專利名稱：：抗微生物導(dǎo)管素肽的制作方法抗微生物導(dǎo)管素肽相關(guān)申請的交叉引用這個(gè)申請要求于2005年12月29日提交的美國臨時(shí)申請系列no.60/754,878的權(quán)益，其披露的內(nèi)容以引用方式結(jié)合于此。關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明關(guān)于這個(gè)申請的工作得到美國政府的資金支持(N.I.H.批準(zhǔn)號(hào)P20RR016475和P20RR017686)。因此政府在本發(fā)明中可以擁有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
：抗微生物劑是治療人類感染的關(guān)鍵藥物。抗微生物劑還廣泛用于牲畜、魚和植物生產(chǎn)。在動(dòng)物中，抗微生物劑用于治療感染和預(yù)防性地用于疾病預(yù)防。此外，亞治療劑量(subtherapeuticdoses)的抗樣￡生物劑用作生長促進(jìn)劑?？刮⑸飫┑倪@樣的廣泛應(yīng)用的結(jié)果是有抗性的病原體的流行增加，導(dǎo)致人類和動(dòng)物的治療失敗。因此，存在開發(fā)新型和有效的抗微生物劑的需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了純化的導(dǎo)管素(cathdicidm)多肽、其片段、其變體或所述變體的片段，具有針對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌、以及酵母和原生動(dòng)物(下文中的"微生物(microbe)"或"微生物(microorganism)，，)的廣泛的抗微生物活性。因此，所述純化的多肽、其變體、或其片段、或編碼其中任何一個(gè)的分離的核酸分子，可以用于抑制或防止微生物的生長。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述純化的多肽、其變體、或其片段、或編碼其中任何一個(gè)的分離的核酸分子，可以用于治療或預(yù)防疾病，如食物-傳播(borne)的疾病或性傳纟番疾病，如通過7Wc/zom朋oy和/或iVez^en"屬的成員。如下文所述，本發(fā)明的多肽、變體或片段的抗微生物活性可以是不依賴鹽的。此外，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽、變體或片段還具有最小的溶血活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了純化多肽，包括SEQIDNO:4、具有至少15%,如至少20%、30%、40%、50%、70%或更多，如80%、或90%的與SEQIDNO:4的氨基酸序列同一性的SEQIDNO:4的變體、或者具有至少15個(gè)相鄰氨基酸的其片段，其中所述多肽、所述其變體或者所述其片段具有抗微生物活性。因此，本發(fā)明還提供了分離的核酸分子，以及表達(dá)載體，編碼本發(fā)明的抗微生物多肽、其變體或片段；包含這樣的核酸分子和/或表達(dá)載體的分離的細(xì)胞；包含本發(fā)明的核酸分子或多肽、變體或片段的組合物；以及包含本發(fā)明的核酸分子、或多肽、變體或片段的制造的制品。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)抗微生物多肽、其變體或片段的方法、以及利用編碼本發(fā)明的抗微生物多肽、其變體或片段的分離的核酸分子、或本發(fā)明的抗微生物多肽、其變體或片段減少或抑制微生物的生長的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包括具有至少70%,如80%、90%、95%或100%與SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、或其簡并變體(degeneratevariant)的核酸序列同一性的核苷酸序列。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，具有在高度嚴(yán)格的條件或中等嚴(yán)格的條件下雜交到具有下述核苷酸序列的雜交探針的核苷酸序列，所述核苷酸序列是SEQIDNO:3或長度為至少15個(gè)核苷酸，如至少IOO個(gè)核苷酸的其片段的編碼區(qū)的互補(bǔ)體。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，具有編碼多肽的核苷酸序列，所述多肽具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:4、或SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的片段，其長度為至少15個(gè)氨基酸并具有抗微生物活性。在一些實(shí)施方式中，SEQIDNO:2的片段為長度至少20、25、30、35、40、45、50或超過50個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，SEQIDNO:4的片段為長度至少20、25、30、超過30個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方式中，所述片段具有抗微生物活性、和/或它是免疫原性的、免疫調(diào)節(jié)性的、或既是免疫原性又是免疫調(diào)節(jié)性的。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含核酸分子的表達(dá)載體，所述核酸分子編碼本發(fā)明的多肽、其變體或片段。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的核酸分子的分離的細(xì)胞，如可操作地連接到表達(dá)控制序列的核酸分子。在一些實(shí)施方式中，分離的細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明的多肽、其變體或片段。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述多肽、其變體或片段從所述細(xì)胞或細(xì)胞的培養(yǎng)基純化。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了純化的多肽，其是生物活性的并且具有SEQIDNO:2的至少15,如20個(gè)連續(xù)殘基的氨基酸序列、至少15%與SEQIDNO:4相同；或者結(jié)合特異性結(jié)合到SEQIDNO:4的抗體。在一些實(shí)施方式中，所述多肽具有SEQIDNO:2或4。在一些實(shí)施方式中，所述多肽由SEQIDNO:2或4構(gòu)成。在一些實(shí)施方式中，所述多肽具有相對于SEQIDNO:4的1、2、3、4、5、或10、或更多，如20個(gè)保守氨基酸替換。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的多肽、變體或片段的組合物。在一些實(shí)施方式中，所述組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體或食品添加劑。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了減少或抑制微生物的生長或存活的方法。所述方法包括將微生物與本發(fā)明的多肽、變體、或片段、或具有所述多肽、變體、或片段的組合物或編碼所述多肽、變體、或片段的核酸分子接觸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了減少或抑制微生物在脊推動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、魚或鳥)中或在培養(yǎng)基(如水培養(yǎng)基或能夠支持微生物的生長或存活的包裝)中的生長或存活的方法。所述方法包括將脊推動(dòng)物或培養(yǎng)基與有效量的本發(fā)明的多肽、變體、或片段、或編碼所述多肽、變體、或片段的核酸分子接觸。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了治療食物-傳播的疾病或性傳播疾病，3口才每毒、衣原體病(chlamydia)、、淋病、滴蟲病、或我烏口瘙(thrush)的方法。所述方法包括給予脊推動(dòng)物有效量的本發(fā)明的多肽、變體、或片段、或編碼所述多肽、變體、或片段的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了利用有效量的本發(fā)明的多肽、變體、或片段減少食物物品(item)的微生物污染或提高易腐爛的食物的保存時(shí)間(shelflife)的方法。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了制造的制品(anarticleofmanufacture),其包括容器和本發(fā)明的多肽、變體、或片段、或編碼所述多肽、變體、或片段的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述制造的制品包括包裝材料和包含在所述包裝材料內(nèi)的本發(fā)明的多肽、變體或片段、或編碼所述多肽、變體或片段的核酸分子，其中所述包裝材料包括標(biāo)簽，其表明本發(fā)明的多肽、變體、或片段、或編碼所述多肽、變體或片段的核酸分子可以用于治療食物-傳纟番的疾病或性傳纟番疾病，如一每毒、衣原體病、、淋病、滴蟲病、或鵝口瘙。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了特異性結(jié)合到SEQIDNO:4的純化抗體。圖l.犬導(dǎo)管素(Catheliddin)的鑒定。(A)借助簡并引物，利用RT-PCR從狗、人、和豬骨髓擴(kuò)增的cDNA。人和豬樣品用作陽性對照。(B)犬導(dǎo)管素的全cDNA(SEQIDNO:l)和預(yù)測的肽序列(SEQIDNO:2)。cDNA序列中起始和終止密碼子凈皮加粗。編碼區(qū)為三耳關(guān)(triple)密碼子形式，非翻譯區(qū)為小寫字母。預(yù)測的信號(hào)肽(N-末端29個(gè)氨基酸)為斜體并通過箭頭示出。圖2.犬Cathelicidin的組織表達(dá)特征。利用基因特異性引物，在25mL反應(yīng)中利用400ng的總RNA進(jìn)行一步RT-PCR,用于40個(gè)循環(huán)。借助同樣的RNA樣品，擴(kuò)增甘油醛-3-石粦酸脫氫酶(GAPDH)的互補(bǔ)DNA片段。結(jié)果表示利用來自兩只狗的組織的具有類似模式的兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)-險(xiǎn)。圖3.來自不同物種的Cathelicidins的相似性比較。Cathelicidin結(jié)構(gòu)域加下劃線；導(dǎo)管素結(jié)構(gòu)域中保守的半胱氨酸殘基加外框。箭頭表示用于產(chǎn)生C-末端合成肽的預(yù)測位點(diǎn)。與犬導(dǎo)管素(K9CATH,SEQIDNO:2)的相似性和同一性的百分?jǐn)?shù)在序列后列出。相關(guān)序列的GenBank編號(hào)為人(Hs)LL-37,P49913(SEQIDNO:33);馬(Ec)CATHL2,CAA12227(SEQIDNO:34);牛(Bt)CATHL1,NP777250(SEQIDNO:35);牛CATHL7,NP777256(SEQIDNO:36);豬(Ss)PMAP37,P49932(SEQIDNO:37);以及豬PR-39,P80054(SEQIDNO:38)。圖4.犬Cathelicidin基因的機(jī)構(gòu)組織。K9CATH由三個(gè)內(nèi)含子分隔的四個(gè)外顯子構(gòu)成。示出了每個(gè)外顯子和內(nèi)含子的長度。還示出了由每個(gè)外顯子編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:43-46)。Cathelinpro-區(qū)中四個(gè)半胱氨酸加有下劃線，成熟肽序列也有下劃線并加粗。圖5.圓二色性分析-TFE(A)和SDS(B)對犬導(dǎo)管素的二級結(jié)構(gòu)的影響。注意在TFE或SDS的存在下，所述肽變得高度a-螺旋化。圖6.K9CATH的三維結(jié)構(gòu)排列和表面分析。最左側(cè)的欄描繪了連續(xù)剖面圖，示出了對于四個(gè)肽的a-螺旋(紫色)、以及巻曲(青色)二級結(jié)構(gòu)元件(不存在(3-片狀元件)。兩個(gè)最右側(cè)的欄描繪了肽溶劑可接近的表面的前視圖和后視圖。酸性(陰離子)殘基為紅色，堿性(陽離子)為藍(lán)色，疏水性的為黃色。圖7.氯化鈉對K9CATH的抗微生物活性的影響。肉湯微稀釋法被用于測定在各種鹽濃度中，針對細(xì)菌的兩個(gè)菌林革蘭氏陰性E.coli(ATCC25922)和革蘭氏陽性L.monocytogenes(ATCC19115)的cBD的MIC。殺菌混合物的最終鈉濃度用NaCl調(diào)節(jié)為15、30、50、140、及300mM。犬(3-防雄卩素(p-defensin),鹽敏感的抗樣i生物肽，用于對比。所有的實(shí)驗(yàn)一式三份進(jìn)行。圖8.通過犬Catheliddin的LPS的結(jié)合。通過利用定量顯色Limulusamoebocyte裂解產(chǎn)物(LALA)分牙斤"i式劑盒(chromogenicZj'mw/wsa柳oeZoqy/^lysate(LALA)assaykit)(QCL-1000i式劑盒，BioWhittaker,Walkersville,MD,USA)如前所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(47)。右板陽數(shù)據(jù)還在Hill圖上圖示，其示出了4.49的系數(shù)。數(shù)據(jù)表示來自兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的雙份值的平均數(shù)。圖9.犬Cathelicidin的溶血活性。如前所述利用雞紅血細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(49)。示出的數(shù)據(jù)表示來自兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)^r的雙份值的平均數(shù)。圖10.Cathelicidins的分子系統(tǒng)發(fā)育(MolecularPhylogeny)。在分支上示出Bootstrap值。僅顯示了拓樸學(xué)。注意K9CATH與所有其它哺乳動(dòng)物序列分離。MEGA版本3.1壽t件(ThePennsylvaniaStateUniversity,UniversityPark,PA)用于分析。圖11.K9CATH的抗寄生蟲作用。K9CATH的抗寄生蟲作用隨時(shí)間是穩(wěn)定的。在K9CATH濃度和寄生蟲游動(dòng)性(較低的游動(dòng)性表示較高的寄生蟲死亡率)之間存在逆向關(guān)系(inverserelationship),表明抗寄生蟲作用是濃度依賴性的。在100]LiMK9CATH時(shí)，測試的最高濃度，約80%的寄生蟲培養(yǎng)物被殺滅(在圖中示出20%的游動(dòng)寄生蟲)。具體實(shí)施例方式定乂這里所用的術(shù)語"核酸"指的是脫氧核糖核酸(deoxynucleicribosenucleicadds)、以及核糖核酸的聚合物。所述術(shù)語包括線型分子、以及共價(jià)閉合的環(huán)型分子。它包括單鏈分子、以及雙鏈分子。這里所用的關(guān)于核酸分子的術(shù)語"分離的(isolated)"意味著所述核酸分子不包含不相關(guān)的核酸序列，即，編碼其它基因的核酸序列，或者這樣的其它基因的表達(dá)中涉及的核酸序列，其在本發(fā)明的核酸來源的有機(jī)體的天然存在的基因組中的它的5，和3'端的側(cè)面。因此，本發(fā)明的"分離的核酸"具有的結(jié)構(gòu)不同于任何天然存在的核酸的結(jié)構(gòu)或者天然存在的基因組核酸的任何片段的結(jié)構(gòu)，跨越超過三個(gè)分開的基因。因此，術(shù)語"分離的核酸分子"包括，例如，(l)DNA分子，其具有天然存在的基因組DNA分子的部分的序列，^f旦是不以如下兩種編碼序列為側(cè)翼，所述編碼序列在它天然存在于其中的有機(jī)體的基因組中位于所述分子的那部分的側(cè)翼；(2)以這樣的方式并入載體中或原核生物或真核生物的基因組DNA中的核酸，以致所獲得的分子不同于任何天然存在的載體或基因組DNA;(3)獨(dú)立的分子如cDNA、基因組片段、通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段、或者限制性片段；(4)作為雜種基因(即，編碼融合蛋白的基因)的部分的重組核苦酸序列。從這個(gè)定義特別排除的是在(1)DNA分子、(2)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、以及(3)細(xì)月包克隆的混合物中存在的核酸，例如存在于DNA文庫(如cDNA或基因組DNA文庫)中的這些。關(guān)于多肽、變體或片段的術(shù)語"純化的"指的是所述多肽、變體或片段基本上不包含天然-相關(guān)的成分，其是在它天然狀態(tài)中伴隨它的成分?；瘜W(xué)合成的多肽，利用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的多肽，或者在不同于本發(fā)明的多肽天然來源于其的細(xì)胞系統(tǒng)的細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生的多肽，基本上不包含它天然相關(guān)的成分。術(shù)語"純化的多肽"不包括在蛋白凝膠的泳道(lane)中分離的多肽，其中多種不相關(guān)多肽^f皮分離。通常，本發(fā)明的多肽、變體或片段可以構(gòu)成包含本發(fā)明的多肽的樣品重量的至少約25%,并且通常構(gòu)成樣品的至少約50%、至少約75%、至少約85%、至少約卯％,尤其是樣品的至少約95%或99%或更多。本文所用的關(guān)于本發(fā)明的多肽或變體的短語"生物活性片段"意味著具有SEQIDNO:4中所示的序列的至少15到20個(gè)相鄰(contiguous)氨基酸的片段，其還(1)具有抗微生物活性和/或(2)是免疫原性的、免疫調(diào)節(jié)性的(immunoregulatory)、或者既是免疫原性又是免疫調(diào)節(jié)性的。本文所用的術(shù)語"多肽"意味著由至少15個(gè)氨基酸構(gòu)成的聚合物，與翻譯后修飾(如曱基化、糖基化或磷酸化)無關(guān)。短語"本發(fā)明的抗微生物多肽"或"本發(fā)明的多肽"以及術(shù)語"K9CATH"指的是犬導(dǎo)管素多月太(caninecathelicidinpolypeptide),以及其書t生物。如本文所用的，短語"抗微生物活性"意味著針對一種或多種細(xì)菌、真菌、病毒或原生動(dòng)物的殺微生物和/或樣i生物抑制(microbiostatic)活性。殺微生物活性指的是殺滅耙微生物或造成粑微生物的不可逆的損傷的能力。微生物抑制活性指的是抑制靶微生物的生長或增殖能力而不會(huì)不可避免地殺滅或不可逆地?fù)p傷它的能力。術(shù)語"免疫原性，，意味著所述多肽、變體或片段能夠誘發(fā)對于具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽特異性的抗體的產(chǎn)生。關(guān)于抗體的短語"特異地結(jié)合"或術(shù)語"特異的"意味著與具有小于80%的與SEQIDNO:4的同一性(identity)的多肽相比，抗體以至少50%或更大的親和力、優(yōu)選約75%或更大的親和力、以及更優(yōu)選地，約90%或更大的親和力結(jié)合到SEQIDNO:4的多肽。術(shù)語"免疫調(diào)節(jié)性的"意味著所述多肽、變體或片段不影響未受刺激的動(dòng)物中免疫系統(tǒng)的正常功能，如細(xì)胞性質(zhì)(cellularity),但確實(shí)影響或調(diào)節(jié)已經(jīng)被疾病改變的免疫系統(tǒng)。這樣的調(diào)節(jié)的非限制性實(shí)例包括延遲型超敏(DTH)反應(yīng)的抑制、免疫細(xì)胞應(yīng)答性的抑制、以及響應(yīng)于抗原攻擊的抗體生成的抑制。如本文所用的，術(shù)語"抑制"意味著任何數(shù)量的減少，包括而不限于5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或多于95%的減少、如100%的減少。術(shù)語"治療有效量"意p未著治療疾?。桓纳?、減輕、或消除特定疾病的一種或多種癥狀；或預(yù)防或延遲疾病的一種或多種癥狀的發(fā)作的化合物或化合物的組合的量。短語微生物的"能夠支持生長的培養(yǎng)基"包括氣體、液體或固體物質(zhì)，細(xì)菌、病毒、真菌或原生動(dòng)物可以在其中或其上存活或繁殖。這樣的培養(yǎng)基包括脊推動(dòng)物如人、魚、雞或另外的鳥的組織或體液；液體如水或水溶液，如隱形眼鏡溶液或眼藥水溶液；食物，如食用作物和食品，如提取物、凍結(jié)或脫水食物或其它加工食品；預(yù)先包裝的食物，如干酪、家禽或其它肉類；以及物體，如所用儀器的表面，例如，以制備食物或進(jìn)行手術(shù)；以及氣體，如用于手術(shù)準(zhǔn)備中的麻醉的氣體。所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。雖然類似于或等同于本文所述的那些的方法和材料可以用于實(shí)施本發(fā)明，但是合適的方法和材料如下所述。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容以引用方式并入。氨基酸名稱可以包括全名、三字母、或單字母名稱，如這個(gè)發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解的。如有沖突，以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，所述材料、方法、和實(shí)例僅是示意性的，而不試圖是限制性的。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)通過下面的詳細(xì)描述和權(quán)利要求將變得顯而易見。本Jt'勞^戎凝i參^妖，^伴(^ar/關(guān)d;^^覆及^A^Cathelicidins是陽離子多肽，其具有高度保守的N-末端信號(hào)肽和前區(qū)(pro-regions)(cathelin結(jié)構(gòu)域)，以及高度異質(zhì)的C-末端抗微生物結(jié)構(gòu)域(Zanetti,J.Leukoc.Biol.,75:39(2004);Balsetal.,CellMol.LifeSci.,60:711(2003);Zaiouetal.,J.Invest.Dermatol.,120:810(2003))。Cathelicidin宿主防御肽是中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞的抗微生物能力的主要成分(Agerberthetal.,Blood,96:3086(2000);Larricketal.,J.Immunol.,152:231(1994);Niyonsabaetal.,Curr.DrugTargetsInflamm.Allergy,2:224(2003)),并且也是肺、膀胱、腸、口腔粘膜、皮膚、及睪丸的上皮細(xì)胞內(nèi)的固有防御機(jī)制中的關(guān)鍵元素(Zaiouetal.,J.Mol.Med.,80:549(2002);Gennaroetal.,Biopolymers,55:31(2000))。本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)犬導(dǎo)管素具有廣譜抗微生物活性，包括而不限于針對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌、原生動(dòng)物、以及酵母的活性。因此，本發(fā)明提供了犬導(dǎo)管素抗微生物多肽、其片段、其變體或所述變體的片段、分離的核酸分子和具有編碼本發(fā)明的犬導(dǎo)管素多肽、變體或片段的分離核酸分子的表達(dá)載體、包含這樣的核酸分子和/或表達(dá)載體的分離的細(xì)胞、包含本發(fā)明的犬導(dǎo)管素多肽、變體或片段的組合物、以及包含本發(fā)明的這樣的多肽、變體或片段或用于它們的核酸的制造的制品。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)本發(fā)明的犬導(dǎo)管素多肽、變體或片段的方法、利用本發(fā)明的抗微生物多肽、變體或片段、或用于它們的核酸分子抑制微生物生長的方法、以及用本發(fā)明的抗微生物多肽、變體或片段、或用于它們的核酸分子治療脊推動(dòng)物中的微生物感染的方法。本發(fā)明的多肽、變體或片段可以通過從表達(dá)本發(fā)明的多肽、變體或片段的細(xì)胞分離獲得、可以化學(xué)合成、或者可以從重組核酸分子表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有廣譜抗微生物活性的多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了純化的犬導(dǎo)管素多肽，如，具有SEQIDNO:2或4的多肽。本發(fā)明的犬導(dǎo)管素多肽、變體或片段具有廣譜抗微生物活性。本文所用的術(shù)語"廣譜"指的是減少或抑制各種真核或原核微生物的存活或生長的能力，所述微生物包括而不限于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母和原生動(dòng)物。革蘭氏陽性細(xì)菌的實(shí)例包括而不限于和葡萄球菌屬的成員。革蘭氏陰性細(xì)菌的實(shí)例包括而不限于埃希氏菌屬、iT/eZwe//a、沙門氏菌屬、假單胞菌屬、變形桿菌屬、密螺旋體屬、衣原體屬、以及A^&ena屬的成員。酵母的實(shí)例包括而不限于假絲酵母屬的成員。原生動(dòng)物的實(shí)例包括而不限于毛滴蟲屬的成員。本發(fā)明的導(dǎo)管素多肽具有針對各種微生物的抗微生物活性，所述樣吏生物包括而不限于Zi對enamo"ocytogew^、金黃色葡萄球菌(S啤/i^/ococcws)、大腸軒菌(E^c/zen'c/n'aco//)、f/eZw'e〃"/wewmo剛'ae、鼠4另寒沙、門氏菌(Sa/mcwe〃"(y//n'附w/7力附)、纟錄膿4干菌(尸seW(io柳owas"aerwg/wos*")、尸n9fcus附z'r"6//^、iSb/附cwe〃aewe〃'/7.(i&、wrea/y/7'cww;白色念珠菌(Ca"(i/t/aa/Z^'ca/is1);7Vepowema/a〃Ww附、沙目艮衣原體(C7A2，&afrac/z謂a/^)和7Wc/zo附owos1vagz'憩fe。本發(fā)明的多肽的變體可以具有與SEQIDNO:4的一定程度的氨基酸序列同一性并且具有抗微生物活性，或者是免疫原性的，或者兩者均有。術(shù)語"變體"包括具有如下氨基酸序列的多肽，所述序列具有至少53。/。的與SEQIDNO:4的序列的序列同一性。如本文所用的，術(shù)語"％同一性"或"序列同一性"指的是兩個(gè)或更多個(gè)多肽序列、以及兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸序列即，參考序列和要與所述參考序列相比的給定序列之間的關(guān)系。序列同一性通過在所述序列被最佳地對準(zhǔn)(aligned)以產(chǎn)生最高程度的序列相似性后比較給定序列和參考序列來確定，其通過這樣的序列的串(string)之間的匹配確定。這樣的對準(zhǔn)后，序列同一性在位置-對-位置(position-by-position)基礎(chǔ)上確定，例如，如果在特定位置，核苷酸或氨基酸殘基是相同的，那么所述序列在那個(gè)位置上是"相同的"。這樣的位置同一性的總數(shù)隨后除以參考序列中核苷酸或殘基的總數(shù)以給出％序列同一性。序列同一性可以通過已知方法容易地計(jì)算，所述方法包括而不限于在ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.N.,ed.,OxfordUniversityPress,NewYork(1988),Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,NewYork(1993》ComputerAnalysisofSequenceData,PartI,Griffin,A.M，andGriffin,H.G.,eds.,HumanaPress,NewJersey(1994);SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinge,G.,AcademicPress(1987);SequenceAnalysisPrimer,Gribskov，M.andDevereux,J.,eds.,M.StocktonPress,NewYork(1991);以及Carilloetal.,AppliedMath.,48:1073(1988)中描述的那些，其教導(dǎo)以引用方式并入本文中。優(yōu)選的確定序列同一性的方法^:設(shè)計(jì)為給出要測試的序列之間的最大匹配。確定序列同一性的方法在公眾可獲得的計(jì)算機(jī)程序中編碼，所述程序確定給定序列之間的序列同一性。這樣的程序的實(shí)例包括而不限于GCG程序包(Devereux,etal.,NucleicAddsResearch,12:387(1984)),BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschuletal.,J.Molec.Biol.,215:403(1990))。BLASTX程序是從NCBI和其它來源公眾可獲得的(BLASTManual,Altschuletal.,NCVINLMNIHBethesda,MD20894,Altschuletal.,J.Molec.Biol.,215:403(1990),其教導(dǎo)以引用方式并入本文中)。這些程序利用默認(rèn)間隙斥又重(defaultgapweights)最佳地對準(zhǔn)序列以便產(chǎn)生給定和參考序列之間的序列同一性的最高水平。作為說明，具有與參考氨基酸序列有至少例如95%的序列同一性的給定氨基酸序列的多肽，意味著所述多肽的給定氨基酸序列與所述參考序列相同，除了所述給定多肽序列可以包括每100個(gè)參考氨基酸序列的氨基酸中最多5個(gè)氨基酸的改變。換句話說，為了獲得與參考氨基酸序列具有至少95%的序列同一性的給定多肽序列，所述參考序列中最多達(dá)5%的氨基酸殘基可以缺失或用另外的氨基酸替換，或者所述參考序列中氨基酸殘基總數(shù)的最多5%的多個(gè)氨基酸可以被插入到所述參考序列中。所述參考序列的這些改變可以發(fā)生在所述參考氨基酸序列的氨基或并t基端位置或者那些末端位置之間的任何位置，在所述參考序列中的殘基中個(gè)別地散布或者在所述參考序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)群組(group)中散布。優(yōu)選地，不相同的殘基位置由于保守的氨基酸替換而不同。然而，>床守的*#:換在確定序列同一性時(shí)不作為匹配包4舌在內(nèi)。本發(fā)明的多肽可以具有如下氨基酸序列，其具有與SEQIDNO:4超過52%的同一性，例如與SEQIDNO:4至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少97%相同。所述序列中這樣的變化可以是由于氨基酸替換，其不顯著地影響(a)取代區(qū)中肽主鏈的結(jié)構(gòu)、(b)耙標(biāo)位置的分子的電荷或疏水性、或(c)側(cè)鏈的大部分(bulk)。天然存在的氨基酸殘基基于共同的側(cè)鏈性質(zhì)^皮分成下列組(1)發(fā)u7jc性的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile;(2)中性親水性的cys、ser、thr;(3)酸性的asp、glu;(4)械性的asn、gln、his、lys、arg;(5)影響鏈取向的殘基gly、pro;以及(6)芳香力矣的；trp、tyr、phe。多肽序列中一個(gè)氨基酸被如上分類的類似類型的另一個(gè)取代稱為保守的氨基酸替換。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，上述分類不是絕對的。許多氨基酸表現(xiàn)出超過一種的特有性能，因此可以包括在超過一個(gè)類別中。例如，酪氨酸具有非極性芳香環(huán)和極性羥基。因此，酪氨酸具有可以被描述為非極性或酸性的多個(gè)特性。然而，非極性環(huán)是主導(dǎo)的，因此酪氨酸通常被認(rèn)為是疏水性的。類似地，除了能夠形成二硫鍵，半胱氨酸也具有非極性特征。因此，雖然不被嚴(yán)格地分類為疏水性或非極性氨基酸，但是在許多情況下，半胱氨酸可以用于給予肽疏水性或非極性。本發(fā)明的多肽可以具有相應(yīng)于SEQIDNO:4的氛基酸序列，具有l(wèi)到9個(gè)保守的氨基酸替換，只要所述多肽具有SEQIDNO:4的抗微生物活性并且如本文所定義的是免疫原性的。本發(fā)明的多肽的序列中的變化也可以起因于非保守替換。非保守替換需要將上述類別之一的成員與另一類別的成員交換。這樣的變體可以具有在"非重要"的氨基酸殘基處的氨基酸替換，所述殘基即在野生型序列中可以被改變或缺失而不消除抗微生物活性的殘基。這樣的非重要?dú)埢梢岳帽疚拿枋龅姆椒ɑ虮绢I(lǐng)域已知的方法鑒定，如位點(diǎn)特異性誘變或缺失/截短(truncation)突變體的產(chǎn)生，隨后確定生物活性并與如下所述的野生型序列比較。因此，當(dāng)引入替換時(shí)，可以測試形成的變體以i正實(shí)或確定它們的生物活性7jc平。術(shù)語變體還包括SEQIDNO:2或4的犬導(dǎo)管素的等位基因變體。等位基因變體起因于在犬群中天然存在的遺傳多態(tài)性。遺傳多態(tài)性和用于鑒定本發(fā)明的多肽的等位基因變體的方法的實(shí)例在核酸部分中描述。本發(fā)明的多肽可以為SEQIDNO:4的片段，以及SEQIDNO:4的變體的片段，其具有抗微生物活性或是免疫原性的。用于描述本發(fā)明的多肽的術(shù)語"片段"指的是參考序列即SEQIDNO:4或其變體序列的至少15個(gè)相鄰氮基酸的區(qū)段。片段的長度比SEQIDNO:4中所示的全長氨基酸序列少至少一個(gè)氨基酸。因此，SEQIDNO:4的片段可以具有針對一種或多種微生物的抗微生物活性，針對所述微生物SEQIDNO:4是有活性的。所述抗微生物活性可以為殺;f敖生物的或^:生物抑制的，并且可以為SEQIDNO:44十，于例如附owoc少togewes、金黃色葡萄J求菌、大腸才干菌、鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌、,'ra&7&、S"/mowe〃"、7Ve^en'agowo^r/zoeae、f7re(3/7/a膽a、t/rea/AxsT2awrea/ydct^、白色念珠菌、TVepowema/7(3〃Z't/wW、沙眼衣原體和7WC/ZO附OWOS1V(3gW"fe的一種或多種的活性的10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或超過90%。因此，SEQIDNO:4的變體或片l殳可以具有與SEQIDNO:4相同的抗微生物活性性質(zhì)，即，它具有與SEQIDNO:4相同的活性譜，因?yàn)樗?十7十有才幾體的相同組，尤其是，Zj'Wen力附owoc^oge"^、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、A7e細(xì)e〃a戶e^omae、鼠傷寒沙門氏菌、綠膿#干菌、尸roez^w^n26z7z.《、5^/mowe〃aew/e〃Yz'<i&、TVe^seha白色念珠菌、rre/owe淤(3/a〃Wwm、妙、8艮衣原、體禾口7Wc/zowow"s是有活性的。確定針對一種或多種微生物的活性的方法在本文中披露或者對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。SEQIDNO:4的片段的非限制性實(shí)例以及本發(fā)明的其它多肽在表1中提供。表lseqidno序列4rlkelittggqkige認(rèn)rigqrikdffknlqpreek:s6LKEUTTGGQK1GEKIRRIGQR1KDFFKNLQPREEKS8KEL1TTGGQKIGEKIRRIGQR1KDFFKNLQPREEKS10ELITTGGQKIGEKIRIIIGQRIKDFFKNLQPREEKS12LITTGGQJKIGEKIRRIGQRIKDFFKNLQPREEKS141TTGGQK1GEK1RRIGQR1KDFFKNLQPREEKS16RLKELITTGGQKIGEKIRRIGQRIKDFFKNLQP18RLKELITTGGQK1GEKIRRIGQRIKDFFKNLQPR20RLKELITTGGQK1GEKIRRIGQRIKDFFICNLQPRTE22RLKEUTTGGQKIGEKIRJIIGQRIKDFFKNLQPREE24RLKELITTGGQKIGEKIRRIGQRIKDFFKKLQPREEK26DRLKELITTGGQKIGEKIRRIGQRIKDFFKNLQPREEKS28IDRLKELITTGGQKIGEKIRRIGQRIICDFFKNLQPREEKS30KIDRLKELITTGGQKIGEKIRRIGQRIKDFFKNLQPREEKS32KKIDRLKELrTTGGQKIGEKlRRIGQRIKDFFKNLQPREEKS本發(fā)明的多肽還包括特異性結(jié)合到抗體的多肽，所述抗體特異性結(jié)合到具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽。用于產(chǎn)生特異性結(jié)合到具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。用于確定抗體是否結(jié)合到所選抗原的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。軀參本發(fā)明的多肽、變體或片段還可以為融合蛋白，其中本發(fā)明的多肽、變體或片段，如SEQIDNO:4，被進(jìn)一步附著于不相關(guān)的另外的氨基酸，如多組氨酸(polyhistidine)標(biāo)簽、蛋白A、綠色熒光蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、用于分泌的異源信號(hào)序列(如，gp67、phoA分泌信號(hào)、蛋白A)、或促進(jìn)純化、檢測或其它有用性能的其它功能性氨基酸結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的融合蛋白中，不相關(guān)的、異源多肽可以附著于本發(fā)明的抗微生物多肽、變體或片段的氨基-或羧基-末端。用于產(chǎn)生融合多肽的方法的實(shí)例在下面的核酸部分論述。本發(fā)明的多肽可以包括一個(gè)或多個(gè)非天然存在的氨基酸、一個(gè)或多個(gè)蛋白產(chǎn)生(proteogenic)(即，所述氨基酸可以通過代i射途徑^皮并入細(xì)胞中的蛋白內(nèi))或非蛋白產(chǎn)生氨基酸，以致所獲得的衍生多肽與相應(yīng)的未修飾的多肽相比，具有延長的穩(wěn)定性、提高的活性或其它有用性能。因此，本文涉及的氨基酸包括，例如，天然存在的蛋白產(chǎn)生(L)-氨基酸、以及(D)-氨基酸、化學(xué)修飾的氨基酸如氨基酸類似物、天然存在的非蛋白產(chǎn)生氨基酸如正亮氨酸、以及具有本領(lǐng)域已知為氨基酸的特征的性質(zhì)的化學(xué)合成的化合物。術(shù)語氨基酸還包括不由遺傳密碼編碼的氨基酸，如，例如，|3-丙氨酸(P-Ala)、或其它Q-氨基酸，如3-氨基丙酸(3國aminopropionic)、2,3-二氨基丙酸(2,3-diaP)、4畫氨基丁酸(4-aminobutyric)等、a-氛基異丁酸(a國aminisobutyricacid)(Aib)、肌氨酸(Sar)、鳥氨酸(Orn)、瓜氨酸(Cit)、叔-丁基丙氨酸(t-BuA)、叔-丁基甘氨酸(t-BuG)、N-曱基異亮氨酸(N-Melle)、苯基甘氨酸(Phg)、以及環(huán)己基丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle)、2-萘基丙氨酸(2-Nal);1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸(Tic);卩-2-噻吩丙氨酸(Thi);蛋氨酸亞砜^(methioninesulfoxide)(MSO);高精氨酸(Har);磷酸絲氨酸；磷酸蘇氨酸；磷酸酪氨酸；羥脯氨酸；y-羧基谷氨酸(y-carboxyglutamate);馬尿酸；7乂氬口引"朵誦2國羧f復(fù)(octahydroindole-2-carboxylicacid);statine;青霉胺、a-甲基-丙氨酸、對-苯曱酰-苯丙氨酸；羥脯氨酸、羧基谷氨酸(carboxyglutamate)和炔丙基甘氨酸(propargylglycine)。其它修飾包括用2-巰基乙醇還原半胱氨酰(cysteinyl)巰基和用碘乙酰胺羧甲基化，如Lambdenetal.(1981)所述。本發(fā)明的多肽還包括而不限于具有化學(xué)修飾的多肽，所述化學(xué)修飾如PEGylation(即，共價(jià)連接到聚乙二醇)、烷基化、?；?、氨甲酰化(carbamylation)、碘化、酯化、酰胺化、還原、保護(hù)、或已知提高其穩(wěn)定性和/或生物利用度的任何其它修飾。甲酰-蛋氨酸、焦谷氨酰胺(pyroglutamine)和三甲基-丙氨酸可以在所述多肽的N-末端殘基處祐二替換。其它氨基-末端修飾包括氨基氧戊烷(aminooxypentane)修飾(參見Simmonsetal.,Science,276:276(1997))。術(shù)語衍生物還包括這樣的多肽，其中一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵(-CO-NH--)被另外的鍵取代，所述另外的鍵如—CH2NH—、—CH2S.....CH2CH2、—CH=CH—(順式和反式)、—COCH2—、—CH(OH)CH2—和-CH2SO-。這個(gè)取代可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)4亍(參見，例如，Spatola,VegaDataVol.1,Issue3,(1983);Spatola,inChemistryandBiochemistryofAminoAcidsPeptidesandProteins,Weinstein,ed.,MarcelDekker,NewYork,p.267(1983》Morley,TrendsPharm.Sci.pp.463468(1980);Hudsonetal.,Int.J.Pept.Prot.Res.,14:177(1979);Spatolaetal,，LifeSci.,38:1243(1986);Harm,J.Chem.Soc.PerkinTrans.,1:307(1982);Almquistetal.,J.Med.Chem.,23:1392(1980);Jennings-Whiteetal.,TetrahedronLett,,23:2533(1982);Szelkeetal.,EP45665(1982);Holladayetal.,TetrahedronLett.,24:44011983);以及Hruby,LifeSci.,31:189(1982))。這樣的衍生多肽可以包括而不限于一個(gè)或多個(gè)修飾的氨基酸，例如，羥脯氨酸、羧基谷氨酸、或上述那些、以及未通過肽連接的氨基酸。衍生的多肽還包括這樣的多肽，其中參考多肽中的一個(gè)或多個(gè)酰胺鍵(-CO-NH-)被另外的鍵如—CH2NH-、-CH2S—、—CH2CH2、—CH=CH—(順式和反式)、一COCH2—、—CH(OH)CH2-以及-CH2SO-取代。這個(gè)取代可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行(參見，例如，Spatola,VegaDataVol.1,Issue3,(1983);Spatola,inChemistryandBiochemistryofAminoAcidsPeptidesandProteins,Weinstein,ed.,MarcelDekker,NewYork,p.267(1983);Morley,TrendsPharm.Sci.pp.463468(1980);Hudsonetal.,Int.J.Pept.Prot.Res.,14:177(1979);Spatolaetal.,LifeSci.,38:1243(1986);Hann,J.Chem.Soc.PerkinTrans.,1:307(1982);Almquistetal.,J.Med.Chem,,23:1392(1980);Jennings-Whiteetal.,TetrahedronLett.,23:2533(1982);Szelkeetal.,EP45665(1982);Holladayetal.,TetrahedronLett,24:4401(1983);以及Hruby,LifeSd.,31:189(1982))。夢/務(wù)本發(fā)'勞#多^.^傳4'^發(fā)^才法本發(fā)明的多肽、變體或片段可以在體外例如，通過固相肽合成方法或通過酶催化的肽合成、或者借助重組DNA技術(shù)利用下述本發(fā)明的核酸合成。固相肽合成方法是已建立并廣泛使用的方法，其描述在如下面的參考文獻(xiàn)中Stewartetal.,SolidPhasePeptideSynthesis,W.H.FreemanCo.,SanFrancisco(1969);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149(1963);Meienhoferin"HormonalProteinsandPeptides,"ed.;C.H.Li,Vol.2(AcademicPress,1973),pp.48-267;以及BavaayandMerrifield,"ThePeptides,"eds.E.GrossandF.Meienhofer,Vol.2(AcademicPress,1980)pp.3-285。這些肽可以通過以下一皮進(jìn)一步純4t:在免疫親和性(immunoaffinity)或離子交換柱上分級(fractionation);乙醇沉淀；反相HPLC;在硅石上或陰離子交換樹脂如DEAE上的色譜法；色譜聚焦；SDS-PAGE;石危酸銨沉淀；利用例如SephadexG-75的凝膠過濾；配體親和色i普法(ligandaffinitychromatography);或/人非才及性溶劑或非^f及性/極性溶劑混合物結(jié)晶或沉淀。通過結(jié)晶或沉淀進(jìn)行純化是優(yōu)選的。一旦被分離和表征，給定重組多肽的衍生物，如化學(xué)來源的衍生物，可以利用本領(lǐng)域熟知的方法容易地制備。一種方法是制備作為環(huán)化肽的衍生物(參見EPA471,453(酰胺鍵(amidebonds));EPA467,701(二硫鍵(disulfidebonds));EPA467,699(硫醚鍵(thioetherbonds)))。另外的4務(wù)飾披露在Jamesonetal.(Nature,368:744(1994));美國專利No.4,992,463;以及美國專利No.5,091,396中。例如，為了通過自由半胱氨酰石克醇基(freecysteinylthiolgroups)的氧化來環(huán)化肽，肽(O.lmgmL")與硤(ImM,甲醇中)在0°C反應(yīng)1小時(shí)并且隨后用石危代石危酸鈉終止氧化?；旌衔镌诎胫苽涞腪orbaxC8柱上進(jìn)行反相HPLC,隨后在ZorbaxGF250柱上進(jìn)行凝膠過濾。利用AppliedBiosystemsBiolon20生物聚合物等離子體脫附飛行時(shí)間質(zhì)量分析4義(Biopolymerplasmadesorptiontime-of國flightMassAnalyzer),通過質(zhì)譜法進(jìn)一步分析通過凝膠過濾步驟分離的兩個(gè)峰。第一峰通過質(zhì)量分析被分解(resolved)成兩種(species),部分保護(hù)的單體肽和二聚肽。在飽和前在肽濃度最高時(shí)(20mgmL")利用Ellman，s試劑[5,5-二硫代-二(2-硝基苯甲酸)；Sigma]測試所述材料的自由半胱氨酸硫醇基(freecysteinethiolgroups)。這個(gè)峰表示環(huán)肽，儲(chǔ)存在pH4.0、-20。C直到使用(參見Tam&Lu(1989))。所述多肽的酰胺還可以通過本領(lǐng)域熟知的用于將羧酸基或前體轉(zhuǎn)化為酰胺的技術(shù)制備。用于C-末端羧基處酰胺形成的優(yōu)選方法是用合適的胺從固體載體切開肽，或在醇的存在下切開，產(chǎn)生酯，隨后用希望的胺進(jìn)行氨解。本發(fā)明的多肽的氨基的N-?；苌锟梢酝ㄟ^利用用于最終縮合的N-酰基保護(hù)的氨基酸、或者通過?；Ｗo(hù)或未保護(hù)的肽制備。O-?；苌锟梢酝ㄟ^例如自由羥基肽或肽樹脂的?；苽洹Ｃ總€(gè)?；梢岳脴?biāo)準(zhǔn)酰化試劑，如酰卣、酐、?；溥?acylimidazoles)等進(jìn)行。如果希望，N-?；蚈-酰化可以一起進(jìn)行。本發(fā)明的多肽的羧基的鹽可以以通常方式通過將所述多肽與一個(gè)或多個(gè)當(dāng)量的希望的堿接觸來制備，所述堿，例如，金屬氫氧化物堿，如氫氧化鈉；金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽堿，如，例如碳酸鈉或碳酸氫鈉；或胺堿，如，例如三乙胺、三乙醇胺等。所述多肽或變體多肽的酸加成鹽(Acidadditionsalts),或所述肽或變體肽的氨基殘基的酸加成鹽，可以通過將所述肽或胺與一個(gè)或多個(gè)當(dāng)量的希望的無機(jī)或有機(jī)酸，如，例如鹽酸接觸來制備。所述肽的羧基的酯也可以通過本領(lǐng)域已知的任何通常方法制備。本發(fā)明的多肽還可以通過從下面的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞部分中描述的重組核酸的表達(dá)產(chǎn)生。當(dāng)本發(fā)明的多肽在重組細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，必須從其它細(xì)胞蛋白或多肽純化所述重組肽以獲得關(guān)于本發(fā)明的重組多肽的基本上同質(zhì)的制備物。例如，培養(yǎng)基或溶解產(chǎn)物可以被離心以去除微粒細(xì)胞碎片。隨后分離膜和可溶蛋白部分(fraction)。本發(fā)明的多肽可以隨后從可溶蛋白部分純化?？蛇x地，如果必要，本發(fā)明的多肽可以從不溶部分，即，折射體純化(參見，例如，美國專利No.4,518,526)。本發(fā)明的多肽可以通過下述從污染物可溶或膜蛋白質(zhì)和多肽純化在免疫親和性(immunoaffinity)或離子交換柱上分級(fractionation);乙醇沉淀；反相HPLC;在硅石上或陰離子交換樹脂如DEAE上的色譜法；色鐠聚焦；SDS-PAGE;硫酸餒沉淀；利用例如SephadexG-75的凝膠過濾；或酉己體親和色i普法(ligandaffinitychromatography)等。如果作為融合多肽表達(dá)，所述融合多肽可以通過對于所述融合多肽的導(dǎo)管素部分特異的方法純化。例如，如果所述融合多肽是組氨酸標(biāo)記的融合多肽，可以采用Ni-NTA樹脂以純化所述融合多肽。本發(fā)明的多肽還可以通過體外轉(zhuǎn)錄和翻譯反應(yīng)制備?？梢圆捎帽磉_(dá)盒以產(chǎn)生基因-特異性轉(zhuǎn)錄物，其隨后在體外被翻譯以便導(dǎo)致基本上同質(zhì)的本發(fā)明的多肽的制備。用于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)的載體的構(gòu)建、以及用于這樣的反應(yīng)的方法在本領(lǐng)域是熟知的。W衡裙虔》、f本發(fā)明還提供了分離的核酸分子，其編碼犬導(dǎo)管素多肽、其變體或片段。因此，本發(fā)明的核酸分子可以編碼具有SEQIDNO:2或4的氨基酸序列、SEQIDNO:4的變體的氨基酸序列、或其片段的多肽?？梢跃幋a具有SEQIDNO:2或4的氮基酸序列的多肽的本發(fā)明的核酸分子的實(shí)例是具有SEQIDNO:1或3的核苷酸序列的核酸。本發(fā)明的核酸分子的非限制性實(shí)例包括下面的<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>編碼犬導(dǎo)管素多肽變體的核酸包括簡并變體(degeneratevariant)、以及等位基因變體(allelicvariant)。描述核酸的本文所用的術(shù)語"簡并變體"意味著由于遺傳密碼的簡并性，所述核酸具有不同于SEQIDNO:1或3的核苷酸序列，但是仍編碼分別具有SEQIDNO:2或4的氨基酸序列的多肽。簡并變體包4舌具有反映所選宿主細(xì)i包表達(dá)系統(tǒng)中密碼子4吏用偏好(codonusagepreference)的序列的核酸分子。因此，沒計(jì)為反映特定宿主細(xì)^^的密碼子使用偏好的核酸變體不在氨基酸水平表現(xiàn)出改變。本文所用的描述本發(fā)明的核酸的術(shù)語"等位基因變體"意味著由于遺傳多態(tài)性，作為SEQIDNO:1或3的等位基因變體的核酸不同于SEQIDNO:1或3的序列，以這樣的方式以致所編碼的多肽分別不同于SEQIDNO:2或4。遺傳多態(tài)性由于天然等位基因的變異(naturalallelicvariation)存在于群體(如犬群體)內(nèi)的個(gè)體中并且導(dǎo)致群體(如犬群體)內(nèi)特定多肽的氨基酸序列的變化。這樣的天然等位基因變異通常導(dǎo)致給定基因的核苷酸序列中1-5%的變化。如本文所用的，術(shù)語"基因"指的是包括編碼本發(fā)明的多肽的開放閱讀框的核酸分子。等位基因是可選地存在于給定基因座的一組基因之一。等位基因變體可以通過以下鑒定(1)利用本發(fā)明的雜交探針(如上所述)以鑒定并分離多個(gè)個(gè)體犬中同樣的基因座并且隨后(2)對犬群體中多個(gè)不同的個(gè)體中的編碼犬導(dǎo)管素的基因進(jìn)行測序。任何和全部的這樣的核苷酸變異和由此獲得的氨基酸多態(tài)性或變異(其是天然等位基因變異的結(jié)果并且不改變功能活性)被認(rèn)為包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。核酸變體還包括編碼具有至少53%與SEQIDNO:4相同的氨基酸序列的多肽的核酸。因此，所述核酸變體可以編碼具有至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少97%與SEQIDNO:4相同的氨基酸序列的多肽。這樣的核酸變體的實(shí)例包括與SEQIDNO:1或3具有至少70%、優(yōu)選地，至少70%、80%,85%,90%,95%或超過95%的同一性的核苷酸序列的那些核酸。本發(fā)明的核酸分子還可以具有在高度嚴(yán)格的條件或中等嚴(yán)格的條件下與編碼SEQIDNO:4或其互補(bǔ)體的核酸序列雜交的核苷酸序列。這樣的核酸分子的實(shí)例是在高度嚴(yán)格的條件或中等嚴(yán)格的條件下與雜交探針雜交的核酸分子，其核苷酸序列是SEQIDNO:1或3的互補(bǔ)體。術(shù)語"雜交"意味著在特定條件下第一核酸分子和第二核酸分子之間穩(wěn)定雙鏈體的形成。所述雙鏈體的穩(wěn)定性依賴于雜交條件，其由溫度、離子強(qiáng)度、以及其它化合物如有機(jī)溶劑的存在限定。通常，鹽濃度越低，沖洗溫度越高，雜交/沖洗條件越嚴(yán)格。嚴(yán)格性還可以通過改變鹽、SDS或有機(jī)成分的濃度調(diào)節(jié)，同時(shí)維持雜交和沖洗溫度在65°C。在高度嚴(yán)格的或高度嚴(yán)格性的條件下，僅具有95%到100%互補(bǔ)堿基的核酸將形成穩(wěn)定的雙鏈體。在中等嚴(yán)格性或中等嚴(yán)格的條件下，僅具有至少75%的互補(bǔ)序列的核酸將形成穩(wěn)定的雙鏈體。中等和高度嚴(yán)格的條件指的是在45。C時(shí)在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，隨后分別在48。C或65。C時(shí)在0.2XSSC、0.1%SDS中沖洗。本發(fā)明的核酸分子還可以為SEQIDNO:1或3的片段，其(1)足以用作雜交探針以鑒定編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子或者(2)適于用作用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的引物用于核酸分子的擴(kuò)增或突變。這樣的片段通常包括在嚴(yán)格條件下雜交到具有SEQIDNO:1或3的核苷酸序列的核酸的有義或反義鏈的核苦酸序列區(qū)，并且在嚴(yán)格條件下不與如上所述不相關(guān)的核酸雜交。這樣的片段的實(shí)例包括而不限于表2中所示的SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33。本發(fā)明的核酸分子還可以在堿基部分、糖部分、或磷酸骨架處修飾以提高，例如所述分子的穩(wěn)定性、雜交、或溶解性。例如，當(dāng)用作探針或引物時(shí)，本發(fā)明的核酸可以包括標(biāo)記基團(tuán)，如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子、雜交-觸發(fā)的裂解劑(cleavageagent)、或雜交-觸發(fā)的連接劑(linkingagent)。這樣的標(biāo)記可以—皮并入以促進(jìn)穿過細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)或促進(jìn)檢測。本發(fā)明的核酸還可以被可操作地連接到如下所述的表達(dá)調(diào)控序列。夢/務(wù)薦4o^g/zds#*邀w才法本發(fā)明的核酸分子，如具有SEQIDNO:1或3的核苷酸序列的核酸分子，可以利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息分離。編碼導(dǎo)管素、其片段或變體、或其核酸互補(bǔ)體的核苷酸序列的來源包括來自任何犬組織，例如來自生理液體或組織的RNA、或基因組DNA或cDNA。本發(fā)明的DNA分子的其它來源包括來源于犬的基因組或cDNA文庫。此外，本發(fā)明的DNA分子還可以通過合成長度約215、優(yōu)選約100、更優(yōu)選約50個(gè)核苷酸的寡核苷酸、或者通過亞克隆編碼犬導(dǎo)管素的DNA區(qū)段的部分體外制備。編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子可以通過Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY(1989)描述的標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定和分離。例如，逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)可以用于分離和克隆導(dǎo)管素cDNA。與編碼犬導(dǎo)管素的RNA互補(bǔ)，并且優(yōu)選雜交到RNA的3，2/3的引物，可以用作逆4爭錄酶反應(yīng)(reversetranscriptasereaction)中的引物以制備來自包含感興趣的RNA序列的分離的RNA的第一鏈cDNA。RNA可以通過本領(lǐng)域已知的方法分離，例如，利用TRIZOL試劑(GIBCO-BRL/LifeTechnologies,Gaithersburg,Maryland)。得到的第一鏈cDNA隨后在PCR反應(yīng)中被擴(kuò)增。"聚合酶鏈反應(yīng)"或"PCR"指的是方法或技術(shù)，其中核酸的預(yù)先選擇的片段(RNA和/或DNA)的量如美國專利No.4,683,195中所描述的被擴(kuò)增。通常，來自感興趣的區(qū)域的末端或之處的序列信息用于設(shè)計(jì)包括至少7-8個(gè)核苷酸的寡核苷酸引物。這些引物在序列上與要擴(kuò)增的才莫板的相對鏈相同或類似。PCR可以用于擴(kuò)增特異性RNA序列、來自全部基因組DNA的特異性DNA序列、/人全部細(xì)月包RNA、噬菌體或質(zhì)粒序列轉(zhuǎn)錄的cDNA等。通常參見Mullisetal.,ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol"51:263(1987);Erlich,ed.,PCRTechnology,(StocktonPress,NewYork,1989)。因此，基于PCR的克隆方法依賴于從相關(guān)基因或多肽序列的排列(alignments)推斷的保守序列。然而，也可以采用本領(lǐng)域已知的其它基于擴(kuò)增的方法，包括而不限于自持的(self-sustained)序列特異性復(fù)制(3SR)(Gebinogaetal.,Eur.J.Biochem.,235:256(1996);Fahyetal,,PCRMethodsAppl,1:25(1991);Guatellietal.,Proc.Nat，lAcad.Sci.U.S.A.,87:1874(1990))、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)(Compton,Nature,350:91(1991))、鏈位移擴(kuò)增(stranddisplacementamplification)(SDA)(Walkeretal.,Proc.Nat，lAcad,Sci.U.S.A.,89:392(1992);Walkeretal.,Nucl.AcidRes.,20:1691(1992))、探針環(huán)化(Landgren,TrendsinGen.,9:199(1993))、或基于Q卩復(fù)制酶、Sp6、T7、或T3RNA聚合酶的擴(kuò)增系統(tǒng)。參見，例如，美國專利Nos.5,622,820、5,629,153、5,532,126、5,573,914和5,514,545。制備的引物相應(yīng)于肽或核苷酸序列的高度保守區(qū)，其被鑒定和比較以通過例如與其它導(dǎo)管素基因的序列比較產(chǎn)生引物。制備的一個(gè)引物被預(yù)計(jì)與編碼犬導(dǎo)管素的DNA分子的反義鏈退火，制備的另一引物被預(yù)計(jì)與有義鏈退火。每個(gè)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)由瓊脂糖凝膠被分離并且全部可靠地(consistently)擴(kuò)增的產(chǎn)物被凝月交純化并直接克隆入合適的載體，如已知的質(zhì)粒載體。對得到的質(zhì)粒進(jìn)行雙鏈質(zhì)粒DNA的限制性核酸內(nèi)切酶和雙脫氧測序。或者，凝膠純化的片段可以被直接測序。可以利用集落雜交方法篩選cDNA或基因組文庫。通常，每個(gè)微滴定板-故復(fù)制到雙硝化纖維素濾紙(duplicatenitrocellulosefilterpapers)上并且在37°C，在包含50|iig/mLAmp的L瓊脂上允許集落生長14-16小時(shí)。集落浮皮裂解并通過與500mMNaOH,1.5MNaCl順序處理5分鐘DNA固定到濾器，并且用5x標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽水(standardsalinecitrate)(SSC)沖洗兩次，每次5分鐘。濾器被風(fēng)干并在80°C烘烤2小時(shí)。雙濾器(duplicatefilters)與10ml/濾器的DNA雜交緩沖液(5xSSC,pH7.0,5xDenhardt，s溶液(聚乙烯基吡咯烷酮，加Ficoll和牛血清白蛋白；1x-0.02。/。每個(gè))、50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、0.2%SDS、20)ng/mLPolyU、以及50pg/mL變性的鮭魚精子DNA)在42。C預(yù)先雜交6-8小時(shí)。在依賴于希望的嚴(yán)格性的條件下，樣品可以與激酶化的探針(kinasedprobe)雜交。典型的中等嚴(yán)^f各的條件采用42。C的溫度，24-36小時(shí)，與1-5mL/濾器的包含探針的DNA雜交緩沖液。對于更高的嚴(yán)沖各性，采用高溫度和更短的時(shí)間。通常，在37。C用2xSSC、0.2%SDS和50mM石舞酸鈉緩沖液(pH7)沖洗濾器四次，每次30分鐘，隨后2xSSC和0.2%SDS沖洗兩次，風(fēng)干，并在-70°C自動(dòng)射線照相(autoradiographed)2-3天。從限制性消化物進(jìn)行的給定的DNA片段的回收或分離可以采用通過電泳在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠上分離消化物、通過比較其移動(dòng)性與已知分子量的標(biāo)記DNA片段的移動(dòng)性鑒定感興趣的片段、移去包含希望的片段的凝膠部分、以及分離凝膠與DNA。參見Lawnetal.,NucleicAcidsRes.,9:6103(1981),及Goeddeletal.,NucleicAcidsRes"8:4057(1980)。因此，利用全部或部分SEQIDNO:3作為雜交探針，可以利用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)分離本發(fā)明的核酸分子?？梢岳胏DNA、mRNA或基因組DNA作為模板和合適的寡核苷酸引物，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增本發(fā)明的核酸分子。這樣擴(kuò)增的核酸被克隆入合適的載體并通過DNA序列分析表征。相應(yīng)于本發(fā)明的核酸分子的全部或部分的寡核苷酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)合成4支術(shù)，如，利用自動(dòng)DNA合成儀來制備。編碼本發(fā)明的多肽的"生物活性片段"的核酸可以通過下述制備分離編碼具有生物活性的多肽的SEQIDNO:1,例如SEQIDNO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31和33的任何一個(gè)的部分、例如通過體外重組表達(dá)來表達(dá)所述多肽的編碼片段、以及利用本文所述的方法或本領(lǐng)域已知的方法評估所述多肽的編碼部分的活性。^/#CV^/^//c/AVi裙凌淨(jìng);^^糸^才法通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備編碼犬導(dǎo)管素的氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括而不限于從天然源分離(在天然存在的氨基酸序列變體或等位基因變體的情況下)或通過寡核苷酸-介導(dǎo)的(或位點(diǎn)-指導(dǎo)的)誘變制備、PCR誘變、以及犬導(dǎo)管素的早期制備的變體或非變體版本的盒誘變。寡核苷酸-介導(dǎo)的誘變是用于制備犬導(dǎo)管素的氨基酸替換變體的優(yōu)選方法。這項(xiàng)技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的，如Adelmanetal.,DNA,2:183(1983)中描述的。簡短地，通過將編碼希望的突變的寡核普酸雜交到DNA模板來改變?nèi)畬?dǎo)管素DNA,其中所述模板是單鏈形式的質(zhì)?；蚴删w，包含犬導(dǎo)管素的未改變的或天然的DNA序列。雜交后，將DNA聚合酶用于合成所述模板的完整第二互補(bǔ)鏈，其將因此并入寡核苷酸引物，并將編碼犬導(dǎo)管素DNA中的所選改變。通常，使用長度為至少25個(gè)核香酸的寡核苦酸。最佳的寡核苷酸將具有12-15個(gè)寡核苷酸，其將在編碼突變的核苷酸兩側(cè)上完全互補(bǔ)于模板。這確保了所述寡核苷酸將正確地雜交到單鏈DNA模板分子。利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，如Creaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75:5765(1978)中描述的技術(shù)，容易地合成所述寡核苷酸?？梢酝ㄟ^來源于噬菌體M13載體(商業(yè)上可獲得的M13mpl8和M13mpl9載體是合適的)的那些載體、或者包含Vieraetal.,Meth.Enzymol.,153:3(1987)所述的單鏈?zhǔn)删w復(fù)制起點(diǎn)的那些載體來產(chǎn)生DNA模板。因此，要被突變的DNA可以被插入這些載體之一以產(chǎn)生單鏈才莫板。單鏈才莫板的產(chǎn)生描述在Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,1989)的4.21-4.41部分?？蛇x地，單鏈DNA沖莫板可以利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過變性雙鏈質(zhì)粒(或其它)DNA產(chǎn)生。為了改變天然DNA序列(以產(chǎn)生氨基酸序列變體，例如)，寡核苷酸在合適的雜交條件下雜交到單鏈模板。隨后加入DNA聚合酶，通常為DNA聚合酶I的Klenow片段，以便利用所述寡核苷酸作為用于合成的引物合成所述才莫板的互補(bǔ)鏈。異源雙鏈體分子由此形成以便DNA的一條鏈編碼犬導(dǎo)管素的突變形式，另一條鏈(最初^t板)編碼犬導(dǎo)管素的天然的、未改變的序列。隨后這個(gè)異源雙鏈體分子被轉(zhuǎn)化入合適的宿主細(xì)胞，通常為原核生物，如五.co"JMIOI。在所述細(xì)l包生長后，它們被涂覆(plated)到瓊脂糖板上并利用用32-磷酸放射性標(biāo)記的寡核香酸引物篩選以鑒定包含突變的DNA的細(xì)菌菌落。隨后突變區(qū)被移除并置于合適的用于肽或多肽生產(chǎn)的載體內(nèi)，一般為典型地用于合適宿主的轉(zhuǎn)化的類型的表達(dá)載體。緊鄰的上文描述的方法可以被改變以便形成同源雙鏈分子，其中質(zhì)粒的兩條鏈包含突變。改變?nèi)缦聠捂湽押塑账崤c上述單鏈模板退火。三種脫氧核糖核芬酸脫氧核糖苦(deoxyriboadenosine)(dATP)、脫氧核糖鳥苷(dGTP)、及脫氧核糖胸腺嘧啶(dTTP)的混合物與稱為dCTP-(aS)的修飾的硫代脫氧核糖胞普(thiodeoxyibocytosine)(其可以乂人Amersham乂>司獲得)組合。將這個(gè)混合物加入一莫板-寡核苦酸復(fù)合體。在將DNA聚合酶加入到這個(gè)混合物后，產(chǎn)生與才莫板相同(除了突變的堿基)的DNA的鏈。此外，這個(gè)DNA的新鏈將包含dCTP-(aS)而非dCTP,其用于防止它凈皮限制性核酸內(nèi)切酶消化。在雙鏈異源雙鏈體的模板鏈4皮合適的限制性酶切開(nicked)后，模板鏈可以用ExoIII核酸酶或其它合適的核酸酶消化，越過包含要被誘變的位點(diǎn)的區(qū)域。隨后停止反應(yīng)以留下僅部分為單鏈的分子。隨后在全部四種三-舞酸脫氧核糖核苷酸、ATP、及DNA連接酶的存在下，利用DNA聚合酶形成完整的雙鏈DNA同源雙鏈體。這個(gè)同源雙《連體分子隨后可以一皮轉(zhuǎn)^i到合適的宿主細(xì)i包中，如￡.co"JMIOI。例如，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式是包含編碼具有SEQIDNO:4的犬導(dǎo)管素的核酸的分離和純化的DNA分子，其中所述DNA區(qū)段包含SEQIDNO:3、或SEQIDNO:3的變體，具有核苷酸替4灸，其是"沉默的"。即，當(dāng)沉默的核苷酸替換在密碼子中存在時(shí)，由具有核苷酸替換的密碼子編碼的氨基酸，與由沒有替換的密碼子編碼的氨基酸是相同的。例如，纈氨酸由密碼子GTT、GTC、GTA和GTG編碼。在多肽的prepro形式中，SEQIDNO:l在第四個(gè)密碼子的變體(在SEQIDNO:l中為GT工)包括GTQ,GT^orGT^取代GTI?？梢跃幋a相應(yīng)于SEQIDNO:4的多肽的SEQIDNO:3中的其它"沉默的，，核苦酸替換可以參照圖3和Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual(1989)中的附錄D中的Dl頁來確定?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的方法將核苷酸替換引入DNA區(qū)段。參見，例如，Sambrooketal.,同上.類似地，編碼其他犬導(dǎo)管素的核酸分子可以以類似方式進(jìn)行修飾。因此，編碼犬導(dǎo)管素的至少一部分的核酸分子或者其互補(bǔ)體可以^^f'務(wù)飾以便產(chǎn)生具有沉默的核苷酸替換的本發(fā)明的核酸分子，或者產(chǎn)生具有導(dǎo)致氨基酸替換的核苷酸替換的核酸分子。^t迷戎傳和涼-i:勿,本發(fā)明的核酸還可以為表達(dá)載體的形式，其中編碼本發(fā)明的多肽的核酸可操作地連接到表達(dá)調(diào)控序列。術(shù)語"載體"指的是能夠轉(zhuǎn)運(yùn)另外的核酸(它^t連接到其上)的核酸分子。載體的實(shí)例是"質(zhì)粒"，一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，另外的DNA分子可以被連接到其中。另一實(shí)例是病毒載體，其中另外的DNA區(qū)段可以被連接到病毒基因組中。一些載體能夠在它們被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制，如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加體哺乳動(dòng)物載體，而另外的載體，如非附加體哺乳動(dòng)物載體，在引入宿主細(xì)胞后被整合到宿主細(xì)胞的基因組中，由此與宿主基因組一起復(fù)制。一些載體，尤其是表達(dá)載體，能夠指導(dǎo)它們可操作地連接的基因的表達(dá)。本發(fā)明的表達(dá)載體包括適用于在宿主細(xì)胞中的核酸的表達(dá)的形式的本發(fā)明的核酸。所述表達(dá)載體包括一種或多種調(diào)節(jié)序列，基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇，可操作地連接到要被表達(dá)的核酸序列。本文所用的術(shù)語"可操作地連接"意味著編碼序列和調(diào)節(jié)序列(如啟動(dòng)子、操縱子、增強(qiáng)子、或其它表達(dá)調(diào)控序列)以當(dāng)合適的分子如轉(zhuǎn)錄活化蛋白被連接到調(diào)節(jié)序列時(shí)，允許從編碼序列表達(dá)的這樣的方式被連接。因此，"可操作地連接"意味著感興趣的核苷酸序列，如編碼本發(fā)明的多肽的序列以這樣的方式被連接到調(diào)節(jié)序列，所述方式允許核苷酸序列，例如，當(dāng)載體被引入宿主細(xì)胞中時(shí)在宿主細(xì)胞中或在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中表達(dá)。術(shù)語"調(diào)節(jié)序列"包括而不限于啟動(dòng)子、操縱子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)調(diào)控元件，如多聚腺苷酸(polyadenylation)信號(hào)。調(diào)節(jié)序列在本領(lǐng)域中是已知的并且可以指導(dǎo)本發(fā)明的核酸在許多類型的宿主細(xì)胞或僅在一些宿主細(xì)胞中(如組織特異性調(diào)節(jié)序列)的組成性表達(dá)。表達(dá)載體的選擇和設(shè)計(jì)依賴于一些因素，其包括本發(fā)明的多肽的表達(dá)水平和所用的表達(dá)系統(tǒng)，如宿主細(xì)胞、如原核或真核(哺乳動(dòng)物，酵母)、或利用如T7系統(tǒng)體外轉(zhuǎn)錄/翻譯。本發(fā)明還提供了宿主細(xì)胞，重組表達(dá)載體被引入其中。術(shù)語"宿主細(xì)胞"指的是充分表征的同質(zhì)、生物學(xué)-純的細(xì)胞群，其可以為原核或真核的。真核細(xì)胞可以為哺乳動(dòng)物來源的、以及植物、昆蟲、酵母、或真菌來源的。真核細(xì)胞可以為瘤的或通過本領(lǐng)域的已知方法在體外"永生化"，以及原代細(xì)胞(primarycell)。宿主細(xì)胞可以為原核的，優(yōu)選細(xì)菌來源的。原核宿主最常見的代表是co/z'的各種菌株。然而，也可以4吏用其它孩么生物菌4朱，如桿菌，例如枯草桿菌(Bacillussubtilis)，假單胞菌的各種種類，或者其它細(xì)菌菌抹。術(shù)語"宿主細(xì)胞"指的是表達(dá)載體^L引入其中的特定細(xì)胞，以及這樣的細(xì)胞后代或潛在后代。這樣的后代可以與親代細(xì)胞相同，或者可以包含由于突變或環(huán)境影響在隨后的世代中發(fā)生的改變?？衫贸Ｒ?guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，所述技術(shù)包括而不限于磷酸釣或氯化鈣協(xié)同沉淀、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(lipofection)、電穿孔、或用于將核酸引入細(xì)胞的任何商業(yè)上可獲得的方法。本文所用的"轉(zhuǎn)染的"或"轉(zhuǎn)化的"包括任何宿主細(xì)胞或細(xì)胞系，其基因組在至少一個(gè)預(yù)選的DNA序列的存在下^皮改變或增加，其DNA在遺傳工程領(lǐng)域中還^皮稱為"異源DNA"、"重組DNA"、"外源DNA"、"遺傳工程的"、"非天然的"、或"外來DNA"，其中所述DNA通過遺傳工程方法被分離并引入宿主細(xì)胞或細(xì)胞系的基因組中。本發(fā)明的宿主細(xì)胞通常通過用質(zhì)粒表達(dá)載體、病毒表達(dá)載體中的DNA序列、或作為分離的線性DNA序列轉(zhuǎn)染產(chǎn)生。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)染的DNA是染色體整合的重組DNA序列，其包括編碼本發(fā)明的多肽或其互補(bǔ)體的基因，其宿主細(xì)胞可以或可以不表達(dá)顯著水平的自體同源或"天然的"導(dǎo)管素。為了確認(rèn)宿主細(xì)胞中預(yù)選的DNA序列的存在，可以進(jìn)行多種實(shí)驗(yàn)。這樣的實(shí)驗(yàn)包括，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的"分子生物學(xué)，，實(shí)驗(yàn)，如DNA印記法和Northern印記法、RT-PCR和PCR;"生物化學(xué)，，實(shí)-驗(yàn)，如，例如，通過免疫學(xué)方法(ELISA和蛋白質(zhì)印記)或通過本文所述的實(shí)-瞼^r測本發(fā)明的多肽的存在或缺乏。^"參逸合參和斧/遂#翔品在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或者用于它們的核酸分子的藥物組合物。為了制備這樣的藥物組合物，本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或者用于它們的核酸分子被合成或以另外的方式獲得，純化(如果必要或希望)，隨后被凍干和穩(wěn)定化。所述多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子可以隨后被調(diào)整到合適的濃度并隨后與其它試劑或藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合。"藥學(xué)上可接受的"意味著載體、稀釋劑、賦形劑、和/或鹽與制劑的其它成分相容，并且對于其接受者不是有害的。包含本發(fā)明的治療性多肽、其變體或片段的藥物制劑可以通過本領(lǐng)域已知的方法，利用熟知的和容易獲得的成分制備。例如，所述多肽可以與常見的賦形劑、稀釋劑、或載體配制，并形成片劑、膠嚢劑、溶液、混懸劑、粉劑、氣霧劑等。適于這樣的制劑的賦形劑、稀釋劑、及載體的實(shí)例包括緩沖劑、填充劑和增量劑如淀粉、纖維素、糖、甘露醇、及硅衍生物。還可以包括粘合劑(bindingagent)如羧甲基纖維素、羥曱基纖維素、羥丙基曱基纖維素和其它纖維素衍生物、藻酸鹽(alginates)、明膠、及聚乙烯吡咯烷酮?？梢园?舌力口濕劑(Moisturizingagents)如甘油、崩解劑如碳酸4丐和碳酸氫鈉。還可以包括用于延遲溶解的試劑，如石蠟。還可以包括吸收促進(jìn)劑(Resorptionaccelerators)如季銨^ft合物?？梢园?舌表面活性劑，如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯?？梢约尤胛捷d體如高嶺土和膨潤土。還可以包括潤滑劑如滑石、硬脂酸釣和硬脂酸鎂、以及固體聚乙二醇。還可以加入防腐劑。本發(fā)明的組合物還可以包含增稠劑如纖維素和/或纖維素衍生物。它們還可以包含樹膠，如黃原膠、瓜爾豆膠或碳膠(carbogum)或阿拉伯樹膠、或可選地聚乙二醇、bentones和蒙脫石等。對于口服給藥，多肽、其變體或片段，可以作為粉劑、顆粒制劑、溶液、混懸劑、乳劑存在或以用于從咀嚼膠(chewinggum)攝食活性成分的天然或合成聚合物或樹脂的方式存在。所述活性多肽還可以作為推注劑(bolus)、舐劑或糊劑存在。所述制劑可以在合適的情況下方便地以離散的單位劑量形式存在并且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法制備，包括將治療劑與液態(tài)載體、固態(tài)基質(zhì)、半固態(tài)載體、細(xì)碎的固態(tài)載體或其組合混合的步驟，以及隨后，如果必要，將所述產(chǎn)品引入或成形入希望的遞送系統(tǒng)。這樣的制劑中的總活性成分占所述制劑的重量的0.1到99.9%。包含本發(fā)明的多肽、其變體或片段的片劑或嚢片可以包括緩沖劑，如碳酸4丐、氧化鎂和碳酸鎂。嚢劑和片劑還可以包括非活性成分，如纖維素、預(yù)膠質(zhì)化的淀粉(pre-gelatinizedstarch)、二氧化硅、羥丙基曱基纖維素、硬脂酸鎂、微晶纖維素、淀粉、滑石、二氧化鈦、苯甲酸、檸檬酸、玉米淀粉、礦物油、聚丙二醇、磷酸鈉、硬脂酸鋅等。包含本發(fā)明的至少一種肽的硬或軟明膠嚢劑可以包含非活性成分，如明膠、微晶纖維素、十二烷基硫酸鈉、淀粉、滑石、及二氧化鈦等，以及液態(tài)載體如聚乙二醇(PEG)和植物油。此外，包含本發(fā)明的一種或多種肽的腸溶衣化的(enteric-coated)嚢片或片劑被設(shè)計(jì)為抵抗胃中的崩解并在十二指腸的更中性到堿性的環(huán)境中溶解?？诜谋景l(fā)明的治療性多肽、其變體或片段也可以配制用于緩釋。在這種情況下，本發(fā)明的肽可以被包覆、微嚢化(參見WO94/07529,及美國專利No.4,962,091)、或另外地置于持續(xù)遞送裝置中?？梢栽O(shè)計(jì)緩釋制劑以便例如在腸或呼吸道的特定部分中，釋》文活性肽，可能地超過一^殳時(shí)間?？梢詠V人例如聚合物物質(zhì)制備包衣(coating)、嚢膜、及保護(hù)性基質(zhì)，所述聚合物物質(zhì)如聚交酯-甘醇酸酯、脂質(zhì)體、微乳、微粒、納米顆粒、或蠟。這些包衣、嚢膜、及保護(hù)性基質(zhì)用于包覆內(nèi)在裝置，如支架、導(dǎo)管、腹膜透析管、排放裝置等。本發(fā)明的多肽、其變體或片段也可以配制為酏劑或溶液用于方便地口服給藥或者配制為適于腸胃外給藥的溶液，所述腸胃外給藥例如，通過肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑。本發(fā)明的治療性肽的藥物制劑還可以采用含水或無水溶液或分散體(dispersion)的形式、或者可選地乳劑或混懸劑或藥膏(salve)的形式。因此，多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子可以配制用于腸胃外給藥(如通過注射，例如，推注注射或持續(xù)注入)并且可以在安瓿、載藥注射器、小量注入容器中以單位劑量形式存在或在多劑量容器中存在。如上所述，可以加入防腐劑以幫助維持劑型(dosageform)的保存期限。所述活性多肽和其它成分可以形成混懸劑、溶液、或者油或水載體中的乳劑，并且可以包含配方劑(formulatoryagents),如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？蛇x地，活性多肽和其它成分可以為粉末形式，通過無菌固體的無菌分離或通過從溶液凍干獲得，用于使用前與合適的載體(如無菌、不含致熱原的水)構(gòu)成。這些制劑可以包含藥學(xué)上可接受的載體、運(yùn)載體和佐劑，其在本領(lǐng)域是熟知的。可以例如，利用一種或多種從生理學(xué)^見點(diǎn)可接受的有才幾溶劑制備溶液，所述溶劑選自，除水外，溶劑，如丙酮、乙醇、異丙醇、乙二醇醚(glycolethers)(如以名稱"Dowanol"售賣的產(chǎn)品)、聚二醇(polyglycols)和聚乙二醇、短鏈酸的C^-C4烷基酯、乳酸乙酯或乳酸異丙酯、脂肪酸甘油三酯(如以名稱"Miglyol"銷售的產(chǎn)品)、豆蔻酸異丙酯、動(dòng)物油、礦物油和植物油及聚硅氧烷。如果必要，可以加入佐劑，所述佐劑選自抗氧化劑、表面活性劑、其它防腐劑、成膜劑、角質(zhì)軟4t劑或粉刺消溶劑(comedolyticagent)、香料、調(diào)味劑和著色劑?？梢约尤肟寡趸瘎┤?又丁基氫醌、丁基化的羥基茴香醚(butylatedhydroxyanisole)、丁基化的羥基甲苯和a-生育酚及其衍生物。在一些實(shí)施方式中，所述多肽、其變體或片段被配制為殺微生物劑，其局部地給藥或給藥到粘膜表面，如陰道、直腸、眼、鼻和嘴。對于局部給藥，治療劑可以如本領(lǐng)域已知的那樣配制，用于直接應(yīng)用到靶區(qū)域。主要調(diào)節(jié)用于局部應(yīng)用的形式采用例如乳膏、乳、凝膠、分散劑或微乳、增裯到更大或更小程度的洗劑、浸漬墊(impregnatedpads)、軟膏劑或粘著劑(sticks)、氣霧劑劑型(如，噴霧劑或泡沫體)、皂、洗滌劑、洗劑或皂塊的形式。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的多肽可以被配制為陰道乳膏或殺微生物劑以便局部應(yīng)用。為此目的，其它常見形式包括傷口繃帶、涂覆的繃帶或其它聚合物覆蓋物、軟膏劑、乳膏、洗劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、以及氣霧劑。因此，本發(fā)明的治療肽可以經(jīng)由貼片(patches)或繃帶遞送用于皮膚給藥?？蛇x地(alternatively),所述多肽可以被配制為粘著聚合物如聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/醋酸乙烯酯共聚物的部分。對于長期應(yīng)用，利用微孔和/或透氣性襯里層壓制件(breathablebackinglaminates)可能是希望的，因此皮膚的水合或浸漬可以被最小化。襯里層可以為任何合適的厚度，其將提供希望的保護(hù)和支持功能。合適的厚度通常為約10到約200微米。軟膏劑和乳膏可以，例如與水或油基配制，外加合適的增稠劑和/或膠凝劑。洗劑可以與水或油基配制并通常還包含一種或多種乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑、或著色劑。活性肽也可以經(jīng)由離子電滲(iontophoresis)遞送，如美國專利Nos.4,140,122;4,383,529;或4，051,842中披露的。局部制劑中存在的本發(fā)明的治療劑的重量百分?jǐn)?shù)將依賴于各種因素，但通常為所述制劑的總重的0.01%到95%,典型地為重量的0.1-85%。滴劑，如滴眼劑或滴鼻劑，可以在水或非水基中與所述多肽、其變體或片段的一種或多種配制，還包含一種或多種分散劑、增溶劑或懸浮劑。液體噴霧劑可以/人加壓包中方^f更地遞送。滴劑可以經(jīng)由簡單的眼滴管-帽化瓶(dropper-cappedbottle)、或經(jīng)由適于逐滴遞送液體內(nèi)含物的塑沖牛，阮、經(jīng)由特別成形的閉合包(closure)遞送。所述多肽、其變體或片段可以進(jìn)一步配制用于嘴或喉中局部給藥。例如，活性成分可以配制為進(jìn)一步包含增味基(flavoredbase)(通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)的錠劑；包含惰性基中的組合物的軟錠劑(pastilles),如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠；以及包含合適的液態(tài)載體中的本發(fā)明的組合物的漱口水。本發(fā)明的藥物制劑可以包括作為任選成分的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、增溶劑或乳化劑、以及本領(lǐng)域可獲得的類型的鹽。這樣的物質(zhì)的實(shí)例包括生理鹽水溶液，如生理緩沖鹽水溶液和水。用在本發(fā)明的藥物制劑中的載體和/或稀釋劑的特別非限制性實(shí)例包括水和生理上可接受的緩沖鹽水溶液，如磷酸緩沖鹽溶液，pH7.0-8.0。本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子還可以4皮給予呼吸道。因此，本發(fā)明還提供了用在本發(fā)明的方法中的氣霧劑藥物制劑和劑型(dosageforms)。通常，這樣的劑型包括有效治療或預(yù)防感染的臨床癥狀的量的本發(fā)明的至少一種試劑。已經(jīng)按照本發(fā)明的方法治療的一種或多種感染癥狀的任何統(tǒng)計(jì)上顯著的減弱;故認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的這樣的感染的治療?？蛇x地，為了通過吸入或吹入給藥，所述組合物可以采取干粉的形式，例如治療劑與合適的粉末基如乳糖或淀粉的粉末混合物。所述粉末組合物可以在例如膠嚢或藥筒、或例如，明膠或泡罩包裝中以單位劑型存在，從其中粉末可以借助吸入器、吹入器、或定量吸入器被給予(參見,例如在Newman,S.P.inAerosolsandtheLung,Clarke,S.W.andDavia,D.eds.,pp.197-224,Butterworths,London,England,1984中披露的加壓定量吸入器(MDI)和干粉吸入器)。本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子在以氣霧劑或吸入形式給藥時(shí)還可以在水溶液中給藥。因此，其它氣霧劑藥物劑型可以包括，例如，生理上可接受的緩沖鹽溶液，包含約0.001mg/mL到約100mg/mL之間的特異性用于要治療的指征或疾病的一種或多種本發(fā)明的肽。在液體中不溶或懸浮的細(xì)碎固體肽或核酸顆粒形式的干氣霧劑也可以用在本發(fā)明的實(shí)踐中。本發(fā)明的多肽可以配制為樸粉并包括細(xì)碎的顆粒，所述顆粒具有約1到5pm,可選;也約2到3pm的平均粒度。細(xì)石爭的顆粒可以利用本領(lǐng)域熟知的4支術(shù)通過磨石爭和篩子過濾制備。所述顆?？梢酝ㄟ^吸入預(yù)定量的細(xì)碎的物質(zhì)給藥，其可以為粉末的形式。將認(rèn)識(shí)到包含在每個(gè)劑型的個(gè)體氣霧劑劑量中的活性成分的單位含量其本身不需要構(gòu)成用于治療特定感染、適應(yīng)癥或疾病的有效量，因?yàn)楸仨毜挠行Я靠梢酝ㄟ^給予多個(gè)劑量單位實(shí)現(xiàn)。此外，有效量可以利用少于劑型中的劑量，單獨(dú)地或系列地給藥來達(dá)到。用于通過吸入給藥到上(鼻)或下呼吸道的本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子從噴霧器或加壓包或其它遞送氣霧劑噴霧的方便裝置方便地遞送。加壓包可以包括合適的推進(jìn)劑，如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，可以通過提供閥門以遞送計(jì)量的量來測定劑量單位。噴霧器包括而不限于美國專利Nos.4,624,251;3,703,173;3,561,444;和4,635,627中描述的那些。本文披露的類型的氣霧劑遞送系統(tǒng)可以從包括FisonsCorporation(Bedford,Mass.)、ScheringCorp.(Kenilworth,NJ)和AmericanPharmosealCo.,(Valencia,CA)的多個(gè)商業(yè)源獲得。對于鼻內(nèi)給藥，所述治療劑還可以經(jīng)由滴鼻劑、液體噴霧、如經(jīng)由塑料瓶霧化器(atomizer)或定量吸入器給藥。典型的霧化器是Mistometer(Wintrop)和Medihaler(Riker)。本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子還可以與一種或多種已知的治療劑一起使用，所述治療劑如疼痛《爰解劑(apainreliever);抗病毒劑；抗菌劑；抗癌劑；抗炎劑；抗組胺劑；支氣管擴(kuò)張劑及其合適的組合，無論用于所述的疾病或一些其它疾病。本發(fā)明還提供了制造的制品(anarticleofmanufacture),包括本發(fā)明的藥物組合物或多肽，標(biāo)記用于抑制微生物的生長或標(biāo)記用于治療如本文所述的那些食物-傳播疾病或性傳播疾病。這樣的制造的制品包括包含本發(fā)明的藥物組合物或多肽以及其片段、變體或衍生物的容器、以及用于食物-傳播疾病或性傳播疾病的治療的這樣的組合物或多肽的使用說明書。所述使用說明書可以為包括在包裝材料中或被打印在包裝材料上的標(biāo)簽的形式。冬神jg合參和夯造^翔品在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了制造的制品，其包括包含本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子的組合物。這樣的制品可以為食物包裝材料。非限制性實(shí)例包括外殼(casing);軟質(zhì)塑料；堅(jiān)硬紙板、紙張、以及盒子形式的木材制品(woodproductsinboxes);軟質(zhì)紙張，如袋子；剛性金屬，罐和桶形式；軟質(zhì)金屬，如鋁箔；結(jié)合紙、塑料和箔的層壓材料或多層材料；玻璃罐和瓶；以及塑并+罐和瓶。本發(fā)明的肽或組合物在包裝材津+的制造期間可以;故并入食品包裝材料。所述肽或組合物可以一皮并入包裝材料的基質(zhì)中或者它可以用作包裝材料內(nèi)表面的涂層?？梢园ū景l(fā)明的多肽、變體或片,殳的制品可以為新鮮或加工的、或預(yù)先包裝的食物物品。非限制性實(shí)例包括罐頭食品、冷凍食品、脫水食品、預(yù)先包裝的肉類、部分預(yù)制食品、即食食品(ready-to-servefoods)和干式混合物(drymixes)。包括本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子的組合物可以為包含本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子的被封裝的(encapsulated)粉末或噴霧液的形式。包括本發(fā)明的多肽的組合物可以包括食品添加劑如另外的抗微生物劑、抗氧化劑、天然或人工色素、天然或人工香料或香。未增強(qiáng)劑(flavororflavorenhancer)、漂白劑、螯合劑、營養(yǎng)添加劑、增稠劑或穩(wěn)定劑、或其任何組合。所述食品添加劑可以為丙酸鈣、沒食子酸丙酯、過氧化物、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、硫胺素、核黃素、尼克酸、卵磷脂、安賽蜜-K(acesulfame-K)、醋酸、過氧化丙酮、己二酸、瓊脂、藻酸、磷酸鋁鉀、硫酸餒、淀粉酶、胭脂樹提取物(annattoextract)、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯(ascorbylpalmitate)、阿斯巴甜(aspartame)、苯曱醛、過氧化苯曱酰、p-胡蘿卜素、丁基化羥基茴香醚(BHA)、丁基化羥基曱苯(butylatedhydroxyltolene)(BHT)、生物素、溴酸鐘、咖啡因、氯化鈣、酪蛋白釣、碘酸鈣、泛酸鈣、磷酸釣、丙酸鈣、糖精鈣、石圭酸釣、硬脂酰乳酸4丐、^L酸4丐、羧曱基纖維素、角豆膠(carobbeangum)、卡拉膠(carrageenan)、鹿角菜、加洛巴蠟、纖維素膠(羧甲基纖維素)、二氧化氯、檸檬酸、鈷胺素、氰鈷胺素、谷物糖漿(cornsyrup)、谷物糖漿固體、糊精、右旋糖、葡萄糖、甘油二酯和單甘油酯、石粦酸二鉀、乙二胺四乙酸二鈉、鳥苷酸二鈉(disodiumguanylate)、月幾苷酉臾二4內(nèi)(disodiuminosinate)、乙二胺四乙酉臾、酒石黃(FD&C黃存5)、FD&C黃存6、乳酸鐵、氧化鐵、磷酸鐵、鐵鈉、硫酸鐵、氟化物、葉酸(foladn)或葉酸(folicacid)、果糖(左旋糖)、富馬酸、fungaryl蛋白酶、紅藻膠(furcelleran)、明膠、葡萄糖、甘油(glycerin/glycero1)、單硬脂酸甘油酯、瓜爾豆膠、阿拉伯膠、尼泊金庚酯(heptylparaben)、高果糖、鹽酸、過氧化氬、水解植物蛋白、轉(zhuǎn)化酶、軟化糖、碘、檸檬酸異丙酯、L-半胱氨酸(L-cystein)、乳清蛋白、乳酸、lactobacillusbulgaricus、乳糖、卵磷脂、左旋糖(levulos)、甘草、刺槐豆膠(locustbeangum)、碳酸鎂、蘋果酸、甘露醇、氨茴酸甲酯、磷酸一鈣、單酸甘油酯、谷氨酸一鈉、單硬脂酸酯(monostearate)、硝酸鹽和亞硝酸鹽、肉豆蔻、羥基硬脂津青(oxystearin)、；乏醇(pantothenylalcohol)、尼泊金曱酉旨(menthylparabens)、尼泊金丙酉旨(propylparabens)、尼泊金庚酉旨(heptylparabens)、礦脂、磷酸、聚右旋糖、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、硫酸鋁鉀、亞硫酸氳鉀、溴酸鉀、碳酸鉀、檸檬酸鉀、碘酸鐘、焦亞石危酸鐘、磷酸鐘、山梨酸鐘、丙酸酯(propionates)、丙酸、沒食子酸丙酯、丙二醇、焦磷酸鹽、奎寧、糖精、氯化鈉、硝石、二氧化娃焦碌酸鈉(silicondioxidesodiumacidpyrophosphate)、藻酸鈉、石舞酸鋁鈉、抗壞血酸鈉、苯曱酸鈉、>暖酸氬鈉、亞石危酸氫鈉、酪蛋白酸鈉、4寧4蒙酸鈉、異4元壞血酸鈉(sodiumerythorbate)、焦亞碌^酸鈉、硝酸鈉/亞硝酸鈉、；舞酸鈉、丙酸鈉、焦^疇酸鈉、石圭鋁酸鈉、硬脂酰乳酸鈉(sodiumstearollactylate)、亞碌u酸鈉和亞石危酸氬鈉、硬脂酰富馬酸鈉、三聚磷酸鈉、山梨酸酯/山梨酸、山梨糖醇、大豆蛋白、氯化亞錫、淀粉、改性淀粉、蔗糖、蔗糖聚酯、亞硫酸鹽、糖、二氧化硫、丹寧、單寧酸、酒石酸、組織化(textured)植物蛋白、二氧化鈦、生育酚、黃蓍膠、磷酸三鈣、香子蘭、香草醛、乙基香草醛、醋、維生素C、維生素D、維生素E、乳清、黃原酸膠、或其任何組合。其它的制造制品可以包括治療有用的裝置，如陰道環(huán)、避孕套、繃帶或類似的治療裝置。所述裝置具有治療有效量的藥物組合物用于控制微生物的生長或存活。所述裝置可以與使用說明書一起被封裝在試劑盒中。所述藥物組合物包括治療有效量的本發(fā)明的至少一種多肽、變體或片段，以便控制感染。本發(fā)'勞W才法本發(fā)明的核酸分子和/或宿主細(xì)胞可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽、其變體或片段。因此，本發(fā)明提供了利用本發(fā)明的核酸分子和宿主細(xì)胞產(chǎn)生多肽、其變體或片段的方法。所述方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的核酸分子被引入其中的宿主細(xì)胞，以便產(chǎn)生所述多肽、變體或片段。所述方法可以進(jìn)一步涉及從所述培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞純化所述多肽、變體或片段。本發(fā)明的核酸分子的其它應(yīng)用包括用作用于檢測、鑒定或產(chǎn)生編碼本發(fā)明的多肽的核酸的雜交探針或引物。檢測、鑒定和產(chǎn)生本發(fā)明的核酸的方法在本領(lǐng)域是已知的并且也在本文中描述。這些方法包括而不限于核酸雜交技術(shù)，如southem、northern雜交、在文庫篩選中噔斑或集落(plaqueorcolony)雜交；PCR擴(kuò)增和核酸測序。本發(fā)明的多肽、其變體或片段還可以用作免疫原以產(chǎn)生特異性抗體。術(shù)語"抗體"指的是免疫球蛋白分子，如單克隆抗體，以及免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分。單克隆抗體是與特定抗原表位特異性結(jié)合的抗體分子群。免疫球蛋白分子的免疫學(xué)活性部分包括F(ab)和F(ab，)2片段。SEQIDNO:2的全長多肽或生物學(xué)活性片段如SEQIDNO:4均可以用于產(chǎn)生特異性抗體。直接針對本發(fā)明的多肽的抗體是特異性抗體，并且同樣地，相對于與SEQIDNO:4具有小于10%的同一性的多肽，它將以至少50%或更大的親和力，優(yōu)選約75%或更大的親和力、更優(yōu)選地，約90%或更大的親和力結(jié)合到SEQIDNO:4的多肽。本發(fā)明的免疫原性多肽、其變體或片段包括SEQIDNO:2或4的氨基酸序列的至少20、優(yōu)選30、40、50、60或多于60個(gè)相鄰氨基酸殘基，其包括所述多肽的表位，以便針對表位形成的抗體與所述多肽形成特異性免疫復(fù)合體。產(chǎn)生抗體的方法在本領(lǐng)域是熟知的。例如，多克隆抗體可以通過用本發(fā)明的純化多肽或其免疫原性片段免疫合適的哺乳動(dòng)物來制備。所述哺乳動(dòng)物可以為，例如，兔、山羊、或小鼠。所述多肽或抗原片段可以利用重組DNA技術(shù)表達(dá)、通過化學(xué)合成制備、或利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化:忮術(shù)純^。免疫后的合適時(shí)間，抗體分子可以乂人哺乳動(dòng)物，例如，/人哺乳動(dòng)物的血液或其它液體分離，并且利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)一步純化，所述技術(shù)包括而不限于利用硫酸銨沉淀、凝膠過濾色譜、離子交換色譜或親和色譜(利用蛋白A)。此外，哺乳動(dòng)物的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以被分離并用于制備分泌對于本發(fā)明的多肽特異性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。用于制備分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的。參見，例如，KohlerandMilstein,Nature,256:495(1975)和Kozboretal.ImmunolToday,4:72(1983)。單克隆抗體也可以利用本領(lǐng)域已知的其他方法制備，如，例如，從重組DNA分子表達(dá)，或者利用本發(fā)明的多肽篩查重組組合免疫球蛋白文庫。因此，本發(fā)明還提供了制備抗體的方法，包括用SEQIDNO:2或4的免疫原性片段免疫非人類的動(dòng)物。這樣產(chǎn)生的抗體可以用于鑒定和純化本發(fā)明的多肽，包括鑒定作為SEQIDNO:2或4的等位基因變體的本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或者由此的核酸分子可以用作如上所述的殺微生物劑或微生物抑制劑。它可以用于減少或抑制微生物的存活或生長。術(shù)語"抑制"包括任何可^r測的量的減少，例如，5%、10%、20%、40%或超過40%,并且可以通過計(jì)數(shù)，如細(xì)菌培養(yǎng)或病毒效價(jià)(viraltiter)、或者通過評估與微生物感染有關(guān)的一種或多種癥狀來測定。與微生物(如細(xì)菌、酵母或原生動(dòng)物)感染有關(guān)的癥狀在本領(lǐng)域是已知的。這樣的癥狀對于特定的感染性微生物和導(dǎo)致的疾病是獨(dú)特的?？梢允褂帽景l(fā)明的多肽來對抗的疾病包括而不限于食物-傳播的疾病和性傳纟番疾病(STD)。本發(fā)明的多肽對其具有活性的微生物包括原核和真核細(xì)胞，如革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌、酵母和原生動(dòng)物。非限制性實(shí)例包4舌ZJWen力mowoqyfogewes、金黃色葡萄3求菌、大腸才干菌、A7e6w'e〃a戸ewwom'ae、鼠傷寒沙門氏菌、綠腺軒菌、/Vo/ew^脂'ra6Ws、cam.gemYa/z'i/m、L^eap/"扁awrea/j^'cww、白色念珠菌、TWc/zomowwv(3gz'wa/"、7Ve/owew(2/a〃z.(iwm或沙、目艮衣原、體、或酉臾敗有才幾體(spoilageorganism)。針對臉^m."gowcw/zoeae(ATCC10150)和^reop/(2柳acamgemto/^w(ATCC51252)的本發(fā)明的多肽的最小抑制濃度(MIC)的實(shí)例為至少約0.25iliM、更優(yōu)選至少約0.10jaM、最優(yōu)選至少約0.06luM的MIC。本發(fā)明的多肽針對各種微生物的MIC的其它實(shí)例總結(jié)在表4中。MIC抗微生物活性指的是在所選的孵育時(shí)間后通過肉眼判斷的微生物的生長的完全抑制。用于測定MIC的方法是Sangetal.,InfectionandImmunity,2611-20(May,2005)中描述的方法。"脊推動(dòng)物"包括而不限于魚、兩棲動(dòng)物、鳥以及哺乳動(dòng)物。因此，脊推動(dòng)物可以為狗、貓、牛、馬、羊、猴、黑猩猩、大猩猩、小鼠、豬、雞、魚和人。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了限制脊推動(dòng)物中微生物感染的傳播的方法。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于治療脊推動(dòng)物中的微生物感染的方法。所述微生物感染可以導(dǎo)致皮膚感染、食物運(yùn)載的疾病或性傳播疾病。非限制性實(shí)例包括淋病、才條毒、衣原體病、食物中毒、念珠菌病、肺炎、支氣管炎、口損傷、滴蟲病、或口的鵝口裔或霉菌性陰道炎(oralorvaginalthrush)。因此，本發(fā)明還提供了用于治療與上面鑒定的微生物的任何一種的感染有關(guān)的疾病4夫況的方法。量的本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子接觸?？梢灾С治⑸锏纳L或存活的成分可以以多種方式與有效量的本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子接觸。例如，如果所述成分是食物物品，可以將本發(fā)明的多肽直接加入食物，它可以被并入包裝材料的基質(zhì)或者它可以被涂覆到包裝材料上，在這種情況下，所述多肽可以在儲(chǔ)存期間、在封裝材料溶解后，與濕氣接觸后或在預(yù)定溫度時(shí)被釋放。如果所述成分是體液，可以將本發(fā)明的多肽直接加入體液。脊推動(dòng)物可以以多種方式與所述多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子接觸，所述方式包括而不限于利用下面的途徑給藥口服、腸胃外(包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)和腹膜內(nèi))、直腸、陰道、皮膚、經(jīng)皮(transdermal)(局部)、經(jīng)粘膜(transmucosal)、胸內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)(呼吸)途徑。給藥的方式可以通過注射、利用泵或任何其它合適的機(jī)制。依賴于，例如，接受者的生理?xiàng)l件、給藥的目的是治療性的或預(yù)防性的、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他因素，本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子可以以單劑量、多劑量、以連續(xù)或間歇方式給予脊推動(dòng)物。本發(fā)明的肽的給予可以為在預(yù)先選擇的時(shí)期內(nèi)基本上連續(xù)的或者可以為一系列間隔的劑量。局部和全身給藥是預(yù)期的。給予脊推動(dòng)物的劑量可以為任何適于減少或防止感染或治療與感染相關(guān)的至少一種癥狀的量。確定合適的劑量的一些因素對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的并且可以用常規(guī)試驗(yàn)確定。例如，可以利用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)并通過利用化學(xué)、藥理學(xué)和毒物學(xué)領(lǐng)域已知的數(shù)學(xué)建模技術(shù)進(jìn)行物理化學(xué)、毒物學(xué)和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)的測定。治療應(yīng)用和劑量給藥方案可以從這樣的技術(shù)的結(jié)果并通過應(yīng)用合適的藥動(dòng)學(xué)和/或藥效模型推斷。其它因素將依賴于個(gè)體患者的參數(shù)，包括年齡、身體狀態(tài)、尺寸、重量、要治療的狀況、狀況的嚴(yán)重性、以及任何同時(shí)進(jìn)行的治療。劑量還將依賴于所選的試劑和是否預(yù)防或治療要被實(shí)現(xiàn)、以及是否所述試劑是化學(xué)修飾的。這樣的因素可以由臨床醫(yī)師容易地確定。要給予脊推動(dòng)物的精確量將是主治醫(yī)生的責(zé)任。然而，為了達(dá)到希望的效果，本發(fā)明的試劑、或其組合，可以作為單獨(dú)的或分開的劑量給予，例如劑量為體重的至少約0.01mg/kg到約500到750mg/kg、至少約0.01mg/kg到約300到500mg/kg、至少約0.1mg/kg到約100到300mg/kg或至少約lmg/kg到約50到100mg/kg，雖然其它劑量可以提供有益的結(jié)果。包括在單位劑量內(nèi)的本發(fā)明的給定多肽、其變體或片段的絕對重量可以廣泛;也變4b。例如，可以》會(huì)予約0.01到約2g或約0.1到約500mg的本發(fā)明的至少一種多肽或多種多肽。可選地，單位劑量可以/人約O.Olg到約50g、乂人約O.Olg到約35g、/人約O.lg到約25g、/人約0.5g到約12g、從約0.5g到約8g、從約0.5g到約4g、或從約0.5g到約2g變化。本發(fā)明的多肽、其變體或片段的每日劑量也可以變化。這樣的每曰劑量可以在，例如，從約O.lg/天到約50g/天、從約O.lg/天到約25g/天、從約O.lg/天到約12g/天、從約0.5g/天到約8g/天、從約0.5g/天到約4g/天、以及從約0.5g/天到約2g/天的范圍內(nèi)變化。本發(fā)明的多肽、其變體或片段、或用于它們的核酸分子可以單獨(dú)使用或與第二藥物結(jié)合使用。第二藥劑可以為已知的抗菌劑，如|3-內(nèi)酰胺、大環(huán)內(nèi)酯或其它抗生素，如阿奇霉素(Azithromycin)、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、和紅霉素；抗真菌劑，如克霉唑(clotrimazole)、制霉菌素、氟康唑(fluconazole)、酮康唑(ketoconazole)、兩性霉素B、卡泊芬凈(caspofungin)、或伏立康峻(voriconazole);對原生動(dòng)物有歲支的i式劑，如，例^口，曱石肖p坐(Metronidazole)或-,確坐(tinidazole)。所述第二藥物還可以為抗病毒劑，如阿巴卡韋(Abacavir)、阿昔洛韋(Acyclovir)、金岡'J烷胺(Amantadine)、去羥肌苷(Dida歸ine)、恩曲他濱(Emtricitabine)、恩夫韋地(Enfuvirtide)、恩替卡韋(Entecavir)、更昔洛韋(Ganciclovir)、力口德西(Gardasil)、拉米夫定(Lamivudine)、奈韋拉平(Nevirapine)、奈非那韋(Nelfinavir)、奧司他偉(Oseltamivir)、利巴韋林(Ribavirin)、金剛乙胺(Rimantadine)、利托那韋(Ritonavir)、司他夫定(Stavudine)、伐昔洛韋(Valadclovir)、阿糖腺普(Vidarabme)、扎西他濱(Zalcitabme)、以及齊多夫定(Zidovudine)。第二藥物的有效量將遵循第二藥物制造商的建議、主治醫(yī)生的判斷，并將由Physician'sDeskReference中指示的對于量和給藥的方案和管理因素指導(dǎo)。治療方法的有效性可以通過以下來評估監(jiān)測脊推動(dòng)物如上所述的孩i生物感染的病征或癥狀、以及利用本領(lǐng)域已知的方法測定血液中存在的微生物的存在和/或量，如細(xì)胞計(jì)數(shù)，所述方法包括而不限于聚合酶鏈反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增或細(xì)胞培養(yǎng)。本發(fā)明在下面的實(shí)施例中被進(jìn)一步描述，其不限制權(quán)利要求中所述的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l滋辨7-19(^47^差^^#定希^;鏖利用NationalCenterforBiotechnologyInformationGenBank建立K9CATH的cDNA鑒定。人類hCAP18/LL-37(GenBank編號(hào)NM004345)、牛導(dǎo)管素1(NM174825)、以及豬PR-39(L23825)的互補(bǔ)DNA序列一皮對準(zhǔn)，沒計(jì)簡并引物對以特異性革巴向編碼相應(yīng)多肽的pre-proregion的保守序列。引物(正向，5，-TCACTGKTGCTYCTGCTGCT-3，(SEQIDNO:39),和反向，5，-TGGCCTGGTYSARGGTSACTGT-3，(SEQIDNO:40);其中Y=C或T,K=G或T,S=C或G,以及R=A或G)分別相應(yīng)于位置40-59和241-262(表3),相對于人類基因的翻譯起始密碼子。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>利用設(shè)計(jì)的引物和來自篩選的組織的總RNA作為模板，進(jìn)行一步RT漏PCR反應(yīng)(AccessQuickTMRT-PCR系統(tǒng)，Promega),產(chǎn)生K9CATHcDNA的片段。用K-StateSequencingandGenotypingFacility(Manhattan,KS)的ABI3700DNAAnalyzer對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，并確認(rèn)編碼與已知導(dǎo)管素具有同源性的開放閱讀框(ORF)。為獲得全長cDNA,使用改良的cDNA末端的快速擴(kuò)增(RACE)方案，其選擇非-截短的5'-帽化mRNA(Ambion,FirstChoiceRLM-RACE試劑盒)。通過總RNA(獨(dú)立地來自骨髓、脾和睪丸)的逆轉(zhuǎn)錄、隨后借助相應(yīng)于5，-端適配體序列的巢式引物(nestedprimers)和兩個(gè)巢式反義引物(即上述反向引物，及內(nèi)部反向引物5'-GACTGTCCCTTCACACTGTTTCAC-3，(SEQIDNO:42))進(jìn)行兩輪PCR,獲得5，-RACE。類似的方案用于3，-RACE,借助相應(yīng)于3，-端適配體的巢式引物和兩個(gè)巢式有義引物(即，上述正向引物和內(nèi)部正向引物5，-CCTTAGCTACAGGGAGGCTGTG-3，(SEQIDNO:41》(表3)。巢式PCR產(chǎn)物通過基于柱的PCR純化試劑盒(Qiagen)一皮純化，并利用pGEM-TEasyVectorSystem(Promega)^皮克隆入質(zhì)粒。5'隱或3，-cDNARACE序列產(chǎn)生自對至少5個(gè)克隆的測序。隨后通過連接5'-和3'-序列并刪除適配體和重疊區(qū)產(chǎn)生全長cDNA。RT過程的效率通過確保管家基因GAPDH的可比較的水平(用PCR擴(kuò)增)被標(biāo)準(zhǔn)化?；诟叨缺Ｊ氐腸athelin-結(jié)構(gòu)域序列，利用人、牛和豬cathelddins的對準(zhǔn)的序列設(shè)計(jì)成組引物。這組引物成功地?cái)U(kuò)增了來自人、豬、和犬骨髓細(xì)胞的導(dǎo)管素序列。來自犬骨髓的擴(kuò)增帶表現(xiàn)出與人LL-37和豬PR-39的帶類似的尺寸范圍(圖1A)。來自犬骨髓mRNA的cDNA擴(kuò)增子的序列表現(xiàn)出與馬、豬和人導(dǎo)管素的相關(guān)區(qū)超過80%的相似性(Agerberthetal.,Blood,96:3086(2000);Scocchietal.,FEBSLett.,417:311(1997);Scottetal.,J.Immunol.,169:3883(2002))。利用基于犬cDNA序列的基因-特異性引物，推定的犬導(dǎo)管素的全長cDNA序列#:鑒定。犬導(dǎo)管素的完全cDNA序列和翻譯的肽示于圖1B中。犬cDNA分子跨越630bp,具有短5，-和3，-非翻譯區(qū)，并且主要由519bp-編碼區(qū)占據(jù)。所述cDNA編碼172個(gè)氨基酸殘基的預(yù)測的肽。借助SignalIP和PSORT(ExPASy,http:〃au.expasy.org/tools/弁proteome)的i十200680049565.2說明書第44/64頁算推斷表明29-氨基酸信號(hào)肽位于其N-末端。為了測定K9CATH的mRNA表達(dá)，按照由KansasStateUniversityInstitutionalAnimalCareandUseCommittee^人可的方法/人臨床^:康的狗收集組織樣品。收集后立即將所有樣品置于液氮中并儲(chǔ)存在-135°C直到使用。所有的狗在組織收集前進(jìn)行徹底的臨床檢查和常規(guī)篩查，包括血液學(xué)、血液化學(xué)、和尿液分析。所有的臨床試-瞼結(jié)果在正常限度內(nèi)。從Clontech(PaloAlto,CA)購買人骨髓RNA，并獲得豬骨髓RNA(Wuetal.,Infect.Immun.,68:5552(2000))。在研磨液氮中的冷凍組織后用TRIRegent(Sigma國Aldrich,St.Louis,MO)提取總RNA。一步RT-PCR用于檢測K9CATHmRNA的表達(dá)[30]。筒短地，用RQ1不含RNA酶的DNA酶I(Promega)處理總RNA以去除任何基因組DNA污染。隨后將RNA樣品(250ng)用在具有0.1濃度的每個(gè)有義和反義引物(即，RACE反應(yīng)中所用的巢式基因特異性引物)的25RT-PCR反應(yīng)混合物中。利用AccessQuickRT-PCRSystem試劑盒(Promega)進(jìn)行常規(guī)一步RT-PCR。進(jìn)行互補(bǔ)-DNA合成和預(yù)變性1個(gè)循環(huán)，48。C45分鐘，95。C3分鐘；進(jìn)行擴(kuò)增40(K9CATH)或25(甘油醛3-石舞酸脫氬酶，GAPDH)個(gè)循環(huán)，95°C30秒，55°C30秒，和72°C30秒，在25反應(yīng)混合物中在72。C進(jìn)行最后的延長達(dá)10分鐘。在擴(kuò)增后，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析10nL的每個(gè)反應(yīng)混合物，在溴化乙錠染色后條帶被可視化。因此，通過半定量RT-PCR分析評估健康犬組織中K9CATHmRNA的表達(dá)。如圖2所示，犬導(dǎo)管素主要在骨髓前體細(xì)胞(骨髓)中表達(dá)，并且在脾、肝和睪丸中更低程度的表達(dá)。在健康肺、腎和腸組織中檢測到最低的K9CATH表達(dá)。來自骨髓、脾、肝、及睪丸的RT-PCR擴(kuò)增子一皮克隆入pGEM-TEasyVector,如先前所述的用于RACE產(chǎn)品，并且被測序。所有的擴(kuò)增帶被確認(rèn)為與實(shí)施例1中相同的導(dǎo)管素分子。通過在NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)力占點(diǎn)上Oittp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/),利用TBLASTN程序(Altschuletal.,J.Mol.Biol.,215:403(1990))(利用默認(rèn)設(shè)置)，將K9CATH的推斷的氨基酸序列用于在非冗余的(nonredundant)(NR)、高通量(throughput)基因組序歹'J(HTG)、及GenBank中的全基因組鳥槍序列(wholegenomeshortgunsequence)(WGS)數(shù)據(jù)庫中尋找翻譯的犬基因組序列。為了得到K9CATH基因結(jié)構(gòu)，包含犬基因的基因組序列從GenBank找回(retrieved)并通過利用NCBI站點(diǎn)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey)上的Spidey程序與其cDNA序歹ij比較。通過利用MapViewer程序(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview)揭示K9CATH基因的染色體位置。通過在目前GenBank中可獲得的全部犬基因組序列中查找預(yù)測的K9CATH肽序列鑒定了兩個(gè)WGS序列AAEX02021310,其包含完整的K9CATH序列及AACN010698115，其僅包括氨基酸殘基67-126。WGS序列AAEX02021310因此被用于與全長K9CATHcDNA序列對準(zhǔn)以利用Spidey程序獲得基因結(jié)構(gòu)。如圖4所示，K9CATH的開放閱讀框被分別為627、137、和575bp的三個(gè)內(nèi)含子分隔，其使人聯(lián)想到(reminiscentof)其它哺乳動(dòng)物導(dǎo)管素基因(Niyonsabaetal.,Curr.DrugTargetsInflamm.Allergy,2:224(2003);Niyonsabaetal.,Immunology,106:20(2002);Gennaroetal.,Biopolymers,55:31(2000))。推定的成熟序列由最后的外顯子編碼，而最初的三個(gè)外顯子(thefirstthreeexons)編碼信號(hào)和前序歹'J(pro-sequences)。這個(gè)基因組構(gòu)在調(diào)查的所有哺乳動(dòng)物物種中是非常保守的(Tomasinsigetal.,Curr.ProteinPept.Sci.,6:23(2005);Gennaroetal.,Biopolymers,55:31(2000》。利用MapViewer程序?qū)9CATH基因定位在染色體20上(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview)。每個(gè)夕卜顯子和內(nèi)含子的長度如圖4所示；還示出了由每個(gè)外顯子編碼的氨基酸序列。Cathelin前區(qū)中的四個(gè)半胱氨酸加有下劃線，成熟抗;微生物肽序列為4且體加下劃線。犬導(dǎo)管素的核香酸序列已經(jīng)在GenBankDatabase中注冊，編號(hào)為AY392089。注意到導(dǎo)管素的外顯子-內(nèi)含子邊界在哺乳動(dòng)物物種中也是高度保守的(數(shù)據(jù)未示出)?；瘜W(xué)合成由成熟K9CATH的C-末端38-氨基酸構(gòu)成的肽(BioMerTechnology,ConcordCA.)。這個(gè)肽的序列，指定為SEQIDNO:4,如下RLKELITTGGQKIGEKIRRIGQRIKDFFKNLQPREEKS。合成分子在RP-HPLC上單獨(dú)的峰中洗提并通過質(zhì)譜分析確證。所述肽的最終純度〉99%,分子量為4512.1。將所述肽凍干并以2mg/mL(約0.5mM)溶解在0.01%醋酸中作為儲(chǔ)備溶液并在-135。C儲(chǔ)存直到使用。通過利用BCA蛋白分析試劑盒(PierceInc.,Rockford,IL)測定肽濃度。在抗微生物實(shí)-險(xiǎn)前將無菌人血清白蛋白(SigmaAldrich)加入所述肽溶液以達(dá)到0.1%的最終濃度。^^辨5-Jr9C4m^潛勘、浙為了測定K9CATH在膜-模擬環(huán)境中的二級結(jié)構(gòu)，在Jasco-715分光偏振計(jì)(spectrapolarimeter)中進(jìn)行圓二色性實(shí)'驗(yàn)。利用0.1cm光程長度的小池(path-lengthcell)在190-250nm范圍獲得光譜(Soulagesetal.,J.Biol.Chem.,276:34162(2001))。在25。C,每隔1nm收集光譜，每個(gè)點(diǎn)具有2秒的平均時(shí)間和lnm帶通。在具有不同濃度的三氟乙醇(TFE)(10%、20%、40%、及60%)或SDS膠束(0.25%和0.5%)(并且沒有TFE)的50mM磷酸鉀緩沖液中測量所述肽。平均殘基橢圓率(MRE)被表示為[e]MRE(deg.cm2.dmor1)。從222nm處二色性最小值估計(jì)a-螺旋含量(Chenetal.,Biochemistry,13:3350(1974))。CD光譜學(xué)測量顯示K9CATH在水溶液中采取完全的無規(guī)巻曲構(gòu)象，而沒有任何的a-螺旋結(jié)構(gòu)。然而，所述肽表明隨著螺旋誘導(dǎo)劑TFE的濃度增加，螺旋構(gòu)象增強(qiáng)，在60%TFE中表現(xiàn)出72%螺旋度(圖5)。類似地，在脂質(zhì)-模擬環(huán)境中，在0.1%SDS的存在下，K9CATH采取具有30%螺旋含量的結(jié)構(gòu)。還經(jīng)由同源建才莫(homologymodeling)產(chǎn)生導(dǎo)管素肽的結(jié)構(gòu)才莫型。經(jīng)由與CAP18的NMR溶液結(jié)構(gòu)的對準(zhǔn)預(yù)測革巴結(jié)構(gòu)(Chenetal.,FEBSLett,370:46(1995)。經(jīng)由Clustal-W程序(Thompsonetal,,NucleicAcidsRes.，22:4673(1994)),利用Blosum30替換矩陣，采用10的空位-開放罰分(gap-openingpenaltyof10)和0.1的空位-擴(kuò)展罰分(gap-extensionpenaltyof0.1),進(jìn)4亍這兩個(gè)系纟克的最#刀的序歹寸只于準(zhǔn)。隨后經(jīng)由Modeller程序(Sanchezetal.,Meth.Mol.Biol.,143:97(2000)處理所獲得的對準(zhǔn)和相應(yīng)的三維CAP18肽結(jié)構(gòu)，以產(chǎn)生導(dǎo)管素耙標(biāo)的結(jié)構(gòu)預(yù)測。Modeller's默認(rèn)才莫擬退火循環(huán)(Modeller'sdefaultsimulatedannealingcycles)用于結(jié)構(gòu)細(xì)化。在所獲得的結(jié)構(gòu)上經(jīng)由SYBYL(SYBYL6.9.2,TRIPOSInc.,St.Louis,MO)進(jìn)行肽二級結(jié)構(gòu)和表面特征的分析，利用PSIPRED程序(McGuffinetal.,Bioinformatics,16:404(2000))證實(shí)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。通過與Capl8(PDBID:llyp)的NMR溶液結(jié)構(gòu)的對準(zhǔn)預(yù)測K9CATH的結(jié)構(gòu)。在兔和K9CATH結(jié)構(gòu)的序列對準(zhǔn)中關(guān)4建基序是保守的，尤其是針對兔序列中觀察到的a-螺旋的中心部分(圖6A)。這提供了合理的確信犬結(jié)構(gòu)的;[艮多應(yīng)當(dāng)采用類似的螺旋結(jié)構(gòu)(圖6B),近似圖6A頂部組(toppanel)中示出的。兔和犬表面模型的比較通過圖6A和B中的三維圖像示出。還注意到在兔和犬導(dǎo)管素的對準(zhǔn)螺旋部分內(nèi)，存在凈靜電特征方面的實(shí)質(zhì)區(qū)別兔結(jié)構(gòu)具有13個(gè)堿性殘基及4又)f又一個(gè)酸(在pH=7時(shí)凈電荷為+12),而犬的肽具有九個(gè)石咸性殘基和三個(gè)酸(凈電荷僅為+6)。這個(gè)區(qū)別可以導(dǎo)致這兩個(gè)導(dǎo)管素的環(huán)境偏好(environmentalpreferences)和潛在分子間聯(lián)系的明顯區(qū)別。最終，對于圖6A和B中所示的犬導(dǎo)管素結(jié)構(gòu)，人們觀察到不存在于觀察的兔模型中的7C-末端殘基(QPREEKS)不保留疏水/極性振動(dòng)模式(oscillationpattern),但是反而是整體上非常極性的。合起來看，K9CATH表現(xiàn)出與多個(gè)抗微生物肽共同的特征，如在中性pH時(shí)的正電荷和a-螺旋結(jié)構(gòu)?？傊脠A二色性(CD)和計(jì)算機(jī)3-維結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行了K9CATH的結(jié)構(gòu)分析。K9CATH的折疊采取a-螺旋構(gòu)象，其是天然抗微生物肽(Gennaroetal.,Biopolymers,55:31(2000))(包括導(dǎo)管素肽)中最常見的空間排列。支持這個(gè)論點(diǎn)的是疏水性和極性殘基之間的特征性振動(dòng)，具有與10/3a-螺旋扭轉(zhuǎn)相稱的頻率。如圖6中描述的三維圖像所示，這個(gè)振動(dòng)導(dǎo)致螺旋的并列的疏水和極性側(cè)的形成結(jié)構(gòu)特征表明親脂/疏水相互作用可以驅(qū)動(dòng)這些肽與類似的分子聚集或在膜表面聚集，利用它們的疏水側(cè)用于分子間結(jié)合，它們的極性側(cè)面向外，用于有利的溶劑相互作用。初步分析表明K9CATH由于比兔更純和連續(xù)的疏水表面將更服從這樣的行為。然而，可能最明顯的干擾兔導(dǎo)管素的疏水連續(xù)性的一個(gè)殘基(即，位置14中的賴氨酸)實(shí)際上反而可以參與結(jié)合的分子間鹽橋，其對于犬導(dǎo)管素是不可獲得的。K9CATH的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征是位于C-末端的七個(gè)額外的氨基酸殘基的存在。因?yàn)檫@些氨基酸是整體上非常極性的，沒有明顯的證據(jù)表明這些殘基應(yīng)當(dāng)維持所述結(jié)構(gòu)的最初31個(gè)殘基中存在的螺旋結(jié)構(gòu)；更合理地是認(rèn)為C-末端將是溶劑暴露的并且可能有點(diǎn)無序(圖6B)。先前的CD研究已經(jīng)表明a-螺旋的導(dǎo)管素肽的螺旋含量在30-90%的范圍內(nèi)，依賴于微環(huán)境(如，螺旋誘導(dǎo)劑的存在)和所述肽的起源[12]。類似地，目前的CD研究表明在分別為20%和60。/。TFE的存在下，K9CATH的a-螺旋含量在42%到72%的范圍內(nèi)。此外，在近似生理狀態(tài)的環(huán)境中(即，脂質(zhì)4莫擬)，K9CATH的a-螺旋含量更低，然而仍在來自其它哺乳動(dòng)物導(dǎo)管素報(bào)道的范圍內(nèi)。結(jié)合三維結(jié)構(gòu)分析和CD研究的結(jié)果，由此可以推斷K9CATH具有可誘導(dǎo)的a-螺旋結(jié)構(gòu)。由于最線性的導(dǎo)管素實(shí)際上主要為a-螺旋，這表明這些肽的寬泛的抗微生物譜直接與a-螺旋結(jié)構(gòu)相關(guān)，其可以促進(jìn)這些內(nèi)源性抗微生物肽與細(xì)菌膜的相互作用，由此導(dǎo)致治病孩i生物的迅速消除(Zanetti,J.Leukoc.Biol.,75:39(2004);Gennaroetal.,Biopolymers,55:31(2000);Zanettietal.,Curr.Pharm.Des.,8:779(2002);Ramanathanetal.,MicrobesInfect.,4:361(2002);Orenetal.,Biopolymers,47:451(1998》。豸磁辨6-K9C4Jg^戎凝i參承'^評估K9CATH針對廣譜微生物的抗微生物活性。用于抗微生物實(shí)驗(yàn)的K9CATH肽代表來自由外顯子4區(qū)編碼的完整成熟肽的預(yù)測的氨基酸序列(人cathecidin中的裂解位點(diǎn)用于預(yù)測犬導(dǎo)管素的裂解位點(diǎn))。評估的樣i生物為白色念珠菌ATCC11006和14053、大腸桿菌ATCC25922、700336、700378、和BAA-457、AT/由/e〃a戸謂omaeATCC10031、丄&fen》mo"oqyfogewesATCC19155、尸rc^ewswz>"/^7z'sATCC12453、綠膿桿菌ATCC10145、S"/wo股〃a五"/erz"6ifoATCC13076、鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311、金黃色葡萄球菌ATCC10832、/7rea/7/aswacawz.gew"a//wwATCC51252、"、及t7rea//cwwawea/;^cwwATCC27619。C.a/Znc"朋在土豆右旋糖瓊脂上過夜生長(35。C)并按照NCCSL標(biāo)準(zhǔn)管理(Pfalleretal.,ManualNCCLS#M27-A2,6thed.,Wayne,PA(2002))。f/.cawz.gew"(2"w附禾口wrea/7cww一皮j諸存在-20°C尿素肉湯(ureabroth)10B中(按照ATCC規(guī)格)并在實(shí)驗(yàn)前在5°C解凍一整夜。將所有其它細(xì)菌維持在37。C,胰酪胨(trypticase)大豆瓊脂(Difco,Detroit,MI)板上。通過將單細(xì)胞集落轉(zhuǎn)移到胰酪胨大豆肉湯(Difco)內(nèi)、隨后在37°C孵育并勻化3小時(shí)，培養(yǎng)中-對數(shù)階段的細(xì)菌。細(xì)菌沉淀(pellet)在900xg、4°C離心10分鐘后獲得、沖洗一次、隨后懸浮在10mM磷酸鈉緩沖液(PB，pH7.4,[Na+]=17.83mM)中。測定初始細(xì)菌濃度(Ferraroetal.,ManualNCCLS#M7-A6,6thed.,Wayne,PA(2003))。在600nm處的0.1的光密度(OD)時(shí)獲得108CFU/mL的初始細(xì)菌群。遵循NCCLS標(biāo)準(zhǔn)將C.a/^cara懸浮在10mMPB中到達(dá)用于初始108CFU/ml的0.5的McFarland標(biāo)準(zhǔn)(Pfalleretal.,ManualNCCLS#M27-A2,6thed.,Wayne,PA(2002)),除了建議的0.85%鹽溶液被10mMPB替換。在10mMPB中進(jìn)行所有的微生物系列稀釋以獲得103CFU/mL的工作稀釋度(workingdilutions)。改良的肉湯樣i稀釋方法(Pfalleretal.,ManualNCCLS#M27-A2,6thed.,Wayne,PA(2002》Fe認(rèn)oetal.,ManualNCCLS#M7-A6,6thed.,Wayne,PA(2003))用于測定K9CATH的抗微生物活性(Sangetal.,Infect.Immun.,73:2611(2005))。簡短地，將50K9CATH工作儲(chǔ)液(workingstock)加入微滴定板的孔中，其中25|aL的30mM鈉PB(pH7.4,[Na+]=53.49mM)、25|uLH20、及50pL微生物懸浮液已經(jīng)被預(yù)先組合。微滴定板在振蕩培養(yǎng)箱中37。C孵育2小時(shí)(100RPM),隨后加入150)iiL的相應(yīng)營養(yǎng)肉湯。通過建立最小抑制濃度(MIC)測定抗微生物活性，所述最小抑制濃度定義為其中微生物生長被阻止的最低濃度，由37。C孵育24小時(shí)后培養(yǎng)基(尿素肉湯10B)中缺乏濁度或顏色改變示出。處理的^fr病懸浮液(50pL)一皮點(diǎn)涂布(spot-plated)在巧克力瓊脂上，MIC定義為其中37。C，5%C02中孵育24小時(shí)后沒有發(fā)展的菌落的最低濃度。這被進(jìn)行，因?yàn)镸gowo廳/2oeae不表現(xiàn)濁度作為GC肉湯中生長的證明，還因?yàn)槠湓谝后w培養(yǎng)基中的高自溶活性。為了測定鹽對K9CATH抗微生物活性的影響，使用兩種代表性細(xì)菌，包括革蘭氏陰性ATCC25922和革蘭氏陽性丄.mo朋c少M(fèi)gew^ATCC19115。殺菌混合物的最終鈉濃度用NaCl調(diào)節(jié)為15、30、50、140、及300mM。此外，在O.Ol、0,1、1、和10(ig/mL評估脂多糖類(〖co/z0111:B4LPS;Sigma)對于K9CATH抗五.co/z活性的影響。在140mMNaCl時(shí)評估10、20、30、40、50、及75%的胎牛血清(FBS)的作用。所有的實(shí)-驗(yàn)以一式三份進(jìn)行。因此，為了測定K9CATH的抗微生物活性，相應(yīng)于全長成熟預(yù)測的氨基酸序列的38氨基酸肽被化學(xué)合成并用于所有的抗微生物實(shí)驗(yàn)。K9CATH有效地殺滅革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌、酵母、以及素肽的活性相當(dāng)(Balsetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95;9541(1998);Skerlavajetal.,J.Biol.Chem.,271:28375(1996);Yuetal.,J,Pept.Res.,60:1(2002);Murakamietal.,丄Immunol.,172:3070(2004);Shinetal.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,285:1046(2001))(表4)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>借助自NCCLS改良的肉湯樣i稀釋方法測定MICK9CATH對于C."/^ca朋的MIC高于分別為BMAP-27和SMAP-29的牛和綿羊?qū)Ч芩貓?bào)道的MIC[16,49],并且小于人類LL-37報(bào)道的MIC(Gennaroetal.,Biopolymers,55:31(2000);Murakamietal.,J.Immunol.,172:3070(2004))。同樣地，合成的犬導(dǎo)管素在殺滅/人造血源分離的C.a/6/ca似方面比從從陰道上皮分離的更有效，強(qiáng)烈建i義K9CATH在全身水平施加其廣泛的抗微生物作用。有趣地是，兩種性傳^番疾病細(xì)菌A^go"o^r/zoeae和^rea/7/as7m2c"m.ge/z'to/z'ww凈皮到目前為止才艮道的任何抗微生物肽的文件證明的最低濃度(0.0625jiM)殺滅，包括最近在狗中鑒定的睪丸-來源的卩-防御素(卩-defensins)(Sangetal.,Infect.Immun.,73:2611(2005))。鼠傷寒沙門氏菌和e"&nYz^fo(通常在食物中毒中涉及的細(xì)菌)也被K9CATH有效地殺滅。在這點(diǎn)上，K9CATH的抗微生物活性與其哺乳動(dòng)物同類物(congeners)—致(Gennaroetal.,Biopolymers,55:31(2000);Skerlavajetal.,J.Biol.Chem.,271:28375(1996);Yuetal.,J.Pept.Res.,60:1(2002);Shinetal.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,285:1046(2001》。尸.awwgz力wa乂于K9CATH的敏感性與鼠(Yuetal,,J.Pept.Res.,60:1(2002))、牛(Skerlavajetal.,J.Biol.Chem.,271:28375(1996))、和綿羊(Shinetal.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,285:1046(2001))導(dǎo)管素相當(dāng)，但是是人類LL-37的活性的三倍。相反，"wmm,—種重要的表皮病原體，在更高濃度(50pM)時(shí)被抑制，其表明K9CATH抗微生物活性集中在全身水平并且在皮膚的表面處程度更低。然而，人類導(dǎo)管素(LL-37)在相當(dāng)?shù)臐舛?〉64pM)4中制皮月夫5".ai/rez^(Murakamietal.,J.Immunol"172:3070(2004);Murakamietal.,J,DentRes,81:845(2002))。K9CATH的殺菌活性與針對五.co/z'和丄.wowocWogewM的體外實(shí)-驗(yàn)中所用的微環(huán)境的鹽濃度(15到300^M)無關(guān)(圖7)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與報(bào)道的來自人(LL-37)和牛(BMAP-27)的導(dǎo)管素的鹽-敏感活性形成對比(Gennaroetal.,Biopolymers,55:31(2000);Skerlavajetal.,J.Biol.Chem.,271:28375(1996);Yuetal.,J.Pept.Res.,60:1(2002);M歸kamietal.,J.Immunol.,172:3070(2004))。此外，本數(shù)據(jù)表明在5到75%FBS的范圍內(nèi)，血清(胎牛血清)將針對E.coli的K9CATH活性減少到20到150分之一(表5)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>a胎牛血清'MIC:最小抑制濃度其中微生物生長被阻止的最低濃度在更低濃度(0.01^g/mL)時(shí)LPS不影響抗E.coli活性，但是當(dāng)LPS在從0.1到10pg/mL的范圍內(nèi)使用時(shí)MIC增加60倍(表6)。表6在LPSa的影響下E.coli對K9CATH的敏感性<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>LPS:來自E.coliOl11:B84的脂多糖'MIC:最小抑制濃度其中微生物生長被阻止的最低濃度通過動(dòng)力學(xué)顯色Z^ww/ws"woe6ocy&裂解產(chǎn)4勿(kineticchromogenic丄z'mw/z^(3附oe6ocyfelysate)(LAL)實(shí)馬全(Kinetic-QCL1000kit;BioWhittaker,Walkersville,MD)(Turneretal.,Antimicrob.AgentsChemother.,42:2206(1998);Tacketal.,Eur.J.Biochem.,269:1181(2002))測量LPS與K9CATH的結(jié)合。簡短地，將25jaL連續(xù)稀釋的肽一式兩份加入25pL的五.co/z0111:B4脂多糖(LPS)(包含0.5內(nèi)毒素單位/mL)中，并在37。C孵育30分鐘。在加入50pL的所述變形細(xì)胞裂解產(chǎn)物試劑和100nL的顯色底物(Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-;-硝基苯胺(nitroanilide》后，孵育后用微板閱讀器(ModelElx800,Bio-Tek,Winooski,VT)在10和16分鐘時(shí)在405nm處測量光密度。百分比LPS結(jié)合計(jì)算為([AD1-(AD2-AD3)]/AD1)x100,其中AD1表示對于僅包含LPS的樣品10和16分鐘之間的光密度的差別，AD2表示對于包含LPS和不同濃度的K9CATH的樣品10和16分鐘之間的光密度的差別，AD3表示對于包含不同濃度的肽而不含LPS的樣品10和16分鐘之間的光密度的差別。通過繪制針對log^[Fj/(1.0-^)]的logK)K9CATH濃度完成Hill圖(Turneretal.,Antimicrob.AgentsChemother.,42:2206(1998);Tacketal.,Eur.J.Biochem.,269:1181(2002)),其中&是LPS結(jié)合活性的分?jǐn)?shù)抑制(fractionalinhibition)。結(jié)果表明K9CATH能夠結(jié)合LPS,在約10.6jiM時(shí)具有50。/。的結(jié)合發(fā)生(occurring)(圖8，左側(cè))。犬導(dǎo)管素結(jié)合等溫線的典型S形形狀表明協(xié)同性(co叩erativity)。當(dāng)在Hill圖上對數(shù)據(jù)作圖時(shí)，其表明4.49的系數(shù)(圖8，右板)，LPS與K9CATH的結(jié)合是高度支持的。這個(gè)特征還在一些其它的導(dǎo)管素中發(fā)現(xiàn)，如人LL-37/hCAP-18(Turneretal.,Antimicrob.AgentsChemother.,42:2206(1998))和羊SMAP-29(Tacketal.,Eur.J.Biochem.,269:1181(2002》。測定K9CATH的溶血活性(Skerlavag,FEBSLett.,463:58(1999);Yuetal.,J.Pept.Res"60:1(2002))。簡短地，將4mL犬血收集在包含EDTA的血液收集管中(BectonDickinson,FranklinLakes,NJ)。隨后在室溫下在10,000xg將全血離心l分鐘。棄去血漿(上清液)并用PBS沖洗紅細(xì)胞兩次，重新懸浮為PBS中的0.5%(vol/vol)溶液，90^L分配到96-孔微滴定板中。將溶解在0.01%醋酸中的不同濃度的K9CATH一式兩份地加入狗細(xì)胞并在37。C孵育2小時(shí)。在8000xg離心10分鐘后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的96-孔^f敖滴定才反并通過在405nm處測量吸光度來監(jiān)測釋放的血紅蛋白。對于0和100%溶血對照由分別懸浮在<又PBS中和1.0%TritonX-100中的細(xì)月包構(gòu)成。溶血百分?jǐn)?shù)(％)計(jì)算為(X〇D415nm,肽溶液—OD415nm,僅PBS)/(OD415nm,1%TritonX-100—0D415nm,僅PBS"x100。牛骨髓抗微生物肽28(BMAP-28(1.18))(Skerlavajetal.,J.Biol.Chem.,271:28375(1996);Yuetal.,J.PeptRes.,60:1(2002);Rissoetal.,Cell.Immunol.,189:107(1998))的N-末端18氨基酸區(qū)段被用作陽性對照。為了評估K9CATH跨越物種(acrossspecies)的體外溶血活性，來自雞和人的紅血細(xì)胞遵循上面列出的相同的方案用K9CATH進(jìn)行處理。利用狗、人、和雞紅細(xì)胞測定K9CATH的溶血活性。如圖9所示，K9CATH表現(xiàn)出可忽略的溶血活性，在這三個(gè)物種中在100^M時(shí)裂解<5%的紅細(xì)胞。BMAP-28(1-18)(即，牛導(dǎo)管素BMAP-28的N-末端肽)被用作對照，在100|iM時(shí)分別溶解約20%、25%和30%的雞、狗、和人紅細(xì)胞，其與先前的報(bào)道一致(Skerlavajetal.,J.Biol.Chem.,271:28375(1996))。與BMAP-18相比，K9CATH表現(xiàn)出的針對狗和雞的紅細(xì)胞的體外溶血活性為10-20分之一。^^滋^9-^9(247及與^它0^/^/&/必附^^/"涼利用CLUSTAL-W,K9CATH的預(yù)測的氨基酸序列與來自不同物種的具有高度保守的preproregion的六個(gè)哺乳動(dòng)物導(dǎo)管素進(jìn)行對準(zhǔn)(圖3)。犬導(dǎo)管素(cathelicidin),K9CATH，具有分別為29、103、和38個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽、cathelin結(jié)構(gòu)域、和成熟肽。K9CATH還保留有埋置在proregion序列中的四個(gè)半胱氨酸的存在和相同位置，其是導(dǎo)管素肽家族的高度保守的特征。這個(gè)四-半胱氨酸經(jīng)典基序被認(rèn)為通過半胱氨酸殘基C85-C96和C107-C124之間的兩個(gè)二硫鍵穩(wěn)定cathelin結(jié)構(gòu)域(參見圖3)。當(dāng)與所有列出的cathelicidins的N-末端cathelin-結(jié)構(gòu)域區(qū)比較時(shí)，犬導(dǎo)管素表現(xiàn)出>80%的相似性。此外，這些哺乳動(dòng)物cathelicidins之間的總相似性約為70%;然而，所有列出的cathelicidins的抗微生物C-末端成熟肽區(qū)表現(xiàn)出高度可變的序列。K9CATH的推定成熟肽(SEQIDNO:4)表現(xiàn)出與人LL-37(SEQIDNO:33)的最大的相似性，為46%,與其它物種的推定成熟肽(SEQIDNO:33-38)低得多(<10%)的同一性。不同于豬PR-39(SEQIDNO:38)或牛CATH2(SEQIDNO:34)，其是脯氨酸豐富的抗微生物肽，K9CATH在其抗微生物序列中僅具有一個(gè)脯氨酸(Pestonjamaspetal.,Peptides,22:1643(2001);Castiglionietal.,Cytogenet.CellGenet.,75:240(1996);Zhangetal.，Vet.Res.,31:277(2000》。鄰位連接濃縮樹(neighbor-joiningcondensedtree)(圖10)從39個(gè)才艮道的cathelicidins獲4尋'的preproregioncDNA序歹'J的Poisson才交正^巨離構(gòu)建。消除顯著性低的分支(來自1000個(gè)復(fù)制的Bootstrap值小于50%)以形成多分叉濃縮樹。MEGA(版本3.1,ThePennsylvaniaStateUniversity,UniversityPark,PA)一皮用在所述研究中。產(chǎn)生的濃縮的多分叉樹著重于才莫式分支(patternbranches)的可靠部分而不考慮每個(gè)肽之間的確切距離。濃縮樹的分支長度與核苷酸或氨基酸替換的數(shù)量不成比例，因?yàn)楸痉治龌谕貥銓W(xué)。照這樣，系統(tǒng)發(fā)育重建將K9CATH置于與所有其它哺乳動(dòng)物序列分離的不同的基因簇中。因?yàn)镵9CATH似乎為單導(dǎo)管素基因，可以表明狗屬于單導(dǎo)管素物種，其中在這些食肉動(dòng)物的進(jìn)化史中沒有這個(gè)祖先基因的重復(fù)。迄今研究的所有的單導(dǎo)管素物種將單導(dǎo)管素基因表達(dá)為a-螺旋(Taomasinsigetal.,Curr.ProteinPept.Sci.,6:23(2005))。實(shí)滋夢/"—#7>/c/^/wo"fls#彩#7Wc/zo附朋^菌株Tl(由Tai在1993年報(bào)道的臨床分離物[請?zhí)峁┩暾胅)在TYM培養(yǎng)基中生長，所述TYM培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%熱失活馬血清、10U青霉素、lOjag鏈霉素、180(xM硫酸亞4失銨和28^M磺基水楊酸。寄生蟲被每日傳代(約lxl(^寄生蟲進(jìn)入10mLTYM培養(yǎng)基)。用犬導(dǎo)管素(K9CATH)處理寄生蟲導(dǎo)致對寄生蟲游動(dòng)性和存活性的立即的、以及穩(wěn)定的影響(圖11)。在測試的最高濃度時(shí)(100(lMK9CATH)，約80%的寄生蟲培養(yǎng)物一皮殺滅。50pM和25的K9CATH對寄生蟲存活性具有中等的影響，而12.5pM或更低的K9CATH對寄生蟲存活性具有可忽略的影響。a^"-無要K9CATH有效地殺滅對于STD負(fù)責(zé)的細(xì)菌，具有對于任何天然或合成的抗微生物肽(包括迄今為止研究的所有protegrin類似物)報(bào)道的最高的效能(Ostbergetal.,Peptides,26:197(2005))。細(xì)菌起源的STD在狗中僅零星文件報(bào)道，所報(bào)道的病原體和臨床疾病之間的聯(lián)系仍然是有爭議的(Carmichaeletal.,CornellVet.,78:63(1988);Doigetal.,Can.J.Comp.Med.,45:233(1981);Harasawaetal.,Int.J.Syst.Bacteriol.,43:640(1993))。這些結(jié)果清楚地表明新鑒定的K9CATH針對人類STD的普通病原體的優(yōu)良的抗微生物能力。TV.go"wr/oeae下調(diào)人抗樣i生物肽LL畫37的表達(dá)(Bergmanetal.,CellMicrobiol.,7:1009(2005)),并且已經(jīng)導(dǎo)艮道對抗陽離子抗微生物肽如多粘菌素B(Tzengetal.,J.Bacteriol.,187:5387(2005))。K9CATH針對TV.go"o廳/2oe^的抗微生物活性是才艮道的最有效的天然導(dǎo)管素(包括所有合成的類似物)活性的大約4-8倍(Ostbergetal.,Peptides,26:197(2005))。觀察了針對^>e^/wm"ca/^gew"<2//iw7^J類"f以6勺;舌'l"生，^7rea//a5附acam'gew〃"/z'w附已纟圣4皮i人為是犬STD中的致病劑(causativeagent)之一。K9CATH的抗微生物活性表明沒有鹽-依賴性(圖7),其可以是另一特征，通過其，這個(gè)犬導(dǎo)管素通過提高所述肽對不同環(huán)境條件的彈性(resiliency)確保更高程度的效能。K9CATH也不受0.01pg/mL的LPS處理的影響，而在0.1和10pg/mL,注意到MIC提高到60pM,表明所述肽通過顯然不可逆的結(jié)合中和內(nèi)毒素。推測的情況可能是K9CATH的C-末端七氨基酸高度極性非巻曲部分(圖6B)可以用作物理化學(xué)錨以捕獲和固定內(nèi)毒素，導(dǎo)致潛在有害地微生物成分的消除。與其它才艮道一致(Bartlettetal.,Int.J.Antimicrob.Agnets,23:606(2004);Ciorneietal.,Antimicrob.AgentsChemother.,49:2845(2005》，隨著漸增的血清濃度檢測到K9CATH針對Eco/z'的活性顯著降低(表5)。這可能是一種才幾制，通過所述機(jī)制，宿主動(dòng)物的細(xì)胞一皮確保防止由于血中導(dǎo)管素的存在的潛在的細(xì)胞毒性作用。K9CATH的獨(dú)特特征是三個(gè)物種(狗、人和雞)中顯著低的溶血活性。SMAP-29,迄今為止鑒定的最有效的導(dǎo)管素肽之一(Gennaroetal.,Biopolymers,55:31(2000》Travisetal.,Infect.Immunol"68:2748(2000)),在濃度為80時(shí)造成67%的人類RBC的溶血(Skerlavajetal.,FEBSLett.,463:58(1999))。相反，本研究表明K9CATH在相同的濃度時(shí)僅表現(xiàn)出人類紅細(xì)胞的最小的溶血(<5%)。盡管事實(shí)上其它c(diǎn)athelicidins(例嗦口CRAMP-18)(Shinetal.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,275:904(2000)已經(jīng)表現(xiàn)出僅有最小的溶血活性，但還不知道是否這個(gè)特征在不同的物種中持續(xù)，如同K9CATH肽的情況那樣(圖9)。總之，筌定了來自犬骨髓前體細(xì)胞的新型哺乳動(dòng)物導(dǎo)管素肽K9CATH。K9CATH表現(xiàn)出廣泛的抗微生物活性，不僅針對革蘭氏陽性細(xì)菌(丄Wen》wo朋cj^ogewes和金黃色葡萄球菌)、革蘭氏陰性細(xì)菌(大腸斥干菌、f/eZw'e〃a/wewmomae、血清型鼠傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌、g訓(xùn)o/r/2oeae),以及酵母(白色念珠菌)，還針對寄生蟲(即，7Wc/zomowarag/"a"力。K9CATH的抗微生物活性針對與STD相關(guān)的病原體是特別有承支的，尤其是7Ve&wnago"o/r/2oeae,其可以提供有用的體內(nèi)才莫型，用于先天防御系統(tǒng)中這些宿主防御分子的角色相關(guān)的更深刻的機(jī)制研究。本數(shù)據(jù)表明K9CATH可能是犬中先天防御機(jī)制中涉及的中心效應(yīng)分子。此外，給定化合物的殺滅能力的寬度以及它對于不同微環(huán)境生物化學(xué)條件的獨(dú)特抗性，這個(gè)抗微生物肽的獨(dú)特特征可以指向甚至更廣闊的應(yīng)用。參考文獻(xiàn)〖1]ZanettiM.Cathdiddins，muWfonctionalpeptidesoftheinnateimmunity.JLeukocBiol2004;75:39-48.〖2〗Bom幼HG.Antibacterialpeptides:basicfactsandemergingconcepts*JInternMed2003;254:197-215.〖3〗TomasinsigL,ZanettiMThecathelicidins—structure,functionandevolution.CurrProteinPeptSci2005;6:23-34.ZaiouM，NizetV，Galk>RL,Antimicrobialandproteaseinhibitoryfunctionsofthehumancathelicidin(hCAP18/Lll-37)prosequence.JInvestDermatol2003;120:810-6,AgerberthB,CharoJ，WerrJ，etal.Thehumanantimicrobialandch加otacticpepddesLL-37andaipha-defensinsareexpressedbyspecificlymphocyteandmonocytepopulations'Blood2000;96:3086-93.NiyonsabaF,Hirata化OgawaH，etal.EpithelialceH~derivedantibacterialpeptideshumanbeta-defensinsandcathdiddin:multifunctionalactivitiesonmastcells,CurrDrugTargetsInflammAllergy2003;2:224-31,GennaroR，Z加ettiM.Structuralfeaturesandbiologicalactivitiesofthecathdicidin-derivedantimicrobialpeptides,Biopolymers2000;55:31-49.BalsR，LangC>WetnerDJ，改al，Rhesusmonkey(Macacamulatta〉mucosalantimicrobialpeptidesareclosehomologuesofhumanmolecules.ClinDiagnLabImimmol2001;8:370-5,BalaR，WangX,ZasloffM，etThep印tideantibioticLL-37/hCAP-18isexpressedmepitheliaofthehumanlungwhereithasbroadantimicrobialactivityattheairwaysurface.ProcNatlAcadSciUSA1998;95:954卜6.SkeriavajB,GennaroBagellaL，etal.Biologicalcharacterizationoftwonovelcathelicidin-derivedpeptidesandidentificationof*structuralrequirementsfortheirantimicrobialandcelllyticactivities,JBiolChem1996;271:28375-81.〖17]ScocchiM,WangS，ZanettiM,Structuralorganizationofthebovine(athdicidingenefamilyandidentificationofa加vdmember,FEBSLett!997;417:31〗-5,ShamovaO,BrogdenKA，ZhaoC，etal.Purificationandpropertiesofprolhie^riehantimicrobialpeptidesfromsheepandgoatleukocytes.InfectIm咖n1999;67:4106-11,Bagdb3L,ScocchiM,ZanettiMcDNAsequencesofthreesheepmyeloidcathdicidins-FEBSLett1995;376:225-8.20]ZanettiM>StoriciP，丁ossiA，etal.Mokcularcloning加dchemicalsynthesisofanovelantibacterialpeptidederivedfrompigmyeloidcells.JBiolChem1994;269:7855-8.VuraamS，JuvvadiP，MerrifieldRB'SynthesisandantibacterialactionofcecropinandproHne-arginine-richpeptidesfrompigintestine.JP鄰tRes1997;49:59-66.ScocchiM，BontempoDaBoscoloS,etaUwdcathdicWinsinhorseleukocytes(l).FBBSLett1999;457:459-64,〖23]SkeriavajB，ScocchiM,C5e加aroetal-Structuralandfunctionalanalysisofhorsec站helicidinpeptides.AntimicrobAgentsChemother2001;45:715-22,〖24]Pestonjamasp\%HiUtnerKH，<3aloRL>ProcessingsiteandgenestructureforthemurineantimicrobialpeptideCRAMP,Peptides2001;22:1643-50.WuH，ZhangG，MintonJE，etal.Regulationofcathelicidingeneexpression:inductionbylipopolysaccharide，interleukin-6,retinoicacid，andSalmonellaentericaserovartyphirnuriuminfection.InfectImmun2000;68:5552-8,〖30〗SangY，OrtegaMT,BlechaF，etal.MolecularClonbgandCharacterizationofThree(beta〉-DefensinsfromCanineTe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法，其中所述疾病是梅毒、衣原體病(chlamydia)、'淋病、滴蟲病、或鵝口癡。23.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述微生物是Zj'Wen'amowocytogewes、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、A7eZw.e〃a/7wewmowz.ae、鼠"f另寒;少門氏菌、纟錄膿4干菌、/Vofe2^m&a6z7&、5V2/mo"e〃a6^ea/A3扁awre—,/cw附、白色念珠菌、或7Wc/zow，05"v<3gz>/^"。24.—種制造的制品，包括權(quán)利要求1到5中任何一項(xiàng)的所述多肽、所述變體或所述片段或者權(quán)利要求16或17的所述組合物。25.—種純化抗體，其特異性地結(jié)合到SEQIDNO:4。全文摘要本發(fā)明涉及抗微生物導(dǎo)管素多肽，涉及具有SEQIDNo4的38氨基酸的肽。本發(fā)明提供了具有廣譜抗微生物活性的多肽、編碼這樣的多肽的核酸和表達(dá)載體、以及減少微生物的存活的宿主細(xì)胞和方法。此外，本發(fā)明還提供了組合物、以及制造的制品，其包括廣譜抗微生物多肽。文檔編號(hào)C07K14/47GK101351474SQ200680049565公開日2009年1月21日申請日期2006年12月29日優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日發(fā)明者F·布勒查,M·T·奧爾特加,T·梅爾加雷霍,桑永明申請人:堪薩斯州立大學(xué)研究基金會(huì)