗接種相似。此分析表明，IL-8和RANTES以類似于IFN-γ型細胞因子的方式推動體內(nèi)免疫應(yīng)答向Th1表型移動。因此，這些結(jié)果延伸了以前在HIV模型中的發(fā)現(xiàn)，即體液免疫應(yīng)答向Th1或Th2移動可受趨化因子調(diào)節(jié)，這再次提示趨化因子能調(diào)節(jié)體內(nèi)的細胞因子產(chǎn)生。
細胞增殖是用來評價細胞介導(dǎo)免疫力效果的一個標準參數(shù)。我們測定了與細胞因子基因共免疫后用gD蛋白體外刺激免疫的脾細胞后的Th細胞增殖反應(yīng)。測定用α-趨化因子cDNA、β-趨化因子cDNA和TNF對照共免疫的Balb／c小鼠經(jīng)體外gD刺激后的脾細胞的Th細胞增殖水平。每組小鼠(n=2)在第0和2周用gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)加趨化因子基因(每只小鼠40微克)或TNF基因(每只小鼠40微克)進行免疫。最后一次注射DNA的2周后，處死兩只小鼠，合并脾細胞進行增殖試驗。用每毫升1微克和5微克的gD-2蛋白刺激脾細胞，用每毫升5微克的PHA作為陽性對照。刺激3天后，收獲細胞，計數(shù)cpm。樣品試驗一式三份。PHA對照樣品顯示的刺激指數(shù)為單用pgD DNA疫苗接種導(dǎo)致gD特異性的Th細胞增殖反應(yīng)的40-50。我們還發(fā)現(xiàn)與IL-8、RANTES以及TNF-αcDNA共注射后Th細胞增殖反應(yīng)的增加明顯超過單用gD DNA疫苗時的增加。我們還注意到與TNF-β基因共注射使增殖稍有增加。相反，與IP-10、MCP-1和MIP-1α基因的共免疫看來對Th細胞增殖反應(yīng)只有極小的影響。然而，共注射顯示對于PHA誘導(dǎo)的非特異性Th細胞增殖反應(yīng)(S．I．范圍為40至50)沒有影響。由于Balb／c本底中缺少CTL表位，因此gD質(zhì)粒疫苗接種不產(chǎn)生CTL應(yīng)答。然而，為了更詳細地評價細胞免疫，下面我們檢查細胞因子的產(chǎn)生情況。
Th1細胞因子(IL-2和IFN-γ)和Th2細胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)已經(jīng)成為我們了解免疫應(yīng)答極化現(xiàn)象的主要依據(jù)。認為Th1型免疫應(yīng)答推動細胞免疫力的誘導(dǎo)產(chǎn)生，而Th2型免疫應(yīng)答優(yōu)先推動體液免疫力。因此，根據(jù)IgG表型結(jié)果，我們通過分析細胞因子的直接釋放來進一步評價Th1對Th2的問題。如表4所示，與IL-8 cDNA共同注射可使IL-2的產(chǎn)生大幅度增加幾乎7倍。與TNF-αcDNA的共注射以及與MIP-1α表達盒的共注射也誘導(dǎo)了IL-2。具體地說，RANTES以及IL-8的共輸送使IFN-γ的產(chǎn)生有最顯著的增加(分別為20倍和6倍)，這進一步支持了同種型的結(jié)果，并證實IL-8和RANTES以依賴于抗原的方式介導(dǎo)Th1型細胞免疫應(yīng)答。RANTES、IL-8、TNF-α和TNF-β共注射還使IL-10的產(chǎn)生明顯高于單用pgD疫苗時的水平。這說明IL-8和RANTES對Th1型T細胞的推動優(yōu)于對Th2型T細胞。
為了確定趨化因子共注射是否能以依賴于抗原的方式誘導(dǎo)β趨化因子產(chǎn)生，我們作共免疫，然后分析用重組gD抗原或?qū)φ湛乖w外刺激后脾細胞釋放β趨化因子的水平。如表5所示，與IL-8 cDNA的共注射顯著增加了MCP-1的產(chǎn)生水平，但是與RANTES以及與MIP-1α表達盒的共注射卻使MCP-1的產(chǎn)生水平降低。具體地說，RANTES和IL-8的共輸送使MIP-1α產(chǎn)生的增加最為顯著。就RANTES而言，IL-8和RANTES共注射使RANTES的產(chǎn)生增加超過了單用pgD疫苗時的水平。這表明，在HSV模型中，RANTES調(diào)節(jié)抗原特異性免疫應(yīng)答的方式與IL-8不同。這還支持了趨化因子調(diào)節(jié)其自身產(chǎn)生的觀點。
HSV是各種人疾病，例如唇皰疹、眼部感染、腦炎和生殖道感染的病原體。HSV能建立病毒潛伏性感染，伴有在宿主中頻繁復(fù)發(fā)。在病毒感染期間，中和抗體滅活病毒顆粒，但是不能控制胞內(nèi)HSV感染。相反，細胞介導(dǎo)的免疫力起著根除HSV感染細胞和HSV體內(nèi)傳播的主要效應(yīng)功能。針對HSV產(chǎn)生的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的過繼轉(zhuǎn)移在動物體內(nèi)產(chǎn)生了抵抗HSV致死性攻擊的完全保護力。而且，有幾篇報道說Th1型CD4+T細胞在抵抗HSV-2攻擊的保護作用中起著更為重要的作用。當體內(nèi)的CD4+T細胞缺失時，就喪失了抵抗HSV的保護性免疫力。另外，Th1型CD4+T細胞產(chǎn)生了大量IFN-γ。IFN-γ上調(diào)了HSV感染的細胞上的Ⅰ類和Ⅱ類表達，使其更好地被細胞毒性CD4+T細胞和CD8+CTL識別，并具有直接的抗HSV作用。Th1型細胞因子cDNA的共輸送增強了HSV-2致死性攻擊后的存活率，而Th2型細胞因子cDNA的共輸送卻惡化了該疾病狀況。類似的，在HSV攻擊模型中，原型Th1型細胞因子IL-12 cDNA共輸送所增強的保護作用由Th1型CD4+T細胞介導(dǎo)，從而強調(diào)了Th1型T細胞介導(dǎo)的抵抗HSV感染的保護性免疫力的重要性。
抗原特異性免疫調(diào)節(jié)影響病原體復(fù)制是重要的。測定經(jīng)gD DNA疫苗加上α趨化因子cDNA、β趨化因子cDNA以及TNF對照免疫的Balb／c小鼠的存活率。每組小鼠在第0和2周用gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)加趨化因子基因(每只小鼠40微克)或TNF基因(每只小鼠40微克)進行免疫。在第二次免疫后3周，用200 LD50的HSV-2病毒株186(7×105PFU)陰道內(nèi)攻擊小鼠。在接種病毒前，用曾浸泡在0．1MNaOH溶液中的帶棉花塞頭的涂藥器(Hardwood Products Company，Guiford，ME)拭抹陰道內(nèi)區(qū)域，然后用干的棉花涂藥器清潔。每日檢查小鼠以評價存活率。在病毒攻擊后61天計數(shù)存活的小鼠。重復(fù)該方法一次，獲得預(yù)計的結(jié)果。我們分析趨化因子共注射在鼠皰疹攻擊模型中的保護效率。在第0和2周對小鼠作DNA載體肌內(nèi)共免疫，然后在第二次免疫后3周用HSV-2攻擊。選擇陰道內(nèi)攻擊途徑是因為HSV-2通過粘膜皮膚感染。單用gD DNA疫苗免疫小鼠后，經(jīng)200LD50的HSV-2陰道內(nèi)攻擊的小鼠有63％存活。與IL-8以及RANTES cDNA的共注射使得該存活率增加至88％(保護率增加幾乎30％)，而與MCP-1以及IP-10的共注射使該存活率降低至25％(較單用gD疫苗時的總存活減少超過50％)。類似的，MIP-1α的共注射也反面地影響了疫苗接種動物的存活率。如果考慮每個趨化因子組中測試的動物總數(shù)的話，這些觀察結(jié)果是明顯的(單用gD的存活率，18只中有11只，61％；IL-8的存活率，18只中有17只，94％；IP-10的存活率，18只中有5只，28％；RANTES的存活率，18只中有17只，94％；MCP-1的存活率，18只中有6只，33％；MIP-1α的存活率，18只中有8只，44％)。這表明，與IL-8以及RANTES趨化因子基因的共注射增強了抵抗HSV致死性攻擊的保護作用，而與IP-10和MCP-1以及MIP-1α(程度較低)的共注射盡管誘導(dǎo)了免疫應(yīng)答，卻使得動物更易受病毒感染。這支持了IL-8和RANTES通過抗原特異性免疫調(diào)節(jié)作用增強抵抗HSV-2感染的保護力的觀點。這些研究表明趨化因子能以類似于細胞因子的方式(Th1對Th2)起作用和調(diào)節(jié)重要的免疫應(yīng)答和疾病進展。通過使用共輸送的趨化因子cDNA，不僅影響免疫應(yīng)答還影響對疾病的保護力，可以實現(xiàn)顯著的免疫調(diào)節(jié)。另外，在制備針對HSV的更有效的疫苗或免疫治療中，采用輸送趨化因子基因的佐劑(尤其是IL-8和RANTES)將是重要的。我們在前文報道說，與Th1型細胞因子基因共注射增加了抵抗HSV致死性攻擊的保護率，而與Th2型細胞因子共注射則增加了動物對病毒感染的易感性。在發(fā)病機理的研究中，已報道了Th1樣細胞因子反應(yīng)對于抵抗病原性感染的重要性。因此，Th1和／或Th2型免疫應(yīng)答似乎可能由這些趨化因子推動，從而根據(jù)免疫應(yīng)答的性質(zhì)來影響抵抗HSV感染性攻擊的保護力。
我們在皰疹攻擊模型中比較了TNF家族共注射的保護效率。與TNF-α以及TNF-β基因的共同注射還使受攻擊小鼠的存活率降低至25％(比單用gD疫苗時的總體存活減少50％以上)。盡管經(jīng)TNF-α基因共注射的小鼠的gD特異性抗體和Th細胞增殖水平以及細胞因子產(chǎn)生水平(IL-2、IFN-γ、IL-10)比單用gD DNA疫苗時的水平要高得多，但是在那些動物中發(fā)現(xiàn)TNF細胞因子介導(dǎo)了對HSV-2感染的易感性。造成該現(xiàn)象的原因還不清楚，但是這強烈支持了這樣一個結(jié)論，即應(yīng)答性質(zhì)對于控制病原性感染是非常重要的。
總之，本文提供的數(shù)據(jù)證明趨化因子能以依賴于抗原的方式調(diào)節(jié)Th1和／或Th2型免疫應(yīng)答。以前認為這些活性只與細胞因子有關(guān)，這暗示趨化因子可以象細胞因子一樣在誘導(dǎo)抗原特異性免疫力中起主要作用。趨化因子在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答用于免疫治療和疫苗接種中的應(yīng)用值得進一步研究。
表1MadCAM-1登陸號 U80016作者Leung，E．，等人雜志Immunogenetics46(2)，111-119(1997)MadCAM-1登陸號 U43628作者Shyjan，A．M．，等人雜志J．Immunrol．156(8)，285l-2857(1996)NGF登陸號 M57399作者Kretschmer，P．J．，等人雜志Growth Factors 5，99-114(1991)IL-7登陸號 J04156作者Goodwin，R．G．，等人雜志Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．86(1)，302-306(1989)VEGF登陸號 M32977作者Leung，D．W．，等人雜志Science 246，1306-1309(1989)TNF-R登陸號 M60275作者Gray，P．W．，等人雜志Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．87，7380-7384(1990)TNF-R登陸號 M63121作者Himmler，A．，等人雜志DNA Cell Biol．9，705-715(1990)Fas登陸號 M67454作者Itoh，N．，等人雜志Cell 66(2)，233-243(1991)CD40L登陸號 L07414作者Gauchat，J．F．M．，等人雜志FEBS Lett．315，259-266(1992)IL-4登陸號 M23442作者Arai，N．，等人雜志J．Immunol．142(1)，274-282(1989)IL-4登陸號 M13982作者Yokota，T．，等人雜志Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．83(16)，5894-5898(1986)CSF登陸號 M37435作者Wong，G．G．，等人雜志Science 235(4795)，1504-1508(1987)G-CSF登陸號 X03656作者Nagata，S．，等人雜志EMBO J．5(3)，575-581(1986)G-CSF登陸號 X03655作者Nagata，S．，等人雜志EMBO J．5(3)，575-581(1986)GM-CSF登陸號 M11220作者Lee，F(xiàn)．，等人雜志Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．82(13)，4360-4364(1985)GM-CSF登陸號 M10663作者Wong，G．G．，等人雜志Science 228(4701)，810-815(1985)M-CSF登陸號 M27087作者Takahashi，M．，等人雜志Biochem．Biophys．Res．Commun．161(2)，892-901(1989)M-CSF登陸號 M37435作者Wong，G．G．，等人雜志Science 235(4795)，1504-1508(1987)LFA-3登陸號 Y00636作者Wallner，B．P．，等人雜志J．Exp．Med．166(4)，923-932(1987)ICAM-3登陸號 X69819作者de Fougerolles，A．R．，等人雜志UnpublishedICAM-2登陸號 X15606作者Staunton，D．E．，等人雜志Nature 339(6219)，61-64(1989)ICAM-1登陸號 J03132作者Staunton，D．E．，等人雜志Cell 52(6)，925-933(1988)PECAM登陸號 M28526作者Newman，P．J．，等人雜志Science 247，1219-1222(1990)p150．95登陸號 Y00093作者Corbi，A．L．，等人雜志EMBO J．6(13)，4023-4028(1987)Mac-1登陸號 J03925作者Corbi，A．L．，等人雜志J．Biol．Chen．263(25)，12403-12411(1988)LFA-1登陸號 Y00796作者Larson．R．，等人雜志J．Cell Biol．108(2)，703-712(1989)CD34登陸號 M81104作者Simmons，D．L．，等人雜志J．Immunol．148，267-271(1992)RANTES登陸號 M21121作者Schall，T．J．，等人雜志J．Immunol．141，1018-1025(1988)IL-8登陸號 M28130作者Mukaida，N．，等人雜志j．IMMUNOL．143(4)，1366-1371(1989)MIP-1α登陸號 U72395作者Fridell，R．A．，等人雜志J．Cell．Sci．110(Pt 11)，1325-1331(1997)E-selecton登陸號 M24736作者Bevilacqua，M．P．，等人雜志Science 243(4895)，1160-1165(1989)CD2登陸號 M14362作者Sewell，W．A．，等人雜志-1 Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．83，8718-8722(1986)雜志-2 Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．84，7256-7256(1987)CD2登陸號 M16336作者Sayre，P．H．，等人雜志Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．84(9)，2941-2945(1987)MCP-1登陸號 S69738作者Li，Y．S．，等人雜志Mol．Cell．Biochem．126(1)，61-68(1993)MCP-1登陸號 S71513作者Yoshimura，T．，等人雜志Adv．Exp．Med．Biol．305，47-56(1991)L-selection登陸號 X16150作者Tedder，T．F．，等人雜志J．Exp．Med．170(1)，123-133(1989)P-selection登陸號 M25322作者Johnston，G．I．，等人雜志Cell 56，1033-1044(1989)FLT登陸號 X94263作者Mandriota，S．J．，等人雜志J．Biol．Chem．271(19)，11503-11505(1996)FLT登陸號 X51602作者-1 Shibuya，M．等人雜志-1 Oncogene 5(4)，519-524(1990)作者-2 Han，H．J．，et al．雜志-2 Hum．Mol．Genet．2(12)，2204(1993)Apo-1登陸號 X63717作者Oehm等人雜志J．Biol．Chem．，1992，267(15)，10709-15Fas登陸號 M67454作者Itoh等人雜志Cell，1991，66(2)，233-43TNFR-1登陸號 M67454作者Nophar等人雜志EMBO J．，1990，9(10)，3269-78p55登陸號 M58286作者Loetscher等人雜志Cell，1990，61，351-359WSL-1登陸號 Y09392作者Kitson等人雜志Nature，1996，384(6607)，372-5DR3登陸號 U72763作者Chinnaiyan等人雜志Science，1996，274(5829)，990-2TRAMP登陸號 U75381作者Bodmer等人雜志Immunity，1997，6(1)，79-88Apo-3登陸號 U74611作者Marsters等人雜志Curr．Biol．，1996，6(12)，1669-76；AIR登陸號 U78029作者Degli-Esposti等人雜志LARD登陸號 U94512作者Screaton等人雜志Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1997，94(9)，4615-19NGRF登陸號 M14764作者Johnson等人雜志Cell，1986，47(4)，545-554DR4(TRAIL)登陸號 U90875作者Pan等人雜志Science，1997，276(5309)，111-113DR5登陸號 AF012535作者Sheridan等人雜志Science，1997，277(5327)，818-821KILLER登陸號作者Wu等人雜志Nature Genetics，印刷中TRAIL-R2登陸號 AF020501作者MacFarlane等人雜志J．Biol．Chem．，1997，印刷中TRICK2登陸號 AF018657作者Screaton等人雜志Curr．Biol．，1997，印刷中DR6登陸號 AF068868作者Pan等人雜志ICE登陸號 U13698作者Alnemri，E．S．，等人雜志J．Biol．Chem．270(9)，4312-4317(1995)ICE登陸號 U13697作者Alnemri，E．S．，等人雜志J．Biol．Chem．270(9)，4312-4317(1995)ICE登陸號 U13699作者Alnemri，E．S．，等人雜志J．Biol．Chem．270(9)，4312-4317(1995)VLA-1登陸號 X17033作者Takada．，等人雜志J．Biol．Chem．109(1)，397-407(1989)CD86(B7．2)登陸號 U04343作者Azuma，等人雜志Nature．366(6450)，76(1993)
表2小RNA病毒科屬鼻病毒屬(醫(yī)用)造成50％普通感冒病例。
Etheroviruses(醫(yī)用)包括脊髓灰質(zhì)炎病毒，柯薩奇病毒，?？?ECHO)病毒，人腸道病毒例如甲肝病毒。
口瘡病毒(Apthoviruses)(獸醫(yī)用)這些是足口腔疾病病毒。靶抗原VP1，VP2，VP3，VP4，VPG杯狀病毒科屬Norwalk組病毒屬(醫(yī)用)這些病毒是流行性胃腸炎的重要病原體。披膜病毒科屬α病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)例子包括Senilis病毒、RossRiver病毒和東方和西方馬腦炎病毒。
呼腸孤病毒屬(醫(yī)用)風(fēng)疹病毒。黃病毒科例子包括(醫(yī)用)登革熱病毒、黃熱病毒、日本腦炎病毒、圣路易斯腦膜炎病毒和虱傳腦炎病毒。丙肝病毒(醫(yī)用)這些病毒不屬于任何科，但被認為或者是披膜病毒或者是黃病毒。大部分類似于披膜病毒科。冠狀病毒科(醫(yī)用和獸醫(yī)用)傳染性支氣管炎病毒(禽)豬可傳遞性胃腸炎病毒(豬)豬血凝腦脊髓炎病毒(豬)貓傳染性腹膜炎病毒(貓)貓小腸冠狀病毒(貓)狗冠狀病毒(狗)人呼吸道冠狀病毒引起約40例普通感冒。EX．224E，0C43。
注意-冠狀病毒可能引起非甲型、非乙型和非丙型的肝炎。靶抗原E1-又稱M蛋白或基質(zhì)蛋白E2-又稱S蛋白或刺突蛋白E3-又稱HE或血凝elterose糖蛋白(并不存在于所有的冠狀病毒中)N-核衣殼彈狀病毒科屬Vesiliovirus狂犬病病毒(醫(yī)用和獸醫(yī)用)狂犬病靶抗原G蛋白N蛋白線狀病毒科(醫(yī)用)出血熱病毒，例如Marburg病毒和埃博拉(Ebola)病毒副粘病毒科屬副粘病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)腮腺炎病毒，新城疫病病毒(重要的雞致病原)麻疹病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)麻疹病毒、狗瘟熱肺病毒(醫(yī)用或獸醫(yī)用)呼吸道合胞病毒正粘液病毒科(醫(yī)用)流感病毒布尼亞病毒科(Bungavirus)屬布尼亞病毒屬(醫(yī)用)加利福尼亞腦炎，LA Crosse白蛉熱病毒屬(醫(yī)用)Rift峽谷熱漢坦病毒屬Puremala是一種hemahagin熱病毒內(nèi)羅畢病毒屬(獸醫(yī)用)內(nèi)羅畢綿羊病還有許多未歸類的布尼亞病毒屬沙粒病毒科(醫(yī)用)LCM，拉沙熱病毒呼腸孤病毒科屬 呼腸孤病毒屬可能是一種人病原輪狀病毒兒童急性胃腸道炎環(huán)狀病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)科羅拉多虱傳熱病毒、Lebombo(人)、馬腦炎病毒、藍舌病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒科亞科致癌病毒亞科(獸醫(yī)用和醫(yī)用)貓白血病病毒、HTLVⅠ和HTLVⅡ慢病毒亞科(醫(yī)用和獸醫(yī)用)HIV，貓免疫缺陷病毒、馬傳染病病毒、貧血病毒泡沫病毒亞科乳多空病毒科亞科多瘤病毒亞科(醫(yī)用)BKU和JCU病毒亞科乳頭瘤病毒亞科(醫(yī)用)與癌癥或乳頭瘤的惡性發(fā)展有關(guān)的許多種病毒腺病毒(醫(yī)用)EX AD7，ARD．，O．B．-引起呼吸道疾病-一些腺病毒，例如275，引起腸炎細小病毒科(獸醫(yī)用)
貓細小病毒引起貓腸炎貓瘟病毒狗細小病毒豬細小病毒皰疹病毒科亞科α皰疹病毒亞科屬 單純皰疹病毒屬(醫(yī)用)HSVⅠ，HSVⅡ水痘病毒屬(醫(yī)用和獸醫(yī)用)假狂犬病-水痘-帶狀皰疹病毒亞科- β皰疹病毒亞科屬 巨細胞病毒屬(醫(yī)用)HCMV鼠巨細胞病毒(Muromegalovirus)亞科γ皰疹病毒亞科屬 淋巴隱病毒屬(醫(yī)用)EBV-(Burkitts淋巴細胞)Rhadino病毒痘病毒科亞科帶狀痘病毒亞科(醫(yī)用-獸醫(yī)用)屬 天花病毒屬牛痘屬副痘病毒屬-獸醫(yī)用山羊痘病毒屬(Auipoxvirus)獸醫(yī)用兔痘病毒屬豬痘病毒屬亞科Entemopoxviridue亞科肝DNA病毒科乙型肝炎病毒未分類的
δ肝炎病毒表3細菌病原革蘭陽性病原球菌包括肺炎球菌；葡萄球菌；和鏈球菌。革蘭陰性病原球菌包括腦膜炎球菌和淋球菌。
病原性革蘭陰性腸道桿菌包括腸桿菌、假單胞菌、不動細菌和艾肯氏菌、類鼻疽、沙門氏菌、志賀氏菌、嗜血桿菌、軟性下疳、布魯氏菌、土拉菌、耶爾森(巴斯德)菌、念珠狀鏈桿菌和螺菌、單核細胞增生李斯特菌、豬紅斑丹毒絲菌、白喉桿菌、霍亂桿菌、炭疽桿菌、杜諾萬氏菌(性病性肉芽腫)和巴爾通氏體。
病原性厭氧菌包括破傷風(fēng)桿菌；肉毒菌和其它羧菌；結(jié)核菌；麻風(fēng)桿菌和其它分枝桿菌。病原性螺旋體病包括梅毒；密螺旋體?。粺釒庋磕[；品它病和地方流行性梅毒；和鉤端螺旋體病。
由較高級病原菌和病原性真菌引起的其它感染包括放線菌??；諾卡菌??；隱球菌病，酵母病，組織胞漿菌病和球孢子菌病；念珠菌病，曲霉病，和毛霉菌病；孢子絲菌病，巴西芽生菌病，petriellidosis，球擬酵母菌屬，足分枝菌病和著色芽生菌?。缓推つw真菌病。
立克次體感染包括立克次體的和立克次體病。
支原體和衣原體感染的病例包括支原體肺炎；性病性淋巴肉芽腫；鸚鵡熱；和產(chǎn)期衣原體感染。真核細胞病原由病原性原蟲和蠕蟲引起的感染包括阿米巴??；瘧疾；利什曼病；錐蟲病；弓形體病；肺炎肺囊蟲??；巴貝蟲??；賈第鞭毛蟲??；旋毛蟲??；絲蟲病；血吸蟲??；線蟲??；吸蟲病；和絳蟲感染。
表4體外gD刺激后脾細胞產(chǎn)生IL-2、IL-10和IFN-γ的水平a免疫組 IL-2IFN-γ IL-10(pg／ml) (pg／ml)(pg／ml)原初 16．7±0．8 10．5±0．7 17．1±6．12pgD+pCDNA3134．7±3．5 22．4±2．4 57．1±4．4pgD+IL-8 756．4±5．4 138．5±4．7128±13pgD+IP-10 143．5±3．9 31．5±2．5 69．9±1．9pgD+RANTES59．9±1．1 520±13 360±46．5pgD+MCP-1 93．6±4．7 17．9±0．5 49．7±2．3pgD+MIP-1α345．4±1855．4±1．8 22±2．1pgD+TNF-α 403±13．377±6．386．8±6．2pgD+TNF-β 288±5．6 20．8±1．5 78．3±3．6a在第0和2周用gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)加趨化因子基因(每只小鼠40微克)或TNF cDNA(每只小鼠40微克)免疫每組Balb／c小鼠(n=2)。在最后一次注射DNA后兩周，處死兩只小鼠，合并脾細胞。將含有6×106脾細胞的1毫升等份加入24孔板的孔內(nèi)。然后，在各孔中加入1微克HSV-2 gD蛋白／毫升。在5％CO2中37℃培育2天后，獲得細胞上清液，然后用市售的細胞因子試劑盒(Biosource，Intl．，Camarillo，Ca．)檢測其中IL-2、IL-10和IFN-γ的水平，方法是將胞外液體加入細胞因子特異性的ELISA測試版中。樣品試驗一式三份，數(shù)值代表釋放的細胞因子濃度平均值±標準偏差。這代表了三個分開的實驗中顯示預(yù)計結(jié)果的一個實驗。
表5．體外gD刺激后脾細胞產(chǎn)生MCP-1、MIP-1α和RANTES的水平a免疫組 MCP-1 MIP-1α RANTES(pg／ml)(pg／ml)(pg／ml)原初 153．8±5．7 247±11 769±7pgD+pCDNA3 234±5．3 747±39 817±55pgD+IL-8 322±241411±1131284±53pgD+IP-10 246．3±2．7 1407±459831±52pgD+RANTES 189．7±0 2267±2191077±32pgD+MCP-1 209．2±6．4 725±501 646±45pgD+MIP-1α 142．7±3．3787±94 690±39a在第0和2周用gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)加趨化因子基因(每只小鼠40微克)免疫每組Balb／c小鼠(n=2)。在最后一次注射DNA后兩周，處死兩只小鼠，合并脾細胞。將含有6×106脾細胞的1毫升等份加入24孔板的孔內(nèi)。然后，在各孔中加入1微克HSV-2 gD蛋白／毫升。在5％CO2中37℃培育2天后，獲得細胞上清液，然后用市售的細胞因子試劑盒(R & D Systems，Minneapolis，Md．)檢測其中RANTES、MCP-1和MIP-1α的水平，方法是將胞外液體加入細胞因子或趨化因子特異性的ELISA測試版中。樣品試驗一式三份，數(shù)值代表釋放的趨化因子濃度平均值±標準偏差。這代表了三個分開的實驗中顯示預(yù)計結(jié)果的一個實驗。
權(quán)利要求
1．一種質(zhì)粒，它包含與調(diào)控元件操作性相連的編碼一種免疫原的核苷酸序列以及與調(diào)控元件操作性相連的編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，其中所述免疫調(diào)節(jié)蛋白選自MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150．95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變型、CD40、CD40L、血管生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6和蛋白酶類ICE。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其中所述免疫原是編碼病原體抗原、癌癥相關(guān)抗原或與自身免疫疾病相關(guān)細胞關(guān)聯(lián)的抗原的靶蛋白。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其中所述免疫原是病原體抗原。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其中所述免疫原是HIV-1抗原。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其中所述免疫調(diào)節(jié)蛋白是ICAM-1，它還包含與調(diào)控元件操作性相連的編碼CD86蛋白的核苷酸序列。
6．一種可注射的藥物組合物，它包含權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒。
7．一種誘導(dǎo)個體內(nèi)產(chǎn)生抵抗免疫原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予所述個體權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒。
8．一種質(zhì)粒，它包含與調(diào)控元件操作性相連的編碼單純皰疹抗原的核苷酸序列以及與調(diào)控元件操作性相連的編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，其中所述免疫調(diào)節(jié)蛋白選自IL-8、RANTES、LFA-3和CD40L。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒，其中所述單純皰疹抗原是HSV2gD。
10．一種可注射的藥物組合物，它包含權(quán)利要求8所述的質(zhì)粒。
11．一種對個體進行免疫以抵抗單純皰疹病毒感染的方法，該方法包括將權(quán)利要求8所述的質(zhì)粒給予所述個體。
12．一種組合物，它包含兩種質(zhì)粒第一種質(zhì)粒包含與調(diào)控元件操作性相連的編碼一種免疫原的核苷酸序列；和第二種質(zhì)粒包含與調(diào)控元件操作性相連的編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，其中所述免疫調(diào)節(jié)蛋白選自MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150．95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變型、CD40、CD40L、血管生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6和蛋白酶類ICE。
13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述免疫原是編碼病原體抗原、癌癥相關(guān)抗原或與自身免疫疾病相關(guān)細胞關(guān)聯(lián)的抗原的靶蛋白。
14．根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述免疫原是病原體抗原。
15．根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述免疫原是HIV-1抗原。
16．根據(jù)權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述免疫調(diào)節(jié)蛋白是ICAM-1，它還包含與調(diào)控元件操作性相連的編碼CD86蛋白的核苷酸序列，其中所述第一質(zhì)粒、所述第二質(zhì)?；虻谌齻€質(zhì)粒包含編碼CD86蛋白的所述核苷酸序列。
17．一種可注射的藥物組合物，它包含權(quán)利要求12所述的組合物。
18．一種誘導(dǎo)個體內(nèi)產(chǎn)生抵抗免疫原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將權(quán)利要求12所述的組合物給予所述個體。
19．一種組合物，它包含兩種質(zhì)粒第一種質(zhì)粒包含與調(diào)控元件操作性相連的編碼單純皰疹抗原的核苷酸序列；和第二種質(zhì)粒包含編碼IL-8、RANTES、LFA-3或CD40L的核苷酸序列。
20．根據(jù)權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述單純皰疹抗原是HSV2gD。
21．一種可注射的藥物組合物，它包含權(quán)利要求19所述的組合物。
22．一種對個體進行免疫以抵抗單純皰疹病毒感染的方法，該方法包括將權(quán)利要求19所述的質(zhì)粒給予所述個體。
23．一種重組疫苗，它包含與調(diào)控元件操作性相連的編碼一種免疫原的核苷酸序列以及與調(diào)控元件操作性相連的編碼一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，其中所述免疫調(diào)節(jié)蛋白選自MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150．95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變型、CD40、CD40L、血管生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6和蛋白酶類ICE。
24．根據(jù)權(quán)利要求23所述的重組疫苗，其中所述免疫原是編碼病原體抗原、癌癥相關(guān)抗原或與自身免疫疾病相關(guān)細胞關(guān)聯(lián)的抗原的靶蛋白。
25．根據(jù)權(quán)利要求23所述的重組疫苗，其中所述免疫原是病原體抗原。
26．根據(jù)權(quán)利要求23所述的重組疫苗，其中所述免疫調(diào)節(jié)蛋白是ICAM-1，它還包含與調(diào)控元件操作性相連的編碼CD86蛋白的核苷酸序列。
27．一種誘導(dǎo)個體內(nèi)產(chǎn)生抵抗免疫原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將權(quán)利要求1所述的重組疫苗給予所述個體。
28．根據(jù)權(quán)利要求23所述的重組疫苗，其中所述重組疫苗是重組牛痘疫苗。
29．根據(jù)權(quán)利要求23所述的重組疫苗，其中所述免疫原是病原體抗原。
30．一種誘導(dǎo)個體內(nèi)產(chǎn)生抵抗免疫原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將權(quán)利要求23所述的重組疫苗給予所述個體。
31．一種減毒活病原體，它包含與調(diào)控元件操作性相連的編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列，其中所述免疫調(diào)節(jié)蛋白選自MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150．95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變型、CD40、CD40L、血管生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6和蛋白酶類ICE。
32．一種對個體進行免疫以抵抗病原體的方法，該方法包括將權(quán)利要求31所述的減毒活病原體給予所述個體。
33．一種誘導(dǎo)個體內(nèi)產(chǎn)生抵抗免疫原的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將以下物質(zhì)給予所述個體所述免疫原和／或包含與調(diào)控元件操作性相連的編碼所述免疫原的核苷酸序列的核酸分子；和一種免疫調(diào)節(jié)蛋白和／或包含與調(diào)控元件操作性相連的編碼所述免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列的核酸分子，其中所述免疫調(diào)節(jié)蛋白選自MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150．95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變型、CD40、CD40L、血管生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6和蛋白酶類ICE。
34．根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述免疫原是編碼病原體抗原、癌癥相關(guān)抗原或與自身免疫疾病相關(guān)細胞關(guān)聯(lián)的抗原的靶蛋白。
35．根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述免疫原是病原體抗原。
36．根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述免疫原是HIV-1抗原。
37．根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述免疫調(diào)節(jié)蛋白是ICAM-1，所述方法還包括給予CD86蛋白或與調(diào)控元件操作性相連的編碼CD86蛋白的核苷酸序列。
38．一種可注射的藥物組合物，它包含治療有效量的特異性結(jié)合一種免疫調(diào)節(jié)蛋白的抗體，所述免疫調(diào)節(jié)蛋白選自MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150．95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突變型、CD40、CD40L、血管生長因子、IL-7、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6和蛋白酶類ICE。
39．一種治療自身免疫疾病個體的方法，該方法包括將權(quán)利要求38所述的可注射藥物組合物給予所述個體的步驟。
全文摘要
本發(fā)明公開了改良的疫苗,它包括與調(diào)控元件操作性相連的編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白的核苷酸序列。改良疫苗包括用來輸送外源抗原的DNA疫苗、重組疫苗和減毒活疫苗。公開了免疫個體的方法。公開了用來治療自身免疫疾病個體的組合物和方法。
文檔編號A61K48/00GK1291235SQ99803182
公開日2001年4月11日 申請日期1999年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月27日
發(fā)明者D·B·韋納, J·J·基姆, 辛正任 申請人:賓夕法尼亞州立大學(xué)托管會