br>[0227] 在5-8F細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BART6-3p的方法同實(shí)施例3 ;
[0228] 在5-8F細(xì)胞中轉(zhuǎn)染特異性針對(duì)L0C553103的RNA干擾序列以抑制細(xì)胞內(nèi) L0C553103表達(dá)的方法同實(shí)施例5。
[0229] 1. 2裸鼠"尾靜脈注射-肺轉(zhuǎn)移"模型檢測(cè)BART6-3p和L0C553103的RNA干擾序 列對(duì)鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用
[0230] 4周齡雄性裸鼠購(gòu)自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分3組，每組10只，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 轉(zhuǎn)染了 BART6-3p或RNA干擾序列以及Scramble序列（作為陰性對(duì)照，NC)的5-8F細(xì)胞 (如前一步所述），經(jīng)胰酶消化后，在室溫（15~25°C )下，lOOOrpm，離心分鐘，棄去上清， 1X PBS洗滌2次，然后重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取3. 5 X 106細(xì)胞/只，經(jīng)尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)。 繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)40天，處死裸鼠，觀察裸鼠肺臟中轉(zhuǎn)移瘤的大小和分布情況。
[0231] 1. 3裸鼠皮下移植瘤模型檢測(cè)BART6-3p和L0C553103的RNA干擾序列對(duì)鼻咽癌細(xì) 胞增殖能力的抑制作用
[0232] 4周齡雄性裸鼠購(gòu)自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分3組，每組4只，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 轉(zhuǎn)染了 BART6-3p或RNA干擾序列以及Scramble序列（作為陰性對(duì)照，NC)的5-8F細(xì)胞 (如前一步所述），經(jīng)胰酶消化后，在室溫（15~25°C )下，lOOOrpm，離心分鐘，棄去上清， 1 X PBS洗滌2次，然后重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取3. 5 X 106細(xì)胞/只，接種于裸鼠右側(cè)腋部皮下。 每天按時(shí)觀察接種腫瘤細(xì)胞后裸鼠的一般情況和精神狀態(tài)，稱體重，記錄移植瘤形成的時(shí) 間及大小。用游標(biāo)卡尺測(cè)移植瘤長(zhǎng)（length, L)、寬（width，W)和高（height, H)，計(jì)算腫瘤 體積（V)，V = 4 3i/3*(L/2*W/2*H/2)。根據(jù)腫瘤大小繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。35天后處死裸 鼠，取出移植瘤組織用10%的甲醛固定。
[0233] 2.結(jié)果
[0234] 2. 1裸鼠"尾靜脈注射-肺轉(zhuǎn)移"模型進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染BART6-3p或特異性針對(duì) L0C553103的RNA干擾序列后，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力降低
[0235] 在鼻咽癌細(xì)胞5-8F中轉(zhuǎn)染BART6-3p或特異性針對(duì)L0C553103的RNA干擾序 列后，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照（Scramble序列，NC)相比，在裸鼠"尾靜脈注射-肺轉(zhuǎn)移"模型中 BART6-3p以及L0C553103兩組裸鼠肺臟中轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目明顯減少（圖17和圖18)，表明過(guò) 表達(dá)BART6-3p或抑制L0C553103的表達(dá)確實(shí)可以抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
[0236] 2. 2裸鼠皮下移植瘤模型進(jìn)一步證實(shí)轉(zhuǎn)染BART6-3p或特異性針對(duì)L0C553103的 RNA干擾序列后腫瘤細(xì)胞增殖速度減慢
[0237] 在鼻咽癌細(xì)胞5-8F中轉(zhuǎn)染BART6-3p或特異性針對(duì)L0C553103的RNA干擾序列 后，與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照（Scramble序列，NC)相比，BART6-3p以及L0C553103兩組裸鼠皮下移 植瘤的生長(zhǎng)增殖速度明顯減慢（圖19,圖20)。
[0238] 實(shí)施例7,表達(dá)BART6-3p或用RNA干擾法抑制腫瘤細(xì)胞中L0C553103的表達(dá)可以 改變腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞骨架的完整性
[0239] 1.材料方法
[0240] 1. 1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0241] 鼻咽癌細(xì)胞系5-8F購(gòu)自中南大學(xué)細(xì)胞中心，細(xì)胞培養(yǎng)所用RPMI 1640培基和胎牛 血清，及消化細(xì)胞所用的胰蛋白酶均為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品。
[0242] 在5-8F細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BART6-3p的方法同實(shí)施例3 ;
[0243] 在5-8F細(xì)胞中轉(zhuǎn)染特異性針對(duì)L0C553103的RNA干擾序列以抑制細(xì)胞內(nèi) L0C553103表達(dá)的方法同實(shí)施例5。
[0244] 1. 2免疫熒光實(shí)驗(yàn)
[0245] 1)細(xì)胞接種：將消毒好的蓋玻片（75%消毒酒精浸泡2小時(shí)，并在紫外照射1小 時(shí)）置于六孔板的孔內(nèi)，將過(guò)表達(dá)BART6-3p或轉(zhuǎn)染特異性針對(duì)L0C553103的RNA干擾序列 的5-8F細(xì)胞以及陰性對(duì)照細(xì)胞（轉(zhuǎn)染Scramble序列）分別加到六孔板中的蓋玻片上，后 置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)；取出細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C預(yù)熱的PBS溫和地?fù)u洗3次；自然風(fēng) 干；
[0246] 2) 37 °C預(yù)熱的4 %多聚甲醛在37 °C固定15min，預(yù)熱的PBS溫和搖洗3次，每次 5min ；
[0247] 3)將 FITC-phalloidin (購(gòu)自 Sigma 公司，用于標(biāo)記 F-actin) 1:500 稀釋，37°C孵 育50min，預(yù)熱的PBS洗三次；
[0248] 4) DAPI染色5min，預(yù)熱的PBS清洗3次；
[0249] 5)清水洗3次去掉PBS，晾干封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。
[0250] 2.結(jié)果
[0251] 免疫熒光結(jié)果顯示FITC標(biāo)記的F-actin (細(xì)胞骨架）呈綠色，分布在胞漿內(nèi)，DAPI 標(biāo)記的核酸呈藍(lán)色，分布在細(xì)胞核內(nèi)。對(duì)照組細(xì)胞形狀規(guī)則，細(xì)胞骨架清晰明亮，含量豐富， 呈纖維放射狀沿細(xì)胞長(zhǎng)軸排列，應(yīng)力纖維層次清晰，胞核被染成深藍(lán)色；BART6-3p組（圖 21)及L0C553103干擾組（圖22)細(xì)胞骨架解聚，細(xì)胞微絲變短，排列稀疏，應(yīng)力纖維數(shù)目明 顯減少變細(xì)，細(xì)胞核暗淡無(wú)光，細(xì)胞皺縮變圓，細(xì)胞核暗淡無(wú)光，細(xì)胞間的橋梁狀骨架連接 纖維減少或消失，提示過(guò)表達(dá)BART6-3p或干擾L0C553103的表達(dá)后細(xì)胞骨架組裝受到了明 顯抑制，并影響了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及侵襲轉(zhuǎn)移能力。
[0252] 實(shí)施例8,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)證實(shí)L0C553103在鼻咽癌和胃癌中表達(dá)下調(diào)
[0253] 1.材料與方法：
[0254] 收集5例正常鼻咽上皮組織和18例鼻咽癌組織以及18對(duì)胃癌組織及相應(yīng)的癌旁 對(duì)照組織用Trizol (invitrogen公司產(chǎn)品）抽提總RNA，2 μ g RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen 公司產(chǎn)品）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒（Qiagen公司產(chǎn)品） 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)L0C553103及內(nèi)參基因 GAPDH的表達(dá)。PCR引物及擴(kuò)增方法同 實(shí)施例4。
[0255] 反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，各基因的表達(dá)強(qiáng)度根 據(jù) CT值（threshold cycle values)、內(nèi)參基因（GAPDH)標(biāo)化后，采用group t-test 檢驗(yàn)計(jì) 算P值。
[0256] 2.結(jié)果
[0257] L0C553103在正常鼻咽上皮（圖23)或胃癌癌旁對(duì)照組織中表達(dá)較高（圖24)，而 在鼻咽癌組織（圖23)或胃癌組織（圖24)中表達(dá)較低。
[0258] 實(shí)施例9,原位雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)L0C553103在鼻咽癌和胃癌中的表達(dá)與患者預(yù)后相 關(guān)
[0259] 1.材料方法
[0260] 1. 1設(shè)計(jì)并合成雜交探針
[0261] 為了采用原位雜交方法檢測(cè)L0C553103的表達(dá)情況，我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)原位雜交檢 測(cè)L0C553103表達(dá)的寡核苷酸探針及陽(yáng)性對(duì)照（GAPDH)原位雜交寡核苷酸探針。
[0262] L0C553103 探針序列-1 :5' -CAGAAAAUAAAGUCACAGAGCUCCUGGAAC-3'
[0263] L0C553103 探針序列-2 :5' -ACUGUUUCCUCUCUGCCUUGAUUGAAAUUC-3'
[0264] L0C553103 探針序列-3 :5, -ACACUUUGAAAUUUUUGUCACCUCCCUUGA-3'
[0265] 陽(yáng)性對(duì)照探針（檢測(cè)看家基因 GAPDH):
[0266] GAPDH 探針序列-1 :5' -CCACUUUACCAGAGUUAAAAGCAGCCCUGG-3，
[0267] GAPDH 探針序列-2 :5' -CAGUAGAGGCAGGGAUGAUGUUCUGGAGAG-3，
[0268] GAPDH 探針序列-3 :5' -GUCAGAGGAGACCACCUGGUGCUCAGUGUA-3，
[0269] 采用化學(xué)合成方法合成上述設(shè)計(jì)的各基因特異性寡核苷酸探針序列，合成過(guò)程中 探針序列中尿嘧啶已標(biāo)記生物素（bio-U)。
[0270] 1. 2寡核苷酸探針標(biāo)記試劑盒和原位雜交檢測(cè)方法、結(jié)果判定及統(tǒng)計(jì)方法等同實(shí) 施例2
[0271] 2 結(jié)果
[0272] 2. 1 L0C553103在鼻咽癌中的表達(dá)比癌旁對(duì)照組織中的表達(dá)顯著降低
[0273] 在40 例癌旁鼻咽上皮（Adjacent Epithelial of NPC)中有 36 例 L0C553103 的表 達(dá)較高（圖25左），而在115例鼻咽癌（NPC)中57例L0C553103的表達(dá)較低（圖25右） Ρ〈0· 001。L0C553103的表達(dá)與BART6-3p呈顯著負(fù)相關(guān)。
[0274] 2. 2 L0C553103表達(dá)高的鼻咽癌患者預(yù)后較差
[0275] 我們對(duì)鼻咽癌組織中L0C553103的表達(dá)與病人的生存時(shí)間和狀態(tài)進(jìn)行的生存 分析，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌中L0C553103的表達(dá)與鼻咽癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，L0C553103低表達(dá) (Low)的患者生存時(shí)間要明顯長(zhǎng)于L0C553103高表達(dá)（high)的患者（圖26, Ρ = 0· 03)。
[0276] 2. 3 L0C553103在胃癌中的表達(dá)比癌旁對(duì)照組織中的表達(dá)顯著降低
[0277] 在37例胃癌組織中29例檢測(cè)到有L0C553103的低表達(dá)（圖27右），其余8例為 高表達(dá)，而在這些胃癌樣本對(duì)應(yīng)的癌旁組織中有35例L0C553103的表達(dá)較高（圖27左）， P〈0.05。
[0278] 2. 4 L0C553103高表達(dá)的胃癌患者預(yù)后較差
[0279] 我們對(duì)胃癌組織中L0C553103的表達(dá)與病人的生存時(shí)間和狀態(tài)進(jìn)行的生存分析， 發(fā)現(xiàn)胃癌中L0C553103的表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，L0C553103高表達(dá)（High)的患 者生存時(shí)間要明顯短于L0C553103低表達(dá)（Low)的患者（圖28, Ρ〈0· 05)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. EB病毒編碼的microRNABART6-3P在制備鼻咽癌細(xì)胞抑制劑上的應(yīng)用，其特征在 于，microRNABART6-3p用于制備抑制鼻咽癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和預(yù)防腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移 的制劑；microRNABART6-3p的序列：CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，microRNABART6-3p用于制備抑制鼻咽癌 細(xì)胞骨架組裝和重構(gòu)的制劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了EB病毒編碼的microRNA？BART6-3p在制備鼻咽癌細(xì)胞抑制劑上的應(yīng)用。microRNA？BART6-3p用于制備抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和預(yù)防腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的制劑；microRNA？BART6-3p的序列：CGGGGAUCGGACUAGCCUUAGA。進(jìn)一步用于制備抑制鼻咽癌細(xì)胞骨架組裝和重構(gòu)的制劑。本發(fā)明為鼻咽癌的輔助治療提供了強(qiáng)有力的分子生物學(xué)工具，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和重要的推廣應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61K31/7088, A61K48/00, A61P35/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105288656
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510725540
【發(fā)明人】曾朝陽(yáng), 何寶玉, 李桂源, 熊煒, 李小玲, 李夏雨, 張文玲, 石磊, 向波, 龔朝建, 陳攀, 廖前進(jìn)
【申請(qǐng)人】中南大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年10月30日