專利名稱：腸毒素c2全基因及其克隆和異源表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腸毒素C2基因克隆和蛋白表達(dá)，具體說(shuō)是金黃色葡萄球菌腸毒素C2(SEC2)全基因及其制備和異源表達(dá)。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)是一類細(xì)菌超抗原，它們無(wú)需抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APCs)的加工，也不受組織相容性復(fù)合體(MHC)的限制，在APC之外與T細(xì)胞受體Vβ鏈形成MHCII-SE-TCRVβ復(fù)合物，在1-10ng/ml濃度時(shí)，即能刺激大部分有TCRVβ序列的T細(xì)胞增殖，使之釋放多種細(xì)胞因子，產(chǎn)生極強(qiáng)的免疫應(yīng)答效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，SEs可對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生超抗原依賴的細(xì)胞毒作用(Sag-dependent cell-mediated T-cell-derived cytotoxicity，SDCC)，從而產(chǎn)生系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)。目前對(duì)腸毒素的克隆表達(dá)研究多集中于SEA和SEB，而對(duì)于有三個(gè)亞型的SEC族研究較少。三者的成熟蛋白氨基酸序列高度同源，SEC1和SEC3的基因序列已有報(bào)導(dǎo)，而SEC2的基因序列尚不清楚，SEC2的抗腫瘤作用已經(jīng)應(yīng)用于臨床，并取得很好療效。克隆并測(cè)定SEC2的全基因序列對(duì)研究C型腸毒素三亞型之間的關(guān)系和提高SEC2的腫瘤臨床治療效果具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種編碼金黃色葡萄球菌腸毒素C2(SEC2)成熟蛋白的全基因及其制備和異源表達(dá)，利用本發(fā)明可使SEC2產(chǎn)量較原始生產(chǎn)菌株大大提高(約提高106倍)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下腸毒素C2全基因，具有序列表SEQ ID NO1中堿基序列。
腸毒素C2全基因的克隆方法以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-F5’-GAATTCGAG AGT CAA CCA GAC CCT A-3’sec2-R5’-CTCGAGTTA TCC ATT CTT TGT TGT A-3’通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出SEC2基因片段。
腸毒素C2全基因的異源表達(dá)方法將腸毒素C2全基因亞克隆至表達(dá)載體pET-28a中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建成異源表達(dá)SEC2蛋白的基因工程菌，在LB培養(yǎng)基中異源表達(dá)具有生物學(xué)活性的SEC2蛋白。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明為人工構(gòu)建的SEC2基因，首次獲知基因全序列的組成。
2.本發(fā)明以SEC1和SEC3基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)PCR引物，利用PCR技術(shù)，克隆SEC2全基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)的SEC2經(jīng)檢驗(yàn)具有野生型的生物學(xué)活性；應(yīng)用本發(fā)明，可提供直接用于生產(chǎn)SEC2蛋白的基因工程菌株。
3.本發(fā)明基因的異源表達(dá)提供了制備超抗原抗腫瘤生物制劑的一種新方法，具有產(chǎn)量高，生產(chǎn)穩(wěn)定，方便純化的特點(diǎn)。


圖1為SEC2基因sec2的PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖，其中1為sec2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2為DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖2為pET-28a-sec2的雙酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖，其中1為DL15,000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2、3為pET-28a-sec2的雙酶切結(jié)果，4為DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖3為SEC2的大腸桿菌異源表達(dá)SDS-PAGE電泳圖，其中1為誘導(dǎo)的pET28a空載體，2為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(由上至下分別為116，66，45，35，25，18，14KD)，3為誘導(dǎo)的SEC2的可溶性表達(dá)，4為誘導(dǎo)的SEC2的包涵體表達(dá)；圖4為表達(dá)的SEC2蛋白的蛋白免疫印記檢測(cè)圖，其中1為SEC2蛋白的蛋白免疫印記檢測(cè)結(jié)果，2為預(yù)染的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1SEC2全基因的制備，具有SEQ ID NO1所示的序列001 G A G A G T C A A C C A G A C C C T A C G C C A G A T G A G T T G C A C A A A T C A A G T G A G T T051 T A C T G G T A C G A T G G G T A A T A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A T C A T T A T G T A T101 C A G C A A C T A A A G T T A T G T C T G T A G A T A A A T T T T T G G C A C A T G A T T T A A T T151 T A T A A C A T T A G T G A T A A A A A A C T A A A A A A T T A T G A C A A A G T G A A A A C A G A201 G T T A T T A A A T G A A G A T T T A G C A A A G A A G T A C A A A G A T G A A G T A G T T G A T G251 T G T A T G G A T C A A A T T A C T A T G T A A A C T G C T A T T T T T C A T C C A A A G A T A A T301 G T A G G T A A A G T T A C A G G T G G T A A A A C T T G T A T G T A T G G A G G A A T A A C A A A351 A C A T G A A G G A A A C C A C T T T G A T A A T G G G A A C T T A C A A A A T G T A C T T A T A A401 G A G T T T A T G A A A A T A A A A G A A A C A C A A T T T C T T T T G A A G T G C A A A C T G A T451 A A G A A A A G T G T A A C A G C T C A A G A A C T A G A C A T A A A A G C T A G G A A T T T T T T501 A A T T A A T A A A A A A A A T T T G T A T G A G T T T A A C A G T T C A C C A T A T G A A A C A G551 G A T A T A T A A A A T T T A T T G A A A A T A A C G G C A A T A C T T T T T G G T A T G A T A T G601 A T G C C T G C A C C A G G C G A T A A G T T T G A C C A A T C T A A A T A T T T A A T G A T G T A651 C A A C G A C A A T A A A A C G G T T G A T T C T A A A A G T G T G A A G A T A G A A G T C C A C C701 T T A C A A C A A A G A A T G G A T A A(1)SEQ ID NO.1的信息(參見序列表)(a)序列特征*長(zhǎng)度720堿基對(duì)*類型核酸*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型；cDNA(c)假設(shè)否
(d)反義否(e)最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(2)SEC2全基因sec2的PCR擴(kuò)增1)金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取接種金黃色葡萄球菌單菌落于5ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，取1.5ml的培養(yǎng)物離心收集菌體。提取金黃色葡萄球菌基因組DNA(基因組DNA提取操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》美國(guó)紐約John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)。
2)PCR引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件根據(jù)基因sec1和sec3的DNA序列，設(shè)計(jì)一組引物正向引物sec2-F5’-GAATTCGAG AGT CAA CCA GAC CCT A-3’反向引物sec2-R5’-CTCGAGTTA TCC ATT CTT TGT TGT A-3’PCR反應(yīng)體系為10×Pyrobest buffer 5μl、dNTP 250μmol、0.02％BSA 2μl、上下游引物各25pmol、模板金黃色葡萄球菌基因組DNA 0.1μg、ExTaq DNA聚合酶2U，無(wú)菌超純水補(bǔ)齊體積至50μl。
PCR反應(yīng)條件為第一階段95℃，5分鐘；第二階段94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，45秒；共30個(gè)循環(huán)；第三階段72℃，10分鐘；3)SEC2基因的鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析并分離(參見附圖1所示)，切下大小約為717bp的目的帶，按杭州維特潔生化技術(shù)有限公司膠回收試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行膠回收；回收產(chǎn)物與pGEM-T克隆載體連接，構(gòu)建成SEC2基因克隆載體pGEM-T-sec2，連接反應(yīng)按Promega公司產(chǎn)品pGEM-T試劑盒使用說(shuō)明書。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，(轉(zhuǎn)化操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》美國(guó)紐約John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)，篩選陽(yáng)性克隆并以Sanger雙脫氧末端終止法測(cè)定DNA序列。
實(shí)施例2SEC2蛋白的表達(dá)1)SEC2蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建將pGEM-T-sec2質(zhì)粒DNA以EcoRI、XhoI雙酶切，膠回收試劑盒回收sec2片段。以T4DNA連接酶連接入經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a表達(dá)載體，構(gòu)建成表達(dá)載體pET-28a-sec2，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoRI、XhoI雙酶切鑒定正確重組克隆(參見附圖2所示)。
2)SEC2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)接種轉(zhuǎn)化了pET-28a-sec2質(zhì)粒的BL21(DE3)單菌落于含40μg/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜活化培養(yǎng)，以1％接種量轉(zhuǎn)接下一級(jí)，37℃搖床培養(yǎng)至OD600為0.6，加入終濃度1.0mmol/L的IPTG，30℃誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)。離心收集菌體，以5×上樣緩沖液處理(緩沖液配方和處理方法按汪家政，范明《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》科學(xué)出版社2002第一版P81和P87)，12％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色分析表達(dá)產(chǎn)物(參見附圖3所示)。
實(shí)施例3SEC2蛋白的生物學(xué)活性以蛋白免疫印記法鑒定表達(dá)的SEC2蛋白的免疫原性將異源表達(dá)的SEC2蛋白以SDS-PAGE分離，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，2％脫脂牛奶封閉，以兔抗SEC2抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔抗體依次處理，NBT/BCIP顯色試劑盒顯色(參見附圖4所示)。(所用緩沖液和具體操作方法按汪家政，范明《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)》科學(xué)出版社2002第一版P166)。
腸毒素SEQUENCE LISTING<110>沈陽(yáng)協(xié)合集團(tuán)有限公司<120>腸毒素C2全基因及其克隆和異源表達(dá)方法<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>720<212>DNA<213>Staphylococcus aureus<220>
<221>CDS<222>(1)..(717)<223>
<400>1gag agt caa cca gac cct acg cca gat gag ttg cac aaa tca agt gag 48Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu1 5 10 15ttt act ggt acg atg ggt aat atg aaa tat tta tat gat gat cat tat 96Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr20 25 30gta tca gca act aaa gtt atg tct gta gat aaa ttt ttg gca cat gat 144Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp35 40 45tta att tat aac att agt gat aaa aaa cta aaa aat tat gac aaa gtg 192Leu Ile Tyr Asn Ile Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val50 55 60aaa aca gag tta tta aat gaa gat tta gca aag aag tac aaa gat gaa 240Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu65 70 75 80gta gtt gat gtg tat gga tca aat tac tat gta aac tgc tat ttt tca 288Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser85 90 95tcc aaa gat aat gta ggt aaa gtt aca ggt ggt aaa act tgt atg tat 336Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr100 105 110gga gga ata aca aaa cat gaa gga aac cac ttt gat aat ggg aac tta 384Gly Gly Ile Thr Lys His Glu Gly Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu115 120 125caa aat gta ctt ata aga gtt tat gaa aat aaa aga aac aca att tct 432
腸毒素Gln Asn Val Leu Ile Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr Ile Ser130 135 140ttt gaa gtg caa act gat aag aaa agt gta aca gct caa gaa cta gac480Phe Glu Val Gln Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp145 150 155 160ata aaa gct agg aat ttt tta att aat aaa aaa aat ttg tat gag ttt528Ile Lys Ala Arg Asn Phe Leu Ile Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe165 170 175aac agt tca cca tat gaa aca gga tat ata aaa ttt att gaa aat aac576Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn Asn180 185 190ggc aat act ttt tgg tat gat atg atg cct gca cea ggc gat aag ttt624Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe195 200 205gac caa tct aaa tat tta atg atg tac aac gac aat aaa acg gtt gat672Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp210 215 220tct aaa agt gtg aag ata gaa gtc cac ctt acaaca aag aat gga taa720Ser Lys Ser Val Lys Ile Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly225 230 235<210>2<211>239<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>2Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu1 5 10 15Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr20 25 30Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp35 40 45Leu Ile Tyr Asn Ile Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val50 55 60Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu65 70 75 80Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser85 90 95Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr100 105 110Gly Gly Ile Thr Lys His Glu Gly Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu115 120 125Gln Asn Val Leu Ile Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr Ile Ser130 135 140Phe Glu Val Gln Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp145 150 155 160
腸毒素Ile Lys Ala Arg Asn Phe Leu Ile Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe165 170 175Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn Asn180 185 190Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe195 200 205Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp210 215 220Ser Lys Ser Val Lys Ile Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly225 230 23權(quán)利要求
1.腸毒素C2全基因，其特征在于具有序列表SEQ ID NO1中堿基序列。
2.一種權(quán)利要求1所述腸毒素C2全基因的克隆方法，其特征在于以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-F5’GAATTCGAG AGT CAA CCA GAC CCT A-3’sec2-R5’CTCGAGTTA TCC ATT CTT TGT TGT A-3’通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出SEC2基因片段。
3.一種權(quán)利要求1所述腸毒素C2全基因的異源表達(dá)方法，其特征在于腸毒素C2全基因以pET-28a為表達(dá)載體，以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌，構(gòu)建成異源表達(dá)SEC2蛋白的基因工程菌，在培養(yǎng)基中異源表達(dá)有活性的SEC2蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因重組和蛋白表達(dá)技術(shù)，具體地說(shuō)是腸毒素C2全基因及其克隆和異源表達(dá)方法，腸毒素C2具有序列表SEQ ID NO1中堿基序列。本發(fā)明以SEC1和SEC3基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)PCR引物，利用PCR技術(shù)，克隆SEC2全基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)的SEC2經(jīng)檢驗(yàn)具有野生型的生物學(xué)活性。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1896241SQ20051004684
公開日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2005年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月11日
發(fā)明者陳巨余, 徐明愷, 張成剛 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)協(xié)合集團(tuán)有限公司