專利名稱：高速逆流色譜法制備異戊酰螺旋霉素Ⅲ的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種異戊酰螺旋霉素III的制備方法，具體地說(shuō)，涉及一種采用高 速逆流色譜(High-Speed Counter-Current Chromatography, HSCCC)由必特螺旋霉素 (Bitespiramycin)中分離制備異戊酰螺旋霉素III的方法。
背景技術(shù)：
必特螺旋霉素(Bitespiramycin)是由轉(zhuǎn)基因的螺旋霉素(Spiramycin，SPM)產(chǎn)生 菌發(fā)酵得到的全新型抗生素，是一種主要組分為異戊酰螺旋霉素I、II、III的多組分抗生 素，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)如式1所示
福洛氨糖
內(nèi)酯環(huán)
CH3
\
CH,
碳霉糖
CH/
H3CCv,Z、0^^
O‘
OCOCH2CH (CH3) 2
1式1中，R = H(異戊酰螺旋霉素I)，R = COCH3(異戊酰螺旋霉素II)，R = COCH2CH3(異戊酰螺旋霉素III)。與螺旋霉素(SPM)相比，異戊酰螺旋霉素在4"位具有異戊?；鶄?cè)鏈，且其理化性 質(zhì)與SPM也不同，具有了更好的體內(nèi)抗菌活性。作為一類新藥，獲得必特螺旋霉素的主要組 分和活性組分，即異戊酰螺旋霉素I、II、III的高純度樣品對(duì)于藥理研究和質(zhì)量控制具有
重要意義。由于必特螺旋霉素的組分復(fù)雜，且分子結(jié)構(gòu)差別很小，用傳統(tǒng)分離方法很難得到 異戊酰螺旋霉素III的高純度樣品。高速逆流色譜是一種基于液-液分配原理的新型分 離技術(shù)，可以提供相當(dāng)于上千理論塔板數(shù)的分離效果，為必特螺旋霉素主要組分的分離提 供了手段。近年來(lái)，有關(guān)采用高速逆流色譜(HSCCC)技術(shù)分離抗生素組分在國(guó)內(nèi)外有一些研 究，其中，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的分離主要集中于紅霉素組分、螺旋霉素組分、他克莫斯和子
3囊霉素等的分離研究。例如，Hisao Oka等利用高速逆流色譜分離螺旋霉素組分，所用體 系為正己烷乙酸乙酯甲醇水(體積比)=3:6:5: 5，得到的螺旋霉素I、II、 III 純度分別 98. 2%、92· 3%、97. 4% (Hisao Oka, Ken-ichi Harada, Masanao Suzuki, et al. Separation of spiramycin componentsusing high-speed counter-current chromatography Journal of Chromatography A. 2000，903 :93-98)。其中，特定的溶齊[J系 統(tǒng)及其溶劑配比是獲得良好分離效果的關(guān)鍵之一。目前尚未見(jiàn)采用高速逆流色譜分離制備高純度必特螺旋霉素的主要組分的研究 報(bào)道，國(guó)內(nèi)外也尚未有高純度的異戊酰螺旋霉素III的樣品提供。?；菪顾仉m然與螺 旋霉素具有相似的母核，但不同的側(cè)鏈基團(tuán)使它們具有不同的理化性質(zhì)，尤其是異戊酰螺 旋霉素的C5側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)其影響很大，可以作為分離螺旋霉素和異戊酰螺旋霉素的依據(jù)。但 同時(shí)，螺旋霉素的分離方法也不能直接適用于異戊酰螺旋霉素中不同組分的分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種采用高速逆流色譜(HSCCC)法從必特螺旋霉素原料 中分離得到異戊酰螺旋霉素III的方法，從而獲得異戊酰螺旋霉素III的高純品樣品。本發(fā)明所述的方法，其包括如下步驟(1)通過(guò)包括過(guò)濾、萃取、反萃取、洗滌和結(jié)晶等操作，從必特螺旋霉素發(fā)酵液中提 取純化必特螺旋霉素，經(jīng)高效液相色譜分析，獲得的必特螺旋霉素原料中異戊酰螺旋霉素 III含量彡25% ；(2)將正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按比例配制構(gòu)成固定相和流動(dòng)相的溶劑體系；(3)向高速逆流色譜儀內(nèi)泵入固定相使其充滿整個(gè)螺旋管；(4)開啟主機(jī)，使螺旋管高速運(yùn)轉(zhuǎn)；(5)以一定流速Q(mào)ml/min 3ml/min)向高速逆流色譜儀內(nèi)泵入流動(dòng)相；(6)平衡建立后，將必特螺旋霉素由進(jìn)樣閥注入體系中，根據(jù)檢測(cè)器譜圖收集流出 液，獲得異戊酰螺旋霉素III ；其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按的體積比為1.0 (1.0 2.3) (1.2 2. 7) (0. 8 2. 0)。整個(gè)分離過(guò)程在常壓(Iatm)及20°C 25°C條件下進(jìn)行.根據(jù)必特螺旋霉素的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，結(jié)合分配系數(shù)法篩選出滿足要求 的溶劑體系，再用分析型高速逆流色譜進(jìn)行調(diào)整，選擇可用于高速逆流色譜法分 離異戊酰螺旋霉素III的溶劑體系主要有正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體積比 為 1.00 1. 50 2.00 1. 25,1.0 1.0 1.6 1.0,1.0 1.0 1.2 0.8、 1.0 2.3 2.7 1.7等。這些體系滿足必特螺旋霉素的pH穩(wěn)定條件，但用于分離時(shí)，檢 測(cè)到異戊酰螺旋霉素III的峰形不夠?qū)ΨQ導(dǎo)致收集困難。為使峰形對(duì)稱，提高收集效率，調(diào) 節(jié)流動(dòng)相PH為7. 0-7. 5。用半制備型高速逆流色譜分離制備異戊酰螺旋霉素III，純度在 97%以上。同時(shí)獲得異戊酰螺旋霉素I的純度在40%以上，II的純度在70%以上，可進(jìn)一 步進(jìn)行分離純化。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1，本方法在所述的溶劑體系下采用高速逆流色譜分離的方法，從組分復(fù)雜的必特 螺旋霉素原料中分離制備異戊酰螺旋霉素III，得到了純度較高的異戊酰螺旋霉素III的樣品。2，采用高速逆流色譜分離后，異戊酰螺旋霉素I和II得到富集，可根據(jù)需要進(jìn)一 步分別制備異戊酰螺旋霉素I和II。3，高速逆流色譜的固定相是液相，避免了因吸附作用引起的樣品損失、樣品組分 的化學(xué)變性。4，本方法采用了高速逆流色譜分離方法，分離高效、快速、分離量大、樣品無(wú)損失、 回收率高。


圖1為由實(shí)施例1所得的高速逆流色譜分離圖，其中1-異戊酰螺旋霉素I，2-異戊酰螺旋霉素II，3-異戊酰螺旋霉素III。圖2為由實(shí)施例1所得的異戊酰螺旋霉素III (純度為97. 8% )及其原料(必特 螺旋霉素)的高效液相色譜(HPLC)圖譜；其中A-原料，B-異戊酰螺旋霉素III。圖3為由實(shí)施例2所得的高速逆流色譜分離圖，其中1-異戊酰螺旋霉素I，2-異戊酰螺旋霉素II，3-異戊酰螺旋霉素III。圖4為由實(shí)施例2所得的異戊酰螺旋霉素III (純度為98. )及其原料(必特 螺旋霉素)的HPLC圖譜；其中A-原料，B-異戊酰螺旋霉素III。具體實(shí)施方法下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但所舉的實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù) 范圍。所用300-B半制備型高速逆流色譜儀由上海同田生化技術(shù)有限公司提供；所用必 特螺旋霉素(發(fā)酵液)由上海同聯(lián)藥業(yè)有限公司提供。在下列實(shí)施例中，除特別說(shuō)明外，所有操作在常壓和20°C 25°C條件下進(jìn)行，且 所指含量均為高效液相色譜分析所得。實(shí)施例1向必特螺旋霉素發(fā)酵液的濾液中加入乙酸丁酯進(jìn)行萃取，萃取液經(jīng)由磷酸鹽緩 沖液洗滌，加堿液結(jié)晶、過(guò)濾、干燥，獲得的必特螺旋霉素原料中異戊酰螺旋霉素I、II和 III的含量分別為21.8%、29. 3%、30. 0%。按正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體積比為 1 1.5 2 1.25配制溶劑體系，置于分液漏斗中，分液后，以上相作為固定相、下相作 為流動(dòng)相，分別置于超聲波清洗器中超聲脫氣。然后，用氨水調(diào)節(jié)流動(dòng)相PH值為7. 2。以 30ml/min的流速將固定相泵入高速逆流色譜儀中直至液體充滿整個(gè)柱體。設(shè)定螺旋管轉(zhuǎn)速 為900rpm，開啟主機(jī)，以2ml/min流速向高速逆流色譜儀中泵入流動(dòng)相。待流出液由固定相 變?yōu)榱鲃?dòng)相，即建立了動(dòng)態(tài)平衡后，將150mg原料溶于20ml流動(dòng)相，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，根據(jù)紫 外檢測(cè)器譜圖收集流出液，檢測(cè)譜圖見(jiàn)圖1。將收集得到1、2、3峰的洗脫液濃縮、在50°C下 真空干燥。經(jīng)高效液相色譜分析，3峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為異戊酰螺旋霉素III，其純度為97. 8%, 收率為57.8%。發(fā)酵液中提取的必特螺旋霉素和高速逆流色譜分離獲得的異戊酰螺旋霉 素III產(chǎn)品HPLC分析圖見(jiàn)圖2。譜圖中1、2峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)分別為異戊酰螺旋霉素I和II，其純度分別為69. 4%,80. 8%。用高分辨率電子轟擊質(zhì)譜對(duì)獲得的異戊酰螺旋霉素III產(chǎn) 品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定分析，碎片離子14、m/z881.M驗(yàn)證了該物質(zhì)的異戊?；鶊F(tuán)(4’ 位)和丙酰基基團(tuán)(R基團(tuán))。實(shí)施例2向必特螺旋霉素發(fā)酵液的濾液中加入乙酸丁酯進(jìn)行萃取，萃取液經(jīng)由磷酸鹽緩 沖液洗滌，加堿液結(jié)晶、過(guò)濾、干燥，獲得的必特螺旋霉素原料中異戊酰螺旋霉素I、II和 III的含量分別為12.7^^31.0^^31.8 ^按正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體積比為 1 1 1.5 1的比例配制溶劑體系，置于分液漏斗中，分液后，以上相作為固定相、下相 作為流動(dòng)相，分別置于超聲波清洗器中超聲脫氣。然后，用氨水調(diào)節(jié)流動(dòng)相PH為7.0。以 30ml/min的流速將固定相泵入高速逆流色譜儀中直至液體充滿整個(gè)柱體。設(shè)定螺旋管轉(zhuǎn)速 為900rpm，開啟主機(jī)，以2ml/min流速向高速逆流色譜儀中泵入流動(dòng)相。待流出液由固定相 變?yōu)榱鲃?dòng)相，即建立了動(dòng)態(tài)平衡后，將IOOmg原料溶于20ml流動(dòng)相，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，根據(jù)檢 測(cè)器譜圖收集流出液，檢測(cè)譜圖見(jiàn)圖3。將收集得到1、2、3峰的洗脫液濃縮、在50°C下真空 干燥。經(jīng)高效液相色譜分析，3峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)為異戊酰螺旋霉素III，其純度為98. 1%，收率 為40. 6%。發(fā)酵液中提取的必特螺旋霉素和高速逆流色譜分離獲得的異戊酰螺旋霉素III 產(chǎn)品HPLC分析圖見(jiàn)圖4。譜圖中1、2峰對(duì)應(yīng)的物質(zhì)分別為異戊酰螺旋霉素I和II，其純 度分別為50. 9%,70. 6%。用高分辨率電子轟擊質(zhì)譜對(duì)獲得的異戊酰螺旋霉素III產(chǎn)品進(jìn) 行結(jié)構(gòu)鑒定分析，碎片離子14、m/z881.M驗(yàn)證了該物質(zhì)的異戊酰基基團(tuán)(4’位) 和丙?；鶊F(tuán)(R基團(tuán))。
權(quán)利要求
1.一種異戊酰螺旋霉素III的制備方法，其特征在于，所說(shuō)的制備方法是采用高速逆 流色譜法從必特螺旋霉素原料中分離得到異戊酰螺旋霉素III，包括如下步驟(1)通過(guò)包括過(guò)濾、萃取、反萃取、洗滌和結(jié)晶等操作，從必特螺旋霉素發(fā)酵液中提取純 化必特螺旋霉素，獲得異戊酰螺旋霉素III含量大于或等于25%的必特螺旋霉素；(2)將正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按比例配制構(gòu)成固定相和流動(dòng)相的溶劑體系；(3)向高速逆流色譜儀內(nèi)泵入固定相使其充滿整個(gè)螺旋管；(4)開啟主機(jī)，使螺旋管高速運(yùn)轉(zhuǎn)；(5)以2ml/min 3ml/min向高速逆流色譜儀內(nèi)泵入流動(dòng)相；(6)平衡建立后，將由步驟(1)所得的必特螺旋霉素由進(jìn)樣閥注入體系中，根據(jù)檢測(cè)器 譜圖收集流出液，獲得異戊酰螺旋霉素III ；其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按的體積比為1.0 (1.0 2. 3) (1.2 2. 7) (0. 8 2. 0)。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的體 積比為 1. 00 1. 50 2. 00 1. 25。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于其中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的體 積比為 1.0 1.0 1.5 1.0。
4.如權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于其中所用流動(dòng)相的pH值為 7. 0-7. 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種異戊酰螺旋霉素III的制備方法，其主要步驟是采用高速逆流色譜由必特螺旋霉素原料中分離制備異戊酰螺旋霉素III。配制固定相和流動(dòng)相的溶劑體系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水組成，且正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按的體積比為1.0∶(1.0～2.3)∶(1.2～2.7)∶(0.8～2.0)，流動(dòng)相的pH值為7.0-7.5。本發(fā)明具有高效、快速和樣品無(wú)損失等優(yōu)點(diǎn)，且是一種適合于各種規(guī)格的高速逆流色譜儀分離制備異戊酰螺旋霉素III的方法。
文檔編號(hào)C07H1/08GK102060894SQ201010578139
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者吳艷陽(yáng), 張曉勇, 朱家文, 武斌, 王維娜, 紀(jì)利俊, 陳葵, 顧芨芨 申請(qǐng)人:上海同田生化技術(shù)有限公司, 華東理工大學(xué)