3為特異性針對IncRNA基因 L0C553103的RNA干擾序列（siRNA)可有效抑制 細胞中L0C553103的表達，
[0037] 我們設(shè)計了 3條特異性針對L0C553103的RNA干擾序列（siRNAl，siRNA2和 siRNA3,簡寫為Sl，S2和S3)轉(zhuǎn)染到EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F (左）、HNE2 (中）和胃癌 細胞AGS(右）中后實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)IncRNA基因 L0C553103的表達均顯著下調(diào)。
[0038] 圖14為在鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和胃癌細胞AGS中導入為特異性針對IncRNA基 因 L0C553103的RNA干擾序列（siRNA)后細胞的增殖能力降低，生長速度減慢。
[0039] 圖15為在鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和胃癌細胞AGS中導入特異性針對IncRNA基因 L0C553103的RNA干擾序列（siRNA)后細胞迀移能力降低，
[0040] 細胞劃痕實驗證實，在鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和胃癌細胞AGS中導入特異性針對 IncRNA基因 L0C553103的RNA干擾序列（siRNA)，人為抑制L0C553103的表達后，腫瘤細胞 從劃痕兩邊往劃痕中央迀移速度明顯減慢，劃痕愈合的時間延長，表明細胞運動迀移能力 降低，陰性對照（NC)為導入scramble序列。
[0041] 圖16為在鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和胃癌細胞AGS中導入特異性針對IncRNA基因 L0C553103的RNA干擾序列（siRNA)序列后細胞的侵襲能力降低，
[0042] 細胞穿膜（transwell)實驗證實，在鼻咽癌細胞5-8F、HNE2和胃癌細胞AGS中導 入特異性針對IncRNA基因 L0C553103的RNA干擾序列（siRNA)序列，人為抑制L0C553103 的表達后，能穿過基質(zhì)膠膜的腫瘤細胞數(shù)目顯著減少，表明細胞侵襲能力降低，陰性對照 (NC)為導入scramble序列。
[0043] 圖17為裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移成瘤實驗進一步證實在EBV陰性的鼻咽癌細胞 5-8F中導入BART6-3p或特異性針對IncRNA基因 L0C553103的RNA干擾序列（siRNA)均可 以抑制腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
[0044] 在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F中導入BART6-3p或特異性針對IncRNA基因 L0C553103的RNA干擾序列（siLOC)，人為過表達BART6-3p或抑制L0C553103的表達后，將 處理過的細胞經(jīng)尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，隨后繼續(xù)飼養(yǎng)40天，最后處死裸鼠，觀察各組裸 鼠肺臟中的轉(zhuǎn)移瘤形成的情況，箭頭所示為轉(zhuǎn)移瘤。轉(zhuǎn)染BART6-3p或特異性針對IncRNA 基因 L0C553103的RNA干擾序列的兩組裸鼠肺組織中的轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目明顯少于陰性對照組， 進一步證實了過表達BART6-3p或抑制L0C553103的表達均可以抑制腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移。
[0045] 圖18為裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移成瘤實驗結(jié)果統(tǒng)計。
[0046] 圖19為裸鼠皮下成瘤實驗進一步證實在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F中導入 BART6-3p或特異性針對IncRNA基因 L0C553103的RNA干擾序列（siRNA)均可以抑制腫瘤 細胞的生長、增殖，
[0047] 在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F中導入BART6-3p或特異性針對IncRNA基因 L0C553103的RNA干擾序列（siLOC)，人為過表達BART6-3p或抑制L0C553103的表達后，將 處理過的細胞注射到裸鼠皮下，隨后繼續(xù)飼養(yǎng)30天，最后處死裸鼠，觀察各組裸鼠皮下移 植瘤的大小。轉(zhuǎn)染BART6-3p或特異性針對IncRNA基因 L0C553103的RNA干擾序列的兩組 裸鼠皮下移植瘤明顯比陰性對照組小，進一步證實了過表達BART6-3p或抑制L0C553103的 表達均可以抑制腫瘤細胞的生長與增殖。
[0048] 圖20為裸鼠皮下移植瘤實驗結(jié)果統(tǒng)計；
[0049] 在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F中導入BART6-3p或特異性針對IncRNA基因 L0C553103的RNA干擾序列（siLOC)，人為過表達BART6-3p或抑制L0C553103的表達后，將 處理過的細胞注射到裸鼠皮下，隨后繼續(xù)飼養(yǎng)30天，每5天測量皮下移植瘤的大小，統(tǒng)計結(jié) 果表明過表達BART6-3p或抑制L0C553103的表達均可以抑制腫瘤細胞的生長與增殖。
[0050] 圖21為BART6-3p可影響腫瘤細胞中細胞骨架結(jié)構(gòu)，
[0051] 在EBV陰性的鼻咽癌細胞5-8F中導入BART6-3p人為過表達BART6-3p后，特 異性標記細胞骨架（F-actin)，通過細胞免疫熒光實驗，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)過表達 BART6-3p后細胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變，表明BART6-3p的過表達影響了腫瘤細胞中 微管微絲的組裝。（DAPI為細胞核特異性染料）
[0052] 圖22為干擾IncRNA基因 L0C553103的表達可影響腫瘤細胞中細胞骨架結(jié)構(gòu)，
[0053] 在鼻咽癌細胞5-8F中導入特異性針對IncRNA基因 L0C553103的RNA干擾序列 (siRNA)人為降低L0C553103的表達后，特異性標記細胞骨架（F-actin)，通過細胞免疫 熒光實驗，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)干擾L0C553103表達后細胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改 變，表明L0C553103調(diào)控腫瘤細胞中微管微絲的組裝。（DAPI為細胞核特異性染料）
[0054] 圖23為實時熒光定量PCR技術(shù)檢測L0C553103在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中的表 達情況；
[0055] L0C553103在鼻咽癌（NPC)中的表達比正常鼻咽上皮（N)中顯著降低（P〈0. 001)， 且與BART6-3p的表達呈負相關(guān)。
[0056] 圖24為實時熒光定量PCR技術(shù)檢測L0C553103在胃癌和癌旁正常對照組織中的 表達情況；
[0057] L0C553103在胃癌（T)中的表達比癌旁對照組織（N)中顯著降低（P〈0. 001)。
[0058] 圖25為原位雜交檢測L0C553103在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達情況；
[0059] 左邊為一例鼻咽癌癌旁對照組織標本，L0C553103在癌旁上皮組織中高表達；右 邊為一例鼻咽癌組織標本，L0C553103在鼻咽癌組織中基本檢測不到，L0C553103在鼻咽癌 組織中的表達與BART6-3p顯著的呈負相關(guān)。
[0060] 圖26為L0C553103的表達與鼻咽癌患者預后的關(guān)系
[0061] L0C553103的表達與鼻咽癌患者的預后密切相關(guān)，與BART6-3p剛好相反，即 L0C553103高表達（High)的患者生存時間要明顯短于L0C553103低表達（Low)的患者 (Ρ〈0· 05) 〇
[0062] 圖27為原位雜交檢測L0C553103在胃癌及癌旁對照組織中的表達情況；
[0063] 左邊為一例胃癌癌旁對照組織標本，L0C553103在癌旁組織中高表達；右邊為一 例胃癌組織標本，L0C553103在鼻咽癌組織中表達較低。
[0064] 圖28為L0C553103的表達與胃癌患者預后的關(guān)系
[0065] L0C553103的表達與胃癌患者的預后密切相關(guān)，與BART6-3p剛好相反，即 L0C553103高表達（High)的患者生存時間要明顯短于L0C553103低表達（Low)的患者 (Ρ〈0· 05) 〇
【具體實施方式】
[0066] 以下結(jié)合【具體實施方式】進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0067] 實施例1，實時熒光定量PCR法檢測證實BART6-3p在鼻咽癌中表達上調(diào)
[0068] 1.材料與方法：
[0069] 收集5例正常鼻咽上皮組織和18例鼻咽癌組織，用Trizol (invitrogen公司產(chǎn) 品）抽提總RNA，2 μ g RNA用miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen公司產(chǎn)品）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，用QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒（Qiagen公司產(chǎn)品）進行實時熒光定量PCR檢 測BART6_3p及內(nèi)參基因 RNU6B的表達。microRNA的公用引物（Universal Primer)及 BART6-3p和RNU6B的特異性引物均由Qiagen公司設(shè)計并合成。
[0070] 實時熒光定量PCR反應體系
[0071] 2 < QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10 μ! l〇x miScript Universal Primer 2 μL l〇\ miScript Primer Assay 2 μL 無酶水 _4 μ:1 模板 cDNA 2 μL
[0072] 實時熒光定量PCR反應步驟
[0073] 1 94 C 5 min 2 9S V- W mQ 3 58? 30 see
[0074] 4 72'C 20 see 5 Plate read 6 82 "C 30 see 7 Plate read 8 Go to sicp 2 for more 39 iimes 9 Perform nicking curve from 55.0'C to 95.0 C, read every 0.2 C s hold for 1 sec
[0075] 反應結(jié)束后確認實時熒光定量PCR的擴增曲線和熔解曲線，各基因的表達強度根 據(jù) CT值（threshold cycle values)、內(nèi)參基因（RNU6B)標化后，采用group t-test 檢驗計 算P值。
[0076] 2.結(jié)果
[0077] BART6-3p在正常對照組織中不表達或者表達很低，而在鼻咽癌組織中高表達 Ρ〈0· 001(圖 1)
[0078] 實施例2,原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)BART6-3p在鼻咽癌和胃癌中的表達與患者預后相關(guān)
[0079] 1.材料方法
[0080] 1. 1設(shè)計并合成雜交探針
[0081] 為了采用原位雜交方法檢測BART6-3P的表達情況，我們設(shè)計了針對原位雜交檢 測BART6-3p表達的寡核苷酸探針及陽性對照原位雜交寡核苷酸探針。
[0082] BART6-3p 探針：UCUAAGGCUAGUCCGAUCCCCG
[0083] 陽性對照探針（檢測看家基因 GAPDH):
[0084] GAPDH 探針：CAGUAGAGGCAGGGAUGAUGUUCU
[0085] 采用化學合成方法合成上述設(shè)計的各基因特異性寡核苷酸探針序列，合成過程中 探針序列中尿嘧啶已標記生物素（bio-U)。
[0086] 1. 2寡核苷酸探針標記試劑盒和原位雜交檢測試劑
[0087] 地高辛寡核苷酸加尾試劑（Dig Oligonucleitide Tailing Kit 2nd Generation， Roche公司），抗地高辛-辣根過氧化物酶復合物檢測試劑盒（Anti-Digoxigenin-POD， Fab fragments，Roche公司），增強原位表達檢測信號的TSA信號放大系統(tǒng)（TSA? Biotin System，NEL700試劑盒，PerkinElmer公司），DAB染色試劑盒（北京中山公司），20x梓檬 酸鈉緩沖溶液（saline sodium citrate, SSC)，硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)，去離子 甲酰胺（Deionized Formamide)，多聚腺苷酸（polyadenylic acid，Poly A)，多聚脫氧腺 苷酸（polydeoxyadenylic acid，Poly dA)，變性剪切的娃精 DNA(denatured and sheared salmon sperm DNA，ssDNA)，酵母轉(zhuǎn)運