專利名稱：一種殼寡糖單體的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及殼寡糖單一組分的分離純化，具體地說(shuō)是柱層析的方法分 離殼寡糖的方法。
背景技術(shù)：
殼寡糖是指e -1， 4連接的，由2-10個(gè)2-氨基葡萄糖殘基構(gòu)成的低聚 糖，它是目前發(fā)現(xiàn)的天然多糖中唯一帶正電荷的小分子多糖， 是甲殼素、殼聚糖系列產(chǎn)品的高級(jí)產(chǎn)品，具備水溶性好、生物活性高、功 能作用大、應(yīng)用領(lǐng)域廣、易被人體吸收等突出特點(diǎn)，在國(guó)外素有人體第六 大生命要素、軟黃金之美譽(yù)，在醫(yī)藥、功能性食品、日化、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域應(yīng) 用廣泛。殼寡糖作為新世紀(jì)前瞻性生物技術(shù)產(chǎn)品，具備廣泛的應(yīng)用前景。
殼寡糖具有多種生理功能激活免疫，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞能力3-5倍；提
高有益脂蛋白數(shù)量，降低血脂；改善胰島素受體敏感性，明顯減低空腹血 糖；保護(hù)正常肝細(xì)胞的分泌、代謝和排泄功能，增強(qiáng)肝細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)換機(jī) 能，直接抑制肝癌細(xì)胞及腹水腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；促進(jìn)雙歧桿菌的增殖，抑 制腸道有害菌的生長(zhǎng)等。目前，殼寡糖以其穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)和特殊的生物 功能，成為令人關(guān)注的功能性物質(zhì)。獲得一定數(shù)量的寡糖單一成分對(duì)開發(fā) 研究殼寡糖化學(xué)特性、生理功能、作用機(jī)理及檢測(cè)技術(shù)等具有極大的幫助。

發(fā)明內(nèi)容
殼寡糖是目前發(fā)現(xiàn)的天然多糖中唯一帶正電荷的小分子多糖，并具有 穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，特殊的生理活性，是高效的功能性物質(zhì)。
本發(fā)明的目的在于為糖工程及相關(guān)領(lǐng)域的研究提供一種殼寡糖單體及 分離純化殼寡糖單體的方法，本發(fā)明分離效果好，收率高，所得到的殼寡 糖單體純度高。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種殼寡糖單體的分離純化方法，按如下步驟進(jìn)行操作
1) 殼寡糖溶液的配置將殼寡糖以20—70%的質(zhì)量濃度溶于水或 0. l-1.0mol/L鹽酸中，待完全溶解后，抽濾，濾液即為殼寡糖溶液；
2) 將殼寡糖溶液上樣于陽(yáng)離子交換樹脂柱(柱子內(nèi)徑55mmX柱高 400腿)，用2. 0—3. 0mol/L的鹽酸梯度洗脫，流速為100—600 ml/h;
用自動(dòng)部分收集器收集，每l小時(shí)收集一次；酸堿滴定法和HPLC法分 別檢測(cè)收集液的鹽酸含量和糖含量，結(jié)合兩者的檢測(cè)結(jié)果，得出餾分ll一17、鹽酸濃度2. 0—2. 15 mol/L時(shí)為殼二糖；餾分22—31、鹽酸濃度2. 2 —2. 35 mol/L時(shí)為殼三糖；熘分34—45、鹽酸濃度2. 4—2. 5 mol/L時(shí)為 殼四糖；餾分46—50、鹽酸濃度2. 55—2. 7 mol/L時(shí)為殼五糖；鎦分52— 62、鹽酸濃度2.75—2.8 mol/L時(shí)為殼六糖；餾分70—80、鹽酸濃度2.9 一3.0 mol/L時(shí)為殼七糖；合并上述的單一組分；
3)把上述合并后的單一組分，濃縮得濃縮液，活性炭脫鹽酸，濃縮， 結(jié)晶，通過(guò)HPLC和MS檢測(cè)，得到了純度不同的各個(gè)單體。
相同規(guī)格的柱子，本研究所用的陽(yáng)離子交換樹脂承載量大，分離效果 好，而且填料可以重復(fù)使用。殼寡糖與陽(yáng)離子交換樹脂的用量比例為10 80g : 800ml;
脫鹽酸所用活性炭柱，濃縮液與活性炭的用量比例為5 20ml : 400ml。 脫鹽酸所用活性炭柱(柱子內(nèi)徑50mmX柱高300mm)，脫鹽酸效果好，且 對(duì)殼寡糖吸附少，收率高；本發(fā)明所用的活性炭脫色效果好，可以重復(fù)使用。
所述殼寡糖的脫乙酰度〉90%，聚合度2-10。
本發(fā)明所用的酸溶液為鹽酸溶液，鹽酸濃度為2.0-3.0mol/L，分離單 體純度高；且本發(fā)明分離得到的殼寡糖單體成鹽酸鹽形式，穩(wěn)定、易保存。 本發(fā)明適合于分離2-10個(gè)2-氨基葡萄糖殘基構(gòu)成的低聚糖，分離效果好。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
本發(fā)明殼寡糖的分離純化，主要是先用2. 0-3. 0mol/L鹽酸溶液對(duì)殼寡 糖進(jìn)行初步分離，得到殼寡糖單體的酸溶液，然后脫鹽酸，進(jìn)行純化，這 樣分離得到的殼寡糖單體純度更高。
本發(fā)明所得到的殼寡糖單體純度高，收率高，穩(wěn)定，容易保存；分離 方法成本低，操作簡(jiǎn)單、方便，技術(shù)路線成熟，所用的填料均可以重復(fù)使 用。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)一步說(shuō)明
實(shí)施例1:
將20g殼寡糖溶于200ml水中，待完全溶解后，離心(6000轉(zhuǎn))，抽濾， 濾液上樣于陽(yáng)離子交換樹脂(DOWEX50WA4-400)柱中，用2. 0—3. 0mol/L 鹽酸溶液梯度洗脫，鹽酸溶液的濃度從2. 0 mol/L向3. 0mol/L變化，流速 為300ml/h，用自動(dòng)部分收集器收集，每小時(shí)收集一次，共收集90瓶餾分。 采用酸堿滴定法和HPLC法分別對(duì)每個(gè)餾分進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)合兩者的檢測(cè)結(jié)果， 得出餾分16—17為殼二糖，共600ml;熘分26—31為殼三糖，共1800ml; 餾分34—44為殼四糖，共3000ml;餾分48—50為殼五糖1000ml;餾分53
4一60為殼六糖，共900ml;餾分76—80為殼七糖，共1500ml。對(duì)合并后的 單一組分，濃縮至8ml。用活性炭脫鹽酸后，于5(TC下真空干燥。
殼寡糖與陽(yáng)離子交換樹脂的用量比例為20g : 800ml;脫鹽酸所用活性 炭柱(柱子內(nèi)，50mmX柱高300mm)，脫鹽酸效率好，且對(duì)殼寡糖吸附少；
對(duì)目標(biāo)物采用HPLC和MS進(jìn)行純度檢測(cè)，得出殼二糖純度》90%、殼三 糖純度》90 %、殼四糖純度>97%、殼五糖純度^ 82%、殼六糖純度>74%。 其中殼二糖、殼三糖、殼四糖均可用作標(biāo)準(zhǔn)品。
實(shí)施例2:
將30g殼寡糖溶于300ml 1.0mo1/1的鹽酸中，待完全溶解后，抽濾， 濾液上樣于陽(yáng)離子交換樹脂(001*7(732))柱中，用2. 0—3. 0mol/L鹽酸溶 液梯度洗脫，流速為500ml/h，用自動(dòng)部分收集器共收集，每小時(shí)收集一次， 共收集75瓶。根據(jù)HPLC法和酸堿滴定法的檢測(cè)結(jié)果，餾分12-19為殼二 糖，共1600ml;餾分21-28為殼三糖，共3200ml;餾分33—45為殼四糖， 共5200ml;餾分49—52為殼五糖，共4400ml;餾分55—60為殼六糖，共 2400ml;餾分74—75為殼七糖，1000ml。
對(duì)合并后的單一組分，分別濃縮至10ml，活性炭柱脫鹽酸，用水洗脫， 流速為80 ml/h，每0. 5小時(shí)收集一次，各收集30管，根據(jù)HPLC檢測(cè)結(jié)果， 合并F3-30，濃縮至4ml。殼二糖、殼三糖置于真空干燥器中結(jié)晶；殼四糖 -殼六糖于5CTC下真空干燥結(jié)晶。對(duì)結(jié)晶的各單體采用HPLC和MS進(jìn)行純度 檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為殼二糖純度》98%、殼三糖純度^89 %、殼四糖純度^ 96%、殼五糖純度》79%、殼六糖純度》76%、殼七糖純度很低。其中殼二 糖、殼四糖均可用作標(biāo)準(zhǔn)品。
殼寡糖與陽(yáng)離子交換樹脂的用量比例為30g : 800ml;脫鹽酸所用活性 炭柱(柱子內(nèi)徑50mmX柱高300mm)，脫鹽酸效率好，且對(duì)殼寡糖吸附少。
實(shí)施例3:
將50g殼寡糖溶于400ml 1.5mol/L的鹽酸中，待完全溶解后，抽濾， 濾液脫色。將脫色后的殼寡糖溶液上樣于陽(yáng)離子交換樹脂(BLY15X724) 柱中，用2.0-3. 0mol/L鹽酸洗脫，流速為250ml/h，用自動(dòng)部分收集器收 集，每小時(shí)收集一次，共80瓶餾分。根據(jù)HPLC的檢測(cè)結(jié)果，其中餾分11-14 為殼二糖，共2000ml;餾分15-22為殼三糖，共2500ml;餾分26—31為 殼四糖，共3000ml;餾分38—50為殼五糖，共2000ml;餾分50—56為殼 六糖，3500ml;餾分68—74為殼七糖，共1500ml。
對(duì)合并后的單一組分，分別濃縮至15ml。用活性炭柱脫鹽酸，流速為 50 ml/h，每小時(shí)收集一次，共收集30管，根據(jù)HPLC檢測(cè)結(jié)果，合并F3-30， 分別濃縮至3ml左右。所有目標(biāo)物均放置于真空干燥器中進(jìn)行結(jié)晶。對(duì)結(jié) 晶的各單體采用HPLC和MS進(jìn)行純度檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為殼二糖純度》98%、殼三糖純度^96 %、殼四糖純度>95%、殼五糖純度^ 76%、殼六糖純度》 65%。其中殼二糖、殼三糖、殼四糖均可用作標(biāo)準(zhǔn)品。
殼寡糖與陽(yáng)離子交換樹脂的用量比例為50g : 800ml;脫鹽酸所用活性 炭柱(柱子內(nèi)徑50mmX柱高300mm)，脫鹽酸效率好，且對(duì)殼寡糖吸附少。
本發(fā)明成本低，操作簡(jiǎn)單、方便，技術(shù)路線成熟，所用的填料均可以 重復(fù)使用，可規(guī)?；a(chǎn)。
標(biāo)注本發(fā)明中所用的高效液相色譜檢測(cè)儀器均為美國(guó)ESA公司 CouloChem II檢測(cè)器、5040型分析電極；Dionex公司CarboPac PA1色譜 柱，4.0X250mm。
質(zhì)譜檢測(cè)儀器為Thermo Finnigan LTQ電噴霧電離質(zhì)譜。
權(quán)利要求
1.一種殼寡糖單體的分離純化方法，其特征在于，按如下步驟進(jìn)行操作1)殼寡糖溶液的配置將殼寡糖以20-70％的質(zhì)量濃度溶于水或0.1-1.0mol/L鹽酸中，待完全溶解后，抽濾，濾液即為殼寡糖溶液；2)將殼寡糖溶液上樣于陽(yáng)離子交換樹脂柱，用2.0-3.0mol/L的鹽酸梯度洗脫，流速為100-600ml/h；用自動(dòng)部分收集器收集，每1小時(shí)收集一次；酸堿滴定法和HPLC法分別檢測(cè)收集液的鹽酸含量和糖含量，結(jié)合兩者的檢測(cè)結(jié)果，得出餾分11-17、鹽酸濃度2.0-2.15mol/L時(shí)為殼二糖；餾分22-31、鹽酸濃度2.2-2.35mol/L時(shí)為殼三糖；餾分34-45、鹽酸濃度2.4-2.5mol/L時(shí)為殼四糖；餾分46-50、鹽酸濃度2.55-2.7mol/L時(shí)為殼五糖；餾分52-62、鹽酸濃度2.75-2.8mol/L時(shí)為殼六糖；餾分70-80、鹽酸濃度2.9-3.0mol/L時(shí)為殼七糖；合并上述的單一組分；3)把上述合并后的單一組分，濃縮得濃縮液，活性炭脫鹽酸，濃縮、干燥結(jié)晶，通過(guò)HPLC和MS檢測(cè)，得到了純度不同的各個(gè)單體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖單體的分離純化方法，其特征在于 殼寡糖與陽(yáng)離子交換樹脂的用量比例為10 80g : 800ml。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖單體的分離純化方法，其特征在于 脫鹽酸所用活性炭柱，濃縮液與活性炭的用量比例為5 20ml : 400ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼寡糖單體的分離純化方法，其特征在于 所述殼寡糖的脫乙酰度〉90%，聚合度2-10。
全文摘要
本發(fā)明涉及殼寡糖單體的分離純化方法，具體按照如下步驟進(jìn)行操作1)殼寡糖溶液的配置將殼寡糖按照20-70％濃度溶于水或0.1-1.0mol/L鹽酸溶液中，待完全溶解后，抽濾，濾液即為殼寡糖溶液；2)將殼寡糖溶液，上樣于陽(yáng)離子交換樹脂柱中，用2.0-3.0mol/L鹽酸洗脫，流速為100-600ml/h。用自動(dòng)部分收集器收集，酸堿滴定法和HPLC法分別檢測(cè)收集液的鹽酸含量和糖含量；3)根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，合并相同組分，濃縮，脫鹽酸，收集糖組分，濃縮，結(jié)晶，即得殼寡糖單體。本發(fā)明成本低，操作簡(jiǎn)單、方便，技術(shù)路線成熟，所用的填料均可以重復(fù)使用，可規(guī)模化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C07H3/00GK101619082SQ20081001209
公開日2010年1月6日 申請(qǐng)日期2008年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月1日
發(fā)明者拓亞琴, 杜昱光, 熊川男, 白雪芳, 鵬 魏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所