OOU/ml青霉素、lOOU/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37°C，5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 每2-3天傳代一次。
[0029] 實施例1藥物對EV71的抑制實驗
[0030] 1、方法RD細(xì)胞（8 X IO5)或293細(xì)胞（6 X IO5)接種在六孔板無抗生素 DMEM完全 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，細(xì)胞生長平鋪90%以上時，RD細(xì)胞加入0、1、2、3、4、5 μ M的兩性霉素 B 處理細(xì)胞，2h后分別加入MOI :0. 08的EV71進(jìn)行感染。293細(xì)胞加入0、0. 2、0. 5、1、2、3μΜ 的兩性霉素 B處理細(xì)胞，2h后分別加入MOI :0. 5的EV71進(jìn)行感染。在培養(yǎng)箱中孵育Ih后 換成正常培養(yǎng)基培養(yǎng)相應(yīng)時間，收集上清，進(jìn)行病毒斑塊形成試驗。同時收集細(xì)胞，裂解后 進(jìn)行Western Blotting實驗，檢測細(xì)胞中病毒蛋白的表達(dá)情況。
[0031] 1.1病毒斑塊形成實驗
[0032] RD細(xì)胞（3X IO5)接種于12孔板中，待細(xì)胞平鋪90%以上時，將收集的病毒上清 10倍梯度稀釋，感染細(xì)胞Ih后，棄去病毒，覆蓋37°C預(yù)溫含1 %低熔點瓊脂糖的DMEM維持 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2-3天后，用4%多聚甲醛固定4h后，5%結(jié)晶紫染色15分鐘后用流水輕輕 沖去，計數(shù)斑塊形成個數(shù)。每次實驗每個樣品重復(fù)三次。采用概率單位回歸法計算的半數(shù) 抑制病毒濃度（Inhibitory concentration 50%，IC50)。
[0033] I. 2Western_Blotting 體系的建立
[0034] I. 2.1病毒蛋白的提取
[0035] 將空白對照組（細(xì)胞維持液）、陰性對照組（細(xì)胞維持液+DMS0+EV71)和兩性霉 素 B處理組（兩性霉素 B+細(xì)胞維持液+EV71)細(xì)胞于病毒感染后收集細(xì)胞，3000rpm離心 3min，PBS洗一次，加入100 μ L細(xì)胞裂解液RIPA，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] L 2. 2Western Blotting檢測病毒蛋白的表達(dá)
[0037] (1)首先制備12%的分離膠（41^30%丙烯酰胺溶液，2.51^1'1^/!〇?!18.8， IOOyL 10%SDS，100yL 10%過硫酸氨，5yL TEMED)，灌膠，液面頂端加入水，室溫下聚合 60min〇
[0038] (2)倒干凈上層水，再制備5%的積層膠（0. 5mL 30%丙烯酰胺溶液，0. 5mL TriS/ HCI pH6.8,40yL 10%SDS，50yL 10%過硫酸氨，5yL TEMED)，在積層膠上插入梳齒，室 溫下聚合50min。待膠完全凝聚后，小心拔下梳齒。
[0039] (3)EV71病毒感染RD或293細(xì)胞（空白對照組、DMSO藥物模擬組和藥物處理組） 收獲的裂解液各20 μ L，加入5X上樣緩沖液5 μ L，100°C煮10min。
[0040] (4)制備的電泳膠裝進(jìn)電泳槽，在內(nèi)槽加滿新鮮配制的電泳緩沖液（沒過制膠 板），將上步處理好的樣品取20 μ L緩緩加入積層膠梳齒孔中，再在電泳槽外槽內(nèi)加入適量 電泳緩沖液，進(jìn)行電泳：首先是40V，電泳40分鐘，觀察樣品被很好的壓縮成一條線，蛋白預(yù) 染Marker開始分離，說明樣品進(jìn)入分離膠，可調(diào)整電流為100V，繼續(xù)電泳2. 5h，觀察蛋白預(yù) 染Marker很好的分開，結(jié)束電泳。
[0041] (5)切掉多余膠塊，按照從負(fù)極到正極分別為濾紙、膠、硝酸纖維素膜（NC膜）、濾 紙的順序疊放在轉(zhuǎn)膜夾板中，放入轉(zhuǎn)膜裝置，加滿新配的轉(zhuǎn)膜液，冰上或4°C，插上電極進(jìn)行 轉(zhuǎn)膜，100V 60min，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。
[0042] (6)轉(zhuǎn)好的膜用5%脫脂奶粉封閉，水平搖床上25rpm，室溫孵育I h。
[0043] (7)將膜浸在含適當(dāng)稀釋抗體（EV71抗體1:1000稀釋、VPl抗體1:2000稀釋）的 5%脫脂奶粉中，水平搖床上25印111，4°0過夜。
[0044] (8) 50rpm水平搖床上，用TBST洗膜4次，5min/次。
[0045] (9)棄掉洗液，加入1:10000稀釋的IRDye熒光二抗，水平搖床上25rpm，室溫孵育 lh〇
[0046] (10)棄掉二抗，25rpm水平搖床上用TBST洗膜4次，5min/次。
[0047] (11)取出膜，利用LI-COR Odyssey儀器掃膜。
[0048] L 2. 3 病毒 RNA 提取
[0049] 收集的細(xì)胞樣品按QIAGEN RNeasy mini kit說明書提取RNA，然后將RNA溶于 DEPC處理水，用Nanodrop測定RNA含量。提取的RNA樣品-70 °C保存。
[0050] L 2. 4病毒RT-PCR體系的建立
[0051] 用Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體 操作步驟如下：
[0052] 引物設(shè)計根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的EV71病毒株的核苷酸全序列，依據(jù)引物設(shè)計 的基本原則，運用軟件Primer Premier 5. 0設(shè)計編碼病毒蛋白VP1/EV71基因序列的特異 性引物。如下。
[0053] 正義引物：5'-TAGATAGGGTGGCAGATGTAATTGAAAG-3'
[0054] 反義引物：5'-TAGCATTTGATGAT GCTCCAATTTCAG-3
[0055] PCR操作步驟（1)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的操作步驟如下：
[0056]
【主權(quán)項】
1. 一種抑制腸道病毒71的藥物，其特征在于，含有多烯類抗真菌抗生素。
2. 如權(quán)利要求1所述的藥物，其特征在于，所述多烯類抗真菌抗生素為兩性霉素 B或其 衍生物。
3. 如權(quán)利要求2所述的藥物，其特征在于，還含有藥學(xué)上可接受的輔料。
4. 由權(quán)利要求1-3任一所述的藥物與醫(yī)學(xué)上可接受的載體或賦形劑制成的藥物制劑。
5. 如權(quán)利要求4所述的制劑，其為片劑、膠囊劑、粉針劑、噴霧劑或顆粒劑。
6. 兩性霉素 B或其衍生物在制備抑制或治療腸道病毒71藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抑制腸道病毒71的藥物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)臨床上用于治療真菌感染的兩性霉素B具有抑制腸道病毒71的特性，通過藥物毒性試驗、藥物對病毒的抑制試驗、病毒斑塊形成試驗，發(fā)現(xiàn)兩性霉素B可明顯抑制EV71病毒在RD細(xì)胞和293細(xì)胞中的感染，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)兩性霉素B是通過影響EV71病毒的吸附起到抵抗該病毒感染的作用。本發(fā)明為腸道病毒71的預(yù)防和治療提供了新的藥物，具有較好的市場價值和臨床應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61K31-7048, A61P31-14
【公開號】CN104606215
【申請?zhí)枴緾N201410849159
【發(fā)明人】郭斐
【申請人】中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年12月31日