專利名稱：Cpn20蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物對(duì)aba耐受性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種CPN20蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物對(duì)ABA耐受性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物激素ABA在植物發(fā)育的各個(gè)階段，包括胚胎成熟、種子發(fā)育及幼苗生長(zhǎng)過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。ABA也是植物適應(yīng)逆境，例如干旱、高鹽及低溫脅迫的關(guān)鍵激素。ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究，許多ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)組分被發(fā)現(xiàn)，其中也包括ABA受體。有報(bào)道稱可能的G蛋白偶聯(lián)受體GCR2以及GPCR類G蛋白GTGl和GTG2是候選的ABA質(zhì)膜受體。但是，GCR2是否參與調(diào)控ABA調(diào)節(jié)的種子萌發(fā)和萌發(fā)后生長(zhǎng)還存在爭(zhēng)議。GTGs是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)節(jié)子，它能夠與擬南芥G蛋白α亞基GPAl相互作用，GPAl通過抑制GTG與ABA結(jié)合活性負(fù)調(diào)節(jié)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。屬于START超家族的PYR/PYL/RCAR蛋白被鑒定為ABA細(xì)胞質(zhì)受體，其可以調(diào)節(jié)ABA核心信號(hào)通路。2C類蛋白磷酸酶(PP2Cs)直接作用于PYR/PYL/RCAR受體下游，抑制SNFl相關(guān)蛋白激酶2s (SnRK2s)活性，繼而調(diào)節(jié)ABF/AREB/ABI5等bZIP類轉(zhuǎn)錄因子繼而調(diào)控ABA信號(hào)反應(yīng)。鎂螯合酶H亞基(CHLH/ABAR)是擬南芥ABA潛在受體，它能夠拮抗一組WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而解除其對(duì)ABA響應(yīng)基因的抑制作用。雖然CHLH/ABAR是否能夠結(jié)合ABA還有待研究，但是已經(jīng)有證據(jù)表明CHLH/ABAR參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在擬南芥已經(jīng)鑒定出的四個(gè)abar相關(guān)突變體abar-2, abar~3, cch和rtll中ABA敏感性均發(fā)生改變。獨(dú)立研究小組發(fā)現(xiàn)CHLH/ABAR參與調(diào)控?cái)M南芥及桃子葉片氣孔保衛(wèi)細(xì)胞對(duì)ABA的響應(yīng)過程。近期本實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)CHLH/ABAR也參·與調(diào)控?zé)煵萑~片保衛(wèi)細(xì)胞中ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外CHLH/ABAR也參與調(diào)控了桃子及草莓的果實(shí)成熟過程。以上證據(jù)均表明CHLH/ABAR是植物細(xì)胞必須的ABA信號(hào)調(diào)節(jié)子。但是，ABAR/CHLH介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚待研究，篩選該通路中的關(guān)鍵功能組分是了解ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜作用機(jī)制所必須的。Chaperones (分子伴侶)是一類功能性伴侶蛋白，具有平衡蛋白質(zhì)折疊、裝配、定位和降解的作用。大部分分子伴侶在高溫或其它脅迫條件下表達(dá)量上調(diào)，因此它們也被稱為熱激蛋白(HSPs)。在植物中，根據(jù)蛋白分子量不同將分子伴侶分為五個(gè)家族，分別為HSP100家族、HSP90家族、HSP70家族，伴侶蛋白(HSP60)和小HSP家族。共伴侶蛋白能夠與分子伴侶例如HSP60、HSP70或HSP90相互作用，輔助特異底物折疊。近期有研究表明，共伴侶蛋白與其相應(yīng)的分子伴侶也參與了一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。例如，HSP40是HSP70的共伴侶蛋白，它在植物適應(yīng)高鹽環(huán)境中發(fā)揮重要作用。HSP40類蛋白J3通過調(diào)控PSK5活性參與擬南芥耐鹽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，J3能夠通過抑制PKS5激酶活性進(jìn)而促進(jìn)質(zhì)膜H+-ATP酶的活性。SGTl是HSP70/HSP90復(fù)合體的支架蛋白，其在植物生長(zhǎng)素和茉莉素以及SCF E3泛素連接酶依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。近期研究表明，HSP90及SGTlb在ABA調(diào)控種子萌發(fā)和氣孔運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。
分子伴侶/共伴侶蛋白中研究比較深入的是伴侶蛋白HSP60，或稱CPN60/CPN10。伴侶蛋白HSP60/CPN60包括兩組。第一組存在于細(xì)菌和真核生物的葉綠體和線綠體中。在大腸桿菌(E.coli)中，桶裝伴侶蛋白GroEL/CPN60具有一個(gè)頂端疏水區(qū)，其在共伴侶蛋白GroES/CPNIO幫助下形成親水籠，輔助蛋白質(zhì)折疊。折疊后蛋白在GroES/CPNIO與GroEL/CPN60解離后從親水籠中被釋放。第二組伴侶蛋白存在于真核細(xì)胞的胞質(zhì)中，其具有的外延的帽狀結(jié)構(gòu)在功能上與共伴侶蛋白GroES/CPNIO。CPN20是CPN60的共伴侶蛋白，其在豌豆的葉綠體基質(zhì)中首次被發(fā)現(xiàn)。CPN20由一個(gè)前導(dǎo)肽和兩個(gè)同源性為46%的CPNlO類似結(jié)構(gòu)順次連接構(gòu)成。對(duì)擬南芥伴侶蛋白相應(yīng)基因表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CPN20表達(dá)量遠(yuǎn)高于其相應(yīng)的CPN60家族，且其表達(dá)量也高于葉綠體中另外兩個(gè)共伴侶蛋白(CPNIOs)。由此推測(cè)，CPN20可能具有獨(dú)立于其共伴侶蛋白功能的其它功能。而最近的報(bào)道表明，擬南芥葉綠體CPN20調(diào)節(jié)鐵超氧化物歧化酶(FeSOD)活性的功能獨(dú)立于共伴侶蛋白功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種CPN20蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物對(duì)ABA耐受性中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用，具體為由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(命名為CPN20)或其編碼基因(命名為CPN20)在如下al)或a2)中的應(yīng)用:al)調(diào)控植物對(duì)ABA耐受性；a2)選育對(duì)ABA耐受性提高的植物品種。在本發(fā)明中，以上al)中的所述調(diào)控植物對(duì)ABA耐受性均具體為提高植物對(duì)ABA耐受性；以上a2)中的 所述選育對(duì)ABA耐受性提高的植物品種的方法，均具體可包括將所述CPN20蛋白表達(dá)量較高的植株作為親本進(jìn)行雜交的步驟。本發(fā)明還提供一種培育對(duì)ABA耐受性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育對(duì)ABA耐受性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟:a)向目的植物中導(dǎo)入由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因，得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物；b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，對(duì)ABA耐受性提高的轉(zhuǎn)基因植物。在上述應(yīng)用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因(即CPN20基因)是如下I)至5)中任一所述的DNA分子:I)編碼序列為序列表中序列2自5’末端第87至848位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)序列表中序列I所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與I) -3)任一所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子；5)與I) -4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。其中，序列I由1813個(gè)核苷酸組成，為所述CPN20基因在擬南芥基因組中序列，其中第 80-339 位、第 519-788 位、第 971-1069 位、第 1229-1315 位、第 1393-1514 位為 5 個(gè)內(nèi)含子序列；序列2由975個(gè)核苷酸組成，為所述CPN20基因的cDNA序列，其中第87-848位為編碼序列(ORF);序列I和序列2均編碼序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)，序列3由253個(gè)
氨基酸殘基組成。在上述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是通過含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中的。所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、泛素基因Ubiquitin啟動(dòng)子(pUbi)、脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用重組表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。 在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子(具體為花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子)。更為具體的，所述重組表達(dá)載體為將所述CPN20基因插入到pCAMBIA-1300-221載體的多克隆位點(diǎn)XbaI和Kpn I之間后得到的重組質(zhì)粒。在上述方法中，將攜帶有所述CPN20基因的所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物，具體可為:通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。在上述應(yīng)用或方法中，所述植物即可為單子葉植物，也可為雙子葉植物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述植物為雙子葉植物，具體為擬南芥，更加具體為擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型)。在上述方法的步驟b)中，所述“從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，對(duì)ABA耐受性提高的轉(zhuǎn)基因植物”可通過如下方法實(shí)現(xiàn)的:用所述目的植物不能耐受的濃度的ABA處理所述步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物，從而獲得所述“與所述目的植物相比，對(duì)ABA耐受性提高的轉(zhuǎn)基因植物”。
在上述方法中，所述目的植物不能耐受的濃度的ABA為濃度可為0.5 μ Μ_20 μ M的ΑΒΑ,如0.5 μ Μ-5 μ Μ，或5 μ Μ-20 μ Μ,具體如5 μ Μ。所述目的植物不能耐受的濃度是指所述目的植物的生長(zhǎng)狀態(tài)與不用ABA處理的對(duì)照相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的ABA濃度。在上述方法中，所述“用所述目的植物不能耐受的濃度的ABA處理所述步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物”具體為:將所述步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物的種子或幼苗置于含有所述目的植物不能耐受的濃度的ABA的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種對(duì)所述轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行除草的方法。在本發(fā)明所提供的對(duì)所述轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行除草的方法中，所用除草劑是濃度為M的ABA溶液；所述濃度為M的ABA溶液對(duì)于待除雜草來說不能耐受，但對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因植物來說能耐受。在上述方法中，所述“所述濃度為M的ABA溶液對(duì)于待除雜草來說不能耐受，但對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因植物來說能耐受”是指:向所述待除雜草噴灑所述濃度為M的ABA溶液后，所述待除雜草死亡；但向所述轉(zhuǎn)基因植物噴灑所述濃度為M的ABA溶液后，所述轉(zhuǎn)基因植物不死亡，且生長(zhǎng)狀態(tài)與噴灑所述濃度為M的ABA溶液前相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)CPN20蛋白負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，且該功能獨(dú)立于共伴侶蛋白功能。本發(fā)明可應(yīng)用于將植物激素ABA作為一種選擇性除草劑，其選擇性取決于植物對(duì)ABA的敏感性，利用CPN20調(diào)節(jié)植物對(duì)ABA的敏感性或耐受性，獲得CPN20高表達(dá)、抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物，實(shí)現(xiàn)選擇性除草。本發(fā)明符合可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展需求，對(duì)于改良遺傳特性，開拓綠色環(huán)保、無公害的除草方法和途徑等方面具有重要的實(shí)用價(jià)值和市場(chǎng)前景。


圖1為CPN20基因相關(guān)T-DNA插入突變體的鑒定。測(cè)序比對(duì)結(jié)果，cpn20_l突變體中的T-DNA插入到CPN20基因的起始密碼子(ATG)上游第393bp到第376bp之間，插入導(dǎo)致18bp缺失。cpn20-2突變體中T-DNA插入到CPN20基因的起始密碼子(ATG)上游第301bp到第265bp之間,插入導(dǎo)致37bp缺失。圖2為各遺傳材料CPN20基因表達(dá)量的分析結(jié)果。其中，(a)為CPN20相關(guān)突變體的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，CPN20基因的表達(dá)均為相對(duì)值，以擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型)CPN20基因的表達(dá)為100 ； (b)為CPN20相關(guān)突變體免疫印跡檢測(cè)結(jié)果。圖3為ABA對(duì)CPN20各遺傳材料種子萌發(fā)的影響分析結(jié)果。圖4為ABA對(duì)CPN20各遺傳材料幼苗生長(zhǎng)的影響分析結(jié)果(在含ABA培養(yǎng)基上直接播種并觀察生長(zhǎng)表型)。圖5為ABA對(duì)CPN20各遺傳材料幼苗生長(zhǎng)的影響分析結(jié)果(將正常萌發(fā)后的幼苗移到含ABA培養(yǎng)基上并觀察生長(zhǎng)表型)。其中，Ca)為CPN20各遺傳材料種子分別播種在含有不同濃度ABA的MS培養(yǎng)基上(ΟμΜ和5μΜ)，生長(zhǎng)IOd后的幼苗生長(zhǎng)情況；(b)為(a)中對(duì)應(yīng)幼苗的主根長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)。圖6為ABA促 進(jìn)氣孔關(guān)閉和ABA抑制氣孔開放實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，Ca)為ABA促進(jìn)氣孔關(guān)閉實(shí)驗(yàn)中CPN20各遺傳材料的氣孔孔徑大小；(b)為ABA抑制氣孔開放實(shí)驗(yàn)中CPN20各遺傳材料的氣孔孔徑大小。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。pCAMBIA-1300-221 載體:由清華大學(xué)提供(記載文獻(xiàn):Li jing Liu, YiyueZhang, Sanyuan Tang, et a 1.An efficient system to detect proteinubiquitination by agroinfiltration in Nicotiana benthamiana.The PlantJournal, 2010(61):893-903.)。在 pCAMBIA-1300-221 載體中，位于多克隆位點(diǎn)(MCS)上游的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子。在pCAMBIA-1300-221載體中，含有GFP基因。pCAMBIA-1300-221載體相關(guān)信息:http://www.cambia.0rg/daisy/cambia/materials/vectors/585, html。擬南芥野生型(Col-0生態(tài)型):擬南芥野生型種子(Arabidopsis thaliana,ecotype Columbia-0),購(gòu)自擬南芥生物研究中心(ABRC)。CPN20基因相應(yīng)T-DNA插入突變體cpn20_l、cpn20_2種子:購(gòu)自擬南芥生物研究中心(ABRC)。背景為擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型)，cpn20-l、cpn20_2為CPN20基因表達(dá)降低的兩個(gè)T-DNA插入突變體。種子編號(hào)信息:cpn20-l:SAIL_888_A09 ；cpn20-2:SALK_083054C。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens):根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101,由清華大學(xué)提供(記載文獻(xiàn):R.Berres, L.0tten, B.Tinland et al.Transformation of vitis tissueby different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene.Plant Cell Reports, 1992(11):192-195.)。大腸桿菌(Escherichi a coli)菌株DH5 a (DE3)感受態(tài),購(gòu)自全式金生物有限公司。CPN20蛋白抗體:以序列表中序列3所示CPN20蛋白作為免疫原，免疫兔子所得的兔源多克隆抗體。實(shí)施例1、CPN20轉(zhuǎn)基因植物的獲得及鑒定本實(shí)施例中所涉及的CPN20基因來源于擬南芥(Arabidopsis thaliana),其在擬南芥基因組中的序列如序列表中序列I所示，序列I由1813個(gè)核苷酸組成，其中第80-339位、第519-788位、第971-1069位、第1229-1315位、第1393-1514位為5個(gè)內(nèi)含子序列；所述CPN20基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由975個(gè)核苷酸組成，其中第87-848位為編碼序列(ORF);序列I和序列2均編碼序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)(CPN20蛋白)，序列3由253個(gè)氨基酸殘基組成。一、重組表達(dá)載體 pCAMBIA-1300-221-CPN20 的構(gòu)建提取擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型)的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。以所得cDNA為模板，通過引物I與引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化，表明擴(kuò)增得到約760bp片段，測(cè)序表明，該片段具有自序列表中的序列2自5’端起第87-848位核苷酸序列(CPN20基因的編碼序列，0RF) ο引物1:5’ -GGTCTAGAATGGCGGCGACTCAACT-3’ (下劃線部分為 Xba I 的識(shí)別位點(diǎn)，其后的序列為序列2的第87-103位)；引物2:5’-CGGGGTACCCTAAGAAAGTATAGCCATCACATCTG-3’ (下劃線部分為 Kpn I 的識(shí)別位點(diǎn)，其后的序列為序列2的第823-848位的反向互補(bǔ)序列)。
用限制性內(nèi)切酶Xba I和Kpn I雙酶切以上所得PCR產(chǎn)物，膠回收酶切片段，與經(jīng)過同樣雙酶切的pCAMBIA-1300-221載體骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。將所述重組質(zhì)粒送樣測(cè)序，將經(jīng)測(cè)序表明在pCAMBIA-1300-221載體的酶切位點(diǎn)Xba I和Kpn I之間插入了序列表中序列2所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA-1300-221-CPN20。在重組表達(dá)載體PCAMBIA-1300-221-CPN20中，啟動(dòng)所述CPN20基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。在重組表達(dá)載體pCAMBIA-1300-221-CPN20的構(gòu)建過程中，也可以人工合成的序列表的序列2所示的CPN20基因?yàn)槟０?。二、CPN20基因表達(dá)降低突變體鑒定CPN20基因表達(dá)降低的兩個(gè)T-DNA插入突變體，將其命名為cpn20_l和cpn20_2，購(gòu)自擬南芥生物研究中心(ABRC)，遺傳背景為擬南芥野生型(Col-0生態(tài)型)。通過分子生物學(xué)方法鑒定出各自的純合體，并通過測(cè)序?qū)ν蛔凅wT-DNA插入位點(diǎn)進(jìn)行分析。測(cè)序比對(duì)結(jié)果如圖1所示:cpn20-l突變體中的T-DNA插入到CPN20基因的起始密碼子(ATG)上游第393bp到第376bp之間,插入導(dǎo)致18bp缺失。cpn20-2突變體中T-DNA插入到CPN20基因的起始密碼子(ATG)上游第301bp到第265bp之間,插入導(dǎo)致37bp缺失。三、CPN20轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及鑒定1、CPN20轉(zhuǎn)基 因擬南芥及轉(zhuǎn)入pCAMBIA-1300-221空載體的擬南芥植株的獲得將步驟一構(gòu)建的重組表達(dá)載體pCAMBIA-1300-221-CPN20通過凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)。對(duì)轉(zhuǎn)化后的重組農(nóng)桿菌用由引物I和引物2組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR鑒定。將經(jīng)鑒定表明含有CPN20基因(PCR目的條帶大小為760bp)的農(nóng)桿菌GV3101命名為GV3101/pCAMBIA-1300-221-CPN20 ;將轉(zhuǎn)入 pCAMBIA-1300-221 空載體的農(nóng)桿菌GV3101 命名為 GV3101/pCAMBIA-1300-221o采用農(nóng)桿菌花序侵染的方法(SJClough, AF Bent.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal, 1998，16(6):735-743.)將上述所得的重組農(nóng)桿菌 GV3101/PCAMBIA-1300-221-CPN20 (或 GV3101/pCAMBIA-1300_221)轉(zhuǎn)化擬南芥野生型(Col-0)。轉(zhuǎn)化后進(jìn)行潮霉素抗性篩選，在含40mg/L潮霉素MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子，獲得具有潮霉素抗性的兩種轉(zhuǎn)基因苗，即轉(zhuǎn)入PCAMBIA-1300-221-CPN20的擬南芥植株和轉(zhuǎn)入pCAMBIA-1300-221空載體的擬南芥植株(T1 代)。2、CPN20轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定(I) PCR 鑒定從步驟I獲得的T1代CPN20轉(zhuǎn)基因擬南芥，以及轉(zhuǎn)入pCAMBIA-1300-221空載體的對(duì)照植株中分別提取基因組DNA。對(duì)于CPN20轉(zhuǎn)基因擬南芥，以引物I和引物2 (序列同步驟一所述)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)鑒定同時(shí)得到大小約為760bp (外源插入的序列2所示CPN20基因)和1800bp (擬南芥內(nèi)源的序列I所示CPN20基因)兩個(gè)目的條帶的植株即為CPN20轉(zhuǎn)基因陽性植株，而鑒定只得到大小為1800bp目的條帶的植株為CPN20轉(zhuǎn)基因陰性植株。對(duì)于轉(zhuǎn)入pCAMBIA-1300-221空載體的對(duì)照植株，用GFP引物GFP-Fl和GFP-Rl (引物序列如下)進(jìn)行PCR鑒定，經(jīng)鑒定表明含有GFP基因的(PCR產(chǎn)物大小約為700bp)植株即為pCAMBIA-1300-221空載體轉(zhuǎn)入陽性的植株。所用引物序列如下:GFP-Fl:5，-AGGAGAAGAACTTTTCACTGG-3，；GFP-Rl:5’ -GTATAGTTCATCCATGCCATG-3’。經(jīng)上述PCR分子鑒定，將鑒定陽性的其中五個(gè)CPN20轉(zhuǎn)基因擬南芥株系分別記作0E2、0E3、0E4、0E5 和 0E7。(2)轉(zhuǎn)基因擬南芥0E2、0E3、0E4、0E5和0E7純合系的篩選經(jīng)上述鑒定分析后，選擇其中五個(gè)代表性CPN20轉(zhuǎn)基因擬南芥株系0E2、0E3、0E4、0E5和0E7(T1代)。播種于含40mg/L潮霉素MS培養(yǎng)基上，經(jīng)過連續(xù)2代篩選，以所有自交后代均能正常生長(zhǎng)(即所有后代均具潮霉素抗性)的親本植株為純合系，最終獲得T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥0E2、0E3、0E4、0E5和0E7的純合系植株，作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行以下ABA耐受性試驗(yàn)分析。四、轉(zhuǎn)基因擬南芥0E2、0E3、0E4、0E5和0E7純合系中CPN20基因表達(dá)量分析提取擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型)與T-DNA插入突變體cpn20_l、cpn20_2，過表達(dá)植株0E2、0E3、0E4、0E5和0E7的總RNA和總蛋白，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡技術(shù)，分別檢測(cè)材料中CPN20基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上的RNA和蛋白表達(dá)情況。具體如下:1、轉(zhuǎn)錄水平分析(RNA表達(dá)量)
以上述獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥0E2、0E3、0E4、0E5和0E7純合系，T-DNA插入突變體cpn20-l、cpn20-2，以及擬南芥野生型(Col-Ο生態(tài)型)生長(zhǎng)10天的幼苗為實(shí)驗(yàn)材料。提取各實(shí)驗(yàn)材料的基因組RNA，分別通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析CPN20基因在各實(shí)驗(yàn)材料中的表達(dá)情況。其中，擴(kuò)增CPN20基因的引物序列為:引物CPN20-F:5’ -ATGGCGGCGACTCAACTTACAGCG-3’(序列 2 的第 87-110 位)；引物CPN20-R:5’-GACAACCAAACGACGGAACTGGCTC-3’(序列 2 的第 209-233 位的反向互補(bǔ)序列)。以Actin2/8作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增內(nèi)參Actin的引物序列為:Actin-F:5，-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3，，Actin-R:5，-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3，。上述引物的反應(yīng)條件如下:( I)反應(yīng)體系的建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在如下al)或a2)中的應(yīng)用: al)調(diào)控植物對(duì)ABA耐受性； a2)選育對(duì)ABA耐受性提聞的植物品種。
2.由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因在如下al)或a2)中的應(yīng)用: al)調(diào)控植物對(duì)ABA耐受性； a2)選育對(duì)ABA耐受性提聞的植物品種。
3.培育對(duì)ABA耐受性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟: a)向目的植物中導(dǎo)入由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因，得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物； b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，對(duì)ABA耐受性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，或權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是如下I)至5)中任一所述的DNA分子: 1)編碼序列為序列表中序 列2自5’末端第87至848位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的 DNA分子； 3)序列表中序列I所示的DNA分子； 4)在嚴(yán)格條件下與I)-3)任一所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子； 5)與I)-4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的DNA分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是通過含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于:步驟b)中，所述從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，對(duì)ABA耐受性提高的轉(zhuǎn)基因植物，是通過如下方法實(shí)現(xiàn)的:用所述目的植物不能耐受的濃度的ABA溶液處理所述步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物，從而獲得所述與所述目的植物相比，對(duì)ABA耐受性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:所述目的植物不能耐受的濃度的ABA溶液為濃度為0.5 μ Μ-20 μ M的ABA水溶液。
10.一種對(duì)權(quán)利要求3-7任一中所述的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行除草的方法，其特征在于:所用除草劑是濃度為M的ABA溶液；所述濃度為M的ABA溶液對(duì)于待除雜草來說不能耐受，但對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因植物來說能耐受。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種CPN20蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物對(duì)ABA耐受性中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體為由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在如下a1)或a2)中的應(yīng)用a1)調(diào)控植物對(duì)ABA耐受性；a2)選育對(duì)ABA耐受性提高的植物品種。本發(fā)明可應(yīng)用于將植物激素ABA作為一種選擇性除草劑，其選擇性取決于植物對(duì)ABA的敏感性，利用CPN20基因調(diào)節(jié)植物對(duì)ABA的敏感性或耐受性，獲得CPN20基因高表達(dá)、抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物，實(shí)現(xiàn)選擇性除草。本發(fā)明符合可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展需求，對(duì)于改良遺傳特性，開拓綠色環(huán)保、無公害的除草方法和途徑等方面具有重要的實(shí)用價(jià)值和市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)C07K14/415GK103224553SQ20131018896
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月21日
發(fā)明者王小芳, 張曉楓, 姜濤, 張大鵬 申請(qǐng)人:清華大學(xué)