單純皰疹病毒i型ul5基因缺失的dna疫苗的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種單純皰疹病毒I型UL5基因缺失的 DNA疫苗的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 單純痕疼病毒(Herpes simplex virus，HSV)，屬于痕疼病毒科(Herpesviridae family)，a痕疼病毒亞科(Alpha herpesvirinae familyXHSV病毒為雙鏈DNA病毒，從 外到內(nèi)含有囊膜、皮層、衣殼及基因組等四種病毒結(jié)構(gòu)。HSV-1是單純皰疹病毒的一種，主 要引起喉、口、眼、臉及神經(jīng)系統(tǒng)的感染，可引起皰疹性腦炎，唇皰疹等多種疾病。有調(diào)查結(jié) 果顯示，90%以上的人一生中均會(huì)受到皰疹病毒的感染，單純皰疹病毒感染已成為世界上第 四大的傳染性疾病。
[0003] HSV病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖是一個(gè)有序的復(fù)雜過(guò)程，按先后順序HSV病毒的胞內(nèi)增殖 過(guò)程大致可以分為以下幾個(gè)階段：1)病毒吸附于宿主細(xì)胞膜的表面;2)病毒穿過(guò)細(xì)胞膜;3) 病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)；4)病毒基因的表達(dá);5)基因組DNA的復(fù)制;6)病毒核衣殼的組裝； 7)病毒顆粒的形成;8)子代病毒的釋放。HSV病毒在細(xì)胞內(nèi)基因組DNA的復(fù)制是病毒產(chǎn)生致 病性的必須過(guò)程，若缺少該過(guò)程，將不能組裝成完整的病毒顆粒，從而嚴(yán)重減低對(duì)機(jī)體的致 病性。
[0004] 病毒減毒活疫苗是最為經(jīng)典的疫苗形式，傳統(tǒng)的減毒活疫苗主要是通過(guò)連續(xù)培養(yǎng) 篩選得到的，但這種方法耗時(shí)費(fèi)力，用這種方法很難得到致病性降低的單純皰疹病毒毒株。 中國(guó)專利申請(qǐng)201010253601.5公開了單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗及其制備方 法，該減毒活疫苗敲除了單純皰疹病毒I型基因組中的見43、此44、1^45、1^46和1^47基因。 該減毒活疫苗是敲除了其基因組中的復(fù)制或感染非必需基因片段，能夠誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng) 答系統(tǒng)，及時(shí)清除感染的病毒，抑制感染的進(jìn)一步發(fā)展，但其制備方法有諸多不足之處：（1) 選取擬敲除基因序列上下游700bp至2000bp的同源側(cè)翼序列和熒光蛋白基因組成同源 重組框，由于目的片段太長(zhǎng)使PCR擴(kuò)增困難；（2)選擇pShuttle-CMV載體，同源重組框整合到 擬敲除基因的正確位置效率偏低，成功機(jī)率不大；（3)用熒光蛋白基因代替擬敲除病毒基因 用于篩選鑒定，雖然此方法快速、簡(jiǎn)便，但最終未能將熒光蛋白基因去除，構(gòu)建的減毒活疫 苗仍表達(dá)該蛋白。
[0005] 因此，現(xiàn)有技術(shù)存在減毒活疫苗的制備方法復(fù)雜、成功效率偏低等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006 ]為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種單純皰疹病毒I型UL5基因缺失的 DNA疫苗的制備方法，通過(guò)該方法可以制備得到減毒活疫苗，具有疫苗安全有效、不易發(fā)生 毒力回復(fù)等優(yōu)點(diǎn)，可有效防治HSV-1的感染。
[0007]本發(fā)明提供一種單純皰疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制備方法，包括如下 步驟： S1單純皰疹病毒I型UL5基因的同源重組敲除，得到不含UL5基因和外源基因的重組菌 株，所述同源重組敲除的重組敲除系統(tǒng)為包含BAC-HSV-1載體和pREDI重組質(zhì)粒的宿主菌； S2 BAC載體的切除及HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗的獲得。
[0008] 優(yōu)選地，所述步驟S1包括如下步驟： SI. 1 pREDI重組質(zhì)粒的構(gòu)建:設(shè)計(jì)啟動(dòng)子PrhaB的PCR擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增得到PrhaB片 段;設(shè)計(jì)I-Scel的PCR擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增得到I-SecI片段;將所述PrhaB片段和所述I-SecI 片段通過(guò)重組PCR連接，得到PrhaB-1-SecI片段;將所述PrhaB-1-SecI片段和pKD46 A-red recombinase載體連接，獲得pREDI重組質(zhì)粒； S1.2重組敲除系統(tǒng)的構(gòu)建:將所述pREDI重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含BAC-HSV-1載體的宿主菌中， 得到同源重組敲除的重組敲除系統(tǒng)； S1.3 UL5基因同源重組片段的PCR擴(kuò)增：以所述重組敲除系統(tǒng)的Kam-SacB全片段為 模板，以 CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGAITTAITCAACAAAGCCA (SEQ ID N0.1) 為上游引物，以 GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC(SEQ ID NO . 2 )為下游引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得UL5C-Kam-SacB-B片段，再以該片段為模板， GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC(SEQ ID NO ? 3)為上游引物，以GGCCGAGGCCTTITTAAATITTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGC AAGAATGGCGC(SEQ ID NO. 4)為下游引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得UL5A-C-Kam-SacB-B片段，即UL5 基因同源重組片段； S1.4攜帶正反選擇標(biāo)記基因的重組菌株的篩選:將所述UL5基因同源重組片段電轉(zhuǎn) 化至所述重組敲除系統(tǒng)中，通過(guò)正向篩選標(biāo)記基因Kam進(jìn)行重組細(xì)菌的篩選;對(duì)轉(zhuǎn)化獲得 的單克隆進(jìn)行PCR鑒定，確定篩選的重組菌株UL5基因的成功去除及正反標(biāo)記基因的正確 插入； S1.5去除正反選擇標(biāo)記基因的重組菌株的鑒定：鼠李糖誘導(dǎo)I-Scel內(nèi)切酶合成，切除 Kam-SacB片段，發(fā)生第二次同源重組，得到不含UL5基因和外源基因的重組菌株。
[0009] 本發(fā)明中重組敲除系統(tǒng)的構(gòu)建與中國(guó)專利申請(qǐng)CN104894046中HSV-1病毒體外基 因敲除系統(tǒng)的構(gòu)建方案相同，在此將中國(guó)專利申請(qǐng)CN104894046的相關(guān)內(nèi)容引入本發(fā)明中。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟S2包括如下步驟： S2.1將所述不含UL5基因和外源基因的重組菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行質(zhì)粒抽提，獲得 BAC-17.37 AUL5質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化至Ver〇-pCDNA3.1-UL5-Cre細(xì)胞，使用含G418的培養(yǎng)基進(jìn)行培 養(yǎng)，通過(guò)藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)挑選白斑，反復(fù)凍融，離心取上清得到HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗； S2.2將S2.1得到的HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗感染Ver〇-pCDNA3.1-UL5細(xì)胞，再 通 過(guò)藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)挑取白斑，反復(fù)凍融，離心取上清，得到純化后的HSV-1 UL5基因缺失的 DNA 疫苗。
[0011] 優(yōu)選地，所述質(zhì)粒抽提采用BAC大量抽提試劑盒進(jìn)行;所述含G418的培養(yǎng)基包括 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1~4%體積百分含量的胎牛血清和0.5~2 ug/ml的G418。
[0012] 優(yōu)選地，所述Ver〇-pCDNA3.卜UL5-Cre細(xì)胞的制備包括如下步驟： A) 以BAC-17.37穿梭質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增UL5基因，將該基因片段用BamHI和 BstXI限制性內(nèi)切酶酶切后亞克隆到p⑶NA3.1 (+)質(zhì)粒，得到p⑶NA3.1-UL5質(zhì)粒； B) 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄P1噬菌體的RNA，擴(kuò)增得到Cre基因片段，將所述p⑶NA3.1-UL5質(zhì)粒和Cre 基因片段經(jīng)BamHI酶切后用T4連接酶進(jìn)行連接，挑選單克隆進(jìn)行Cre基因和UL18基因的PCR 鑒定和測(cè)序，得到真核表達(dá)P⑶NA3.1-UL5-CRE質(zhì)粒； C) 將所述PCDNA3.1-UL5-CRE質(zhì)粒利用lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞內(nèi)，使用G418溶 液進(jìn)行篩選，得到Ver〇-pCDNA3.1-UL5-CRE細(xì)胞。
[0013] 優(yōu)選地，所述Vero_pCDNA3.1-UL5細(xì)胞的制備包括如下步驟： A) 以BAC-17.37穿梭質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增UL5基因，將該基因片段用BamHI和 BstXI限制性內(nèi)切酶酶切后亞克隆到p⑶NA3.1 (+)質(zhì)粒，得到p⑶NA3.1-UL5質(zhì)粒； B) 將所述PCDNA3.1-UL5質(zhì)粒利用lip〇2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞內(nèi)，使用G418溶液進(jìn) 行篩選，得到Ver〇-pCDNA3 ? 1-UL5細(xì)胞。
[0014] 優(yōu)選地，所述UL5基因的擴(kuò)增引物包括:上游引物:AATTGGATCCGAGCGTGGTGCG
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果包括： (1)本發(fā)明提供的制備方法簡(jiǎn)單、高效，制得的HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗不易發(fā) 生毒力回復(fù)，其病毒度滴度和感染能力明顯減弱，保留了較高的免疫原性，進(jìn)入機(jī)體后僅能 刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答而無(wú)致病作用，安全有效。
[0016] (2)本發(fā)明提供的HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗的制備方法合理、簡(jiǎn)單、高效， BAC載體上的red基因表達(dá)能夠提高同源重組效率，鼠李糖誘導(dǎo)的I -See I內(nèi)切酶合成使基因 組發(fā)生第二次同源重組，切除外源性抗性基因和SacB基因，在敲除目的基因的同時(shí)未引入 外源基因，可控性強(qiáng)。
[0017] (3)構(gòu)建的Ver〇-pCDNA3.1-UL18-CRE細(xì)胞可以在切割去掉BAC質(zhì)粒的同時(shí)，還可以 提供基因缺失病毒株生長(zhǎng)所需的VP23蛋白，使得HSV-1 UL18基因缺失減活疫苗得到順利的 純化篩選，提高了純化效率。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1 Cre基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證電泳圖；其中，M指DNA marker，1指Cre基因目標(biāo) 條帶。
[0019]圖2 UL5基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證電泳圖；其中，M指DNA marker，l指陽(yáng)性對(duì)照，2指 UL5基因目標(biāo)條帶。
[0020]圖3去除正反選擇標(biāo)記基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物驗(yàn)證電泳圖；其中A指UL5基因的驗(yàn)證 電泳圖，B指Kam片段的驗(yàn)證電泳圖，C指SacB片段的驗(yàn)證電泳圖，M指DNA marker，P指陽(yáng)性對(duì) 照，N指陰性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0022]實(shí)施例1 UL5基因表達(dá)載體的真核細(xì)胞株的構(gòu)建 以BAC-17.37穿梭質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物（SEQ ID N0.5、SEQ ID ^).6)擴(kuò)增此5基因 (2696bp)，將該基因片段用BamHI和BstXI限制性內(nèi)切酶酶切后亞克隆到pCDNA3.1( + )質(zhì)粒 (購(gòu)自優(yōu)寶生物公司，貨號(hào)VT1001)，得到pCDNA3 ? 1-UL5質(zhì)粒； 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄P1噬菌體的RNA，擴(kuò)增得到Cre基因片段，將所述p⑶NA3.1-UL5質(zhì)粒和Cre基 因片段經(jīng)BamHI酶切后用T4連接酶進(jìn)行連接，挑選單克隆進(jìn)行Cre基因和UL5基因的PCR鑒定 和測(cè)序，結(jié)果如圖1和圖2所示，得到真核表達(dá)p⑶NA3.1-UL5-CRE質(zhì)粒； 將所述PCDNA3.1-UL5-CRE質(zhì)粒利用lipo2000脂質(zhì)體（購(gòu)自invitrogen，貨號(hào)為11668-019 )轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)ATCC公司）內(nèi)，使用lmg/ml濃度的G418溶液(購(gòu)自東巨化 工公司）進(jìn)行篩選，得到Ver〇-pCDNA3.1-UL5-CRE細(xì)胞。
[0023] 將所述pCDNA3.1-UL5質(zhì)粒利用lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞內(nèi)，使用lmg/ml濃 度的G418溶液進(jìn)行篩選，得到Ver〇-pCDNA3.1-UL5細(xì)胞。
[0024] 實(shí)施例2 HSV-1 UL5基因的同源重組敲除 2.1 pREDI重組質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計(jì)啟動(dòng)子PrhaB的PCR擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增得到PrhaB片段(2. Okb);設(shè)計(jì)I-Scel的PCR 擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增得到I-SecI片段(0.7 kb);將所述PrhaB片段和所述I-SecI片段通過(guò)重 組PCR連接，得到PrhaB-1-SecI片段；將所述PrhaB-1-SecI片段和pKD46 A-red recombinase載體連接，獲得pREDI重組質(zhì)粒。pREDI重組質(zhì)粒具有由L-阿拉伯糖誘導(dǎo)啟動(dòng) 的入-red recombinase，以及由鼠李糖誘導(dǎo)啟動(dòng)的I-SecI內(nèi)切酶基因。
[0025] 2.2重組敲除系統(tǒng)的構(gòu)建 將構(gòu)建的pREDI重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含BAC-HSV-1載體的宿主菌中，宿主菌為EPI300E.Coli， 得到同源重組敲除的重組敲除系統(tǒng)。
[0026] 2.3 UL5基因同源重組片段的PCR擴(kuò)增 以重組敲除系統(tǒng)的K a m - S