專利名稱：：一種二苯乙烯苷提取物的制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種從植物中提取有效成分的方法，尤其涉及一種從何首烏中提取二苯乙烯苷的方法，屬于中藥領域。
背景技術：
：何首烏，為寥科植物何首烏PolygonummultiflorumThunb的干燥塊根。根據其炮制方法不同又有生首烏與制首烏之分。生首烏味苦、澀、性平，具有潤腸、解毒、截瘧之功效，用于腸燥便秘，癰疽瘰疬等癥。制首烏味苦、甘、澀、性溫，具有補肝腎、益精血、壯筋骨、烏須發(fā)之效，主要用于肝腎精血虧虛、頭昏目眩、須發(fā)早白、腰膝酸軟及遺精等癥，歷代《本草》有記載。成分主要有羥基蒽醌類化合物和糖苷類化合物，如二苯乙烯苷等，還有一些酰胺類化合物、色原酮類化合物以及卵磷脂等，糖苷類化合物含量最多的是二苯乙烯苷類化合物。何首烏有抗衰老、神經保護、抗炎免疫、促進生長發(fā)育等作用。本發(fā)明人多年來以研究治療神經退行性病變?yōu)橹饕芯糠较?，特別是從祖國傳統(tǒng)中醫(yī)中藥中篩選治療老年癡呆的新藥，經過對大量中藥的篩選，發(fā)現何首烏有較好的作用。進一步分析研究，發(fā)現了四羥基二苯乙烯苷(TSG)提取物在P-淀粉樣蛋白(AP)致神經細胞損傷模型上具有明顯的神經保護作用；在體外試驗中TSG可明顯抑制p-分泌酶的活性；在A(3前體蛋白APP轉基因小鼠、AP腦室注射模型、膽堿能神經元損傷大鼠模型、D-半乳糖小鼠模型和慢性腦缺血大鼠模型等擬癡呆動物模型上，TSG可明顯提高學習記憶功能，減少腦內淀粉樣斑塊和Ap的形成，降低P-分泌酶和，分泌酶含量，增高腦組織M受體親和力，增強膽堿乙烯轉移酶(ChAT)活性，抑制脂質過氧化和細胞漿內鈣超載，提高總抗氧化能力，增加谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性，增強海馬神經生長因子(NGF)、神經營養(yǎng)因子-3(NT-3)和NGF的受體TrkA的表達?，F有二苯乙烯苷提取物的制備方法技術，采用水提取或者乙醇提取，濃縮，用硅膠柱層析，得率低，時間長，成本高，用本發(fā)明可以克服以上缺點。
發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種新的二苯乙烯苷(二苯乙烯武，全名為2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-p-D-葡萄糖甙)提取物的方法，該方法所制備的二苯乙烯苷提取物中，二苯乙烯苷的含量大于55%。本發(fā)明所要解決的技術問題是通過以下技術途徑來實現的一種二苯乙烯苷的制備方法，該方法包括以下步驟(1)何首烏加乙醇，加熱回流，提取液濾過，濾液回收乙醇并濃縮至無醇味，得濃縮液或浸膏；(2)向濃縮液或浸膏中加水，攪勻，靜置，濾過，濾液加乙酸乙酯萃取，合并萃取液；(3)將合并后的萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，干燥，粉碎，得到二苯乙烯苷。為了提取到更高含量的二苯乙烯苷，一種優(yōu)選的二苯乙烯苷制備方法，包括以下步驟(1)將何首烏加6_12倍重量的40-95%乙醇，加熱回流提取1-5次，每次1-4小時，將回流提取液合并后濾過，濾液回收乙醇后，濃縮至無醇味，得濃縮液；(2)向濃縮液或浸膏中加水，攪勻，靜置，濾過，濾液加乙酸乙酯萃取，合并萃取液；(3)將合并后的萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，干燥，粉碎，得到二苯乙烯苷。一種較優(yōu)選的二苯乙烯苷制備方法是(1)將何首烏加6-12倍重量的40-90%乙醇，加熱回流提取1-5次，每次1-4小時，將回流提取液合并后濾過，濾液回收乙醇后，濃縮至無醇味，得濃縮液；(2)將濃縮液加水，攪勻，靜置4-12小時，濾過，濾液加乙酸乙酯萃取2-4次，合并萃取液；(3)將合并后的萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，60-9(TC溫度下減壓干燥,粉碎成細粉，得到二苯乙烯苷。一種進一步優(yōu)選的二苯乙烯苷制備方法是(1)將何首烏加8倍重量60%乙醇，加熱回流提取3次，每次2小時，將回流提取液合并后濾過，濾液回收乙醇后，濃縮至相對密度為1.248(34°C)的浸膏；(2)向浸膏中加水，攪勻，靜置6小時，濾過，濾液加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；(3)將合并后的萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，8(TC溫度下減壓干燥，粉碎成細粉，得到二苯乙烯苷。一種更優(yōu)選的二苯乙烯苷制備方法，包括以下步驟(1)將何首烏加8倍重量60%乙醇，加熱回流提取3次，每次2小時，將回流提取液合并后濾過，濾液回收乙醇后，濃縮至相對密度為1.248(34°C)的浸膏；(2)向浸膏中加水，使水的體積為浸膏體積的4-6倍攪勻，靜置6小時，濾過，濾液加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；(3)將合并后的萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，減壓干燥(80°C)，粉碎成細粉，得到二苯乙烯苷。一種最優(yōu)選的二苯乙烯苷制備方法，包括以下步驟(1)將何首烏加8倍重量60%乙醇，加熱回流提取3次，每次2小時，將回流提取液合并后濾過，濾液回收乙醇后，濃縮至相對密度為1.248(34°C)的浸膏；(2)向浸膏中加水，使水的體積為浸膏體積的4-6倍攪勻，靜置6小時，濾過，濾液加1.5倍重量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液；(3)將合并后的萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，減壓干燥(80°C)，粉碎成細粉，得到二苯乙烯苷。本發(fā)明進行了一系列的正交試驗，最終摸索到了一種從何首烏中提取高含量的二苯乙烯苷的方法，使提取到的二苯乙烯苷的含量超過55%，符合《藥品注冊管理辦法》中藥、天然藥物5類新藥的規(guī)定。本發(fā)明得率高，用時少，成本低。具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。應當指出，這些實施例僅僅是本發(fā)明的例證，不應理解為對本發(fā)明的限制。說明1、本發(fā)明中所述的術語"二苯乙烯苷"與術語"2，3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷"二者等同。2、2，3,5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷(TSG)的含量測定方法避光操作，采用高效液相法(參照《中華人民共和國藥典》2000版一部附錄VID)。①儀器與試藥儀器美國AgilentllOO型高效液相色譜儀，聯想數字處理中心試藥2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷標準品(供含量測定用，由中國藥品生物制品檢定所提供，批號0844-9802，)。乙腈為色譜純(美國Fisher)，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。②色譜條件色譜柱YWG-C18(4.6mmX250mm,10um)反相柱，流動相乙腈沐(25:75)，檢測波長320腿，流速1.0ml/min，柱溫25。C[2]。③工作曲線制作精密稱取2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷對照品2.31mg，置10ml量瓶中，稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為0.231mg/ml的對照品溶液。每次分別吸取6、8、10、12、14pl注入液相色譜儀，按上述條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，2，3,5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷進樣量為橫坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程為Y=3523.7X-104.31，r=0.99992，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷在1.3863.234i!g范圍內呈線性關系。實施例1取何首烏20g，加6倍重量的95%乙醇，加熱回流提取1次，提取液濾過，濾液回收乙醇并濃縮至無醇味，加水，攪勻，靜置4-12小時，濾過，濾液加乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，減壓干燥，粉碎成細粉，得到二苯乙烯苷7.1g，經測定，二苯乙烯苷含量大于55%，提取率3.55%。實施例2取何首烏20g，加12倍重量的40%乙醇，加熱回流提取5次，每次1小時，合并提取液，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至無醇味，加水，攪勻，靜置4-12小時，濾過，濾液加乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，干燥，粉碎成細粉，得到二苯乙烯苷7.2§，經測定，二苯乙烯苷含量大于55%，提取率3.6%。實施例3取何首烏20g，加8倍重量體積60%乙醇，加熱冋流提取3次，每次2小時，合并提取液，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至無醇味，加水，攪勻，靜置6小時，濾過，濾液加乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，減壓干燥(60-90°C)，粉碎成細粉，得到二苯乙烯苷7.25g，經測定，二苯乙烯苷含量大于55%，提取率3.62%。實施例4取何首烏20g，加8倍量60%乙醇，加熱回流提取3次，每次2小時，合并提取液，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至相對密度為1.248(34°C)的浸膏，加入水，攪勻，靜置6小時，濾過，濾液加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，減壓干燥(80°C)，粉碎成細粉，得到二苯乙烯苷7.35g，經測定，二苯乙烯苷含量大于55%，提取率3.675%。實施例5取何首烏20g，加8倍量60%乙醇，加熱回流提取3次，每次2小時，合并提取液，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至相對密度為1.248(34°C)的浸膏，加入水使水的體積為浸膏體積的4倍，攪勻，靜置6小時，濾過，濾液加乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，減壓干燥(80°C)，粉碎成細粉，得到二苯乙烯苷7.4g，經測定，二苯乙烯苷含量大于55%，提取率3.7%。實施例6取何首烏20g，加8倍量60%乙醇，加熱回流提取3次，每次2小時，合并提取液，濾過，濾液回收乙醇并濃縮至相對密度為1.248G4。C)的浸膏，加入水使水的體積為浸膏體積的6倍，攪勻，靜置6小時，濾過，濾液加1.5倍重量乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，減壓干燥(8CTC)，粉碎成細粉，得到二苯乙烯苷7.6g，經測定，二苯乙烯苷含量大于55%，提取率3.8%。對比試驗例1何首烏塊根中含有二苯乙烯類化合物，被認為是何首烏的主要成分之-，其中有2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷等。2,3，5,4'-四羥基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷能溶于水和醇，本試驗分別將生何首烏進行了水提和醇提，以考察二者的優(yōu)劣。具體方法如下①水煎法稱取生何首烏150g，加入4倍水煎煮3次，每次2小時，濾過，合并濾液，濃縮至50ml，再加6倍量水攪勻，離心去沉淀，上清液用醋酸乙酯萃取3次，每次醋酸乙酯用量同上清液體積，合并萃取液，減壓回收，濃縮并減壓干燥，得干浸膏備用。②乙醇回流稱取生何首烏150g，以60%乙醇回流提取3次，每次2小時，加醇量為藥材量的4倍。濾過，合并濾液，回收乙醇至無醇味，濃縮至50ml，再加6倍量水攪勻，離心去沉淀，上清液用醋酸乙酯萃取3次，每次醋酸乙酯用量同上清液體積，合并萃取液，減壓回收，濃縮并減壓干燥，得干浸膏備用。③供試品溶液的制備精密稱取一定量的上述各樣品，置于10ml容量瓶中，加稀乙醇超聲處理5分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45iim微孔濾膜過濾進樣。按前述2,3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-3-D-葡萄糖苷的含測方法，測定2個樣品中2，3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷的含量。由表1可知，乙醇回流法所提取的2，3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷(TSG)的含量明顯要高于水煎煮法。表1不同提取方法提取四羥基二苯乙烯苷(TSG)數據表〈table>Complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>試驗例1本發(fā)明最佳提取工藝考察試驗1、何首烏的最佳提取條件考察試驗稱取生何首烏50g藥材，共9份，按表2的因素水平，表3的提取條件分別進行正交試驗(其中提取時間固定為2小時)，提取后濾液合并，量取體積，從中取出lml濾液至10ml容量瓶中，加入稀乙醇至刻度，搖勻。按上述方法測定2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷的含量。并對結果進行方差分析，結果見表4。表2K素水平表<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注以D因素為誤差項表3提取正交實驗表<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4正交試驗方差分析表<table>complextableseeoriginaldocumentpage１０</column></row><table>*:F0.10(2,2)=9.00**:F,(2，2)=19.00方差分析結果表明以提取出2，3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-0-13-D-葡萄糖苷的量為指標，因素A、C有差異但均無顯著性差異，B因素無差異，因此從正交表中應選A,B3C3，C因素是提取次數，C2、(:3相差2.8%，考慮到工業(yè)生產熱能消耗問題，應選擇A!B3C2。故本發(fā)明確定生何首烏的提取條件為用60%的乙醇，8倍量，共提取3次。取50g生何首烏藥材，分別用8倍量的50%、60%、70%乙醇熱回流提取3次，每次2h，濾過，合并濾液，并量取體積，從中精密量取lml至10ml容量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45"m微孔濾膜濾過，按前述方法測定2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷的含量。并對結果進行分析。由表5可知，以60%乙醇提取2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷(TSG)的含量和轉移率最高，故進一步證實了采用乙醇提取何首烏時，乙醇的濃度為60%時，提取效果最好。表5不同醇濃度提取四羥基二苯乙烯苷(TSG)數據表<table>complextableseeoriginaldocumentpage1０</column></row><table>2、加熱回流的最佳提取時間的工藝考察試驗分別取50g生何首烏藥材，每次用8倍量的60%乙醇加熱回流提取3次，一份提取時間分別為2h、lh、lh，另一份提取時間分別為2h、2h、lh，濾過，合并濾液，并量取體積，從中精密量取lml至10ml容量瓶中，用稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45um微孔濾膜過濾，按上述方法測定2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷的含量。并對結果進行分析，結果見表6.由表6可知，每次提取2h提出的2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖苷(TSG)的含量比前兩次提取2h，第三次提取lh的高出6.59Q/。，故最佳提取時間應為每次2h。表6不同提取時間提取四羥基二苯乙烯苷(TSG)數據表<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3、最佳純化工藝考察試驗為了進一步提高有效成分的含量和純度，需將生何首烏的醇提物水沉后離心去沉淀，上清液再用醋酸乙酯萃取。取405g何首烏藥材，按上述最佳提取方法提取，將提取液合并，回收乙醇，濃縮到相當于生藥材l:3(ml/g)，即135ml，平均分成9份，按表7的因素水平進行正交試驗，萃取后分別合并萃取液，量取體積，從中精密量取lml濾液至10ml容量瓶中，將濾液放在水浴中蒸干，用稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。按上述方法測定2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-e-D-葡萄糖銜TSG)的含量。并對結果進行方差分析，結果見表8、9。表7因素水平表<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注以D因素為誤差項表8水沉萃取正交實驗含量測定表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表9正交試驗含量測定方差分析表<table>complextableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*:F0.10(2,2)=9.00**:F,(2,2)=19.00由表9可知，因素A〉OB，因素B、C無差異，因素A有差異，但無顯著性差異，因此綜合考慮后，最優(yōu)選的純化條件為稠浸膏加46倍的水(Wv)稀釋，離心，上清液用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯的用量每次不少于藥液的1.5倍。權利要求1、一種二苯乙烯苷的制備方法，包括以下步驟(1)向何首烏中加入乙醇，加熱回流，提取液濾過，濾液回收乙醇并濃縮至無醇味，得濃縮液或浸膏；(2)向濃縮液或浸膏中加水，攪勻，靜置，濾過，濾液加乙酸乙酯萃取，萃取液備用；(3)將萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，干燥，粉碎，得到二苯乙烯苷。2、按照權利要求1的制備方法，其特征是步驟(1)中將何首烏加6-12倍重量的40-95%乙醇，加熱回流提取l-5次，每次l-4小時。3、按照權利要求2的制備方法，其特征是步驟(1)中將何首烏加8倍重量的60%乙醇，加熱回流提取3次，每次2小時。4、按照權利要求1的制備方法，其特征是步驟(2)向濃縮液或浸膏中加水，攪勻，靜置4-12小時，濾過，濾液加乙酸乙酯萃取2-4次。5、按照權利要求1的制備方法，其特征是步驟(1)中將何首烏加8倍重量60%乙醇，加熱回流提取3次，每次提取2小時，將回流提取液合并后濾過，濾液回收乙醇后，濃縮至34。C測定時相對密度為1.248的浸膏。6、按照權利要求1的制備方法，其特征是步驟(1)中將何首烏加8倍重量60%乙醇，加熱回流提取3次，每次2小時，將回流提取液合并后濾過，濾液回收乙醇后，濃縮至34。C測定時相對密度為1.248的浸膏；步驟(2)中向浸膏加水時，使水的體積為浸膏體積的4-6倍，攪勻，靜置4-12小時，濾過，濾液加1.5倍重量乙酸乙酯萃取2-4次。7、按照權利要求1的制備方法，其特征是步驟(3)中將稠膏于60-9(TC溫度下減壓干燥。8、按照權利要求7的制備方法，其特征是將稠膏于8(TC溫度下減壓干燥。全文摘要本發(fā)明公開了一種新的二苯乙烯苷的制備方法，該方法包括以下步驟(1)何首烏加乙醇，加熱回流，提取液濾過，濾液回收乙醇并濃縮至無醇味，得濃縮液或浸膏；(2)向濃縮液或浸膏中加水，攪勻，靜置，濾過，濾液用乙酸乙酯萃??；(3)將萃取液回收乙酸乙酯并濃縮至稠膏，干燥，粉碎，得到二苯乙烯苷。本發(fā)明提取方法所制備的提取物中，二苯乙烯苷的含量大于55％。本發(fā)明方法具有收率高、產品質量好、步驟簡捷等優(yōu)點。文檔編號C07H15/18GK101195646SQ20061016486公開日2008年6月11日申請日期2006年12月7日優(yōu)先權日2006年12月7日發(fā)明者林李,文王,艾厚喜,魏海峰申請人:首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院