本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種藍(lán)灰鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基以及利用該發(fā)酵培養(yǎng)基制備莫西菌素的方法。

背景技術(shù)：

莫西菌素是一種鏈霉菌(Streptomyces.cyanneogrisens noncyanogenus)發(fā)酵產(chǎn)生的半合成單一成分的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是尼莫克汀的衍生物。莫西菌素在有機(jī)溶劑中易溶，而在水中不溶。結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是C-23位上引入＝N-OCH3基團(tuán)，因此它的親脂性較其他同類藥高，比前體物抗蟲譜廣，驅(qū)殺寄生蟲的能力強(qiáng)。與其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生蟲寄藥的不同之處在于，它是單一成分,有著更廣譜的驅(qū)蟲活性、長(zhǎng)效和安全等特性，并且在極低劑量下就有很強(qiáng)的抗線蟲和節(jié)肢動(dòng)物等體內(nèi)外寄生蟲活性。

此類藥物具有高效、毒副作用低、安全性高以及對(duì)環(huán)境影響小的特點(diǎn)，尤其在驅(qū)線蟲和殺外寄生蟲的方面有著優(yōu)良效果，是目前最有前途的廣譜、高效、新型、無交叉感染的生物殺蟲劑，被譽(yù)為當(dāng)今活性最高的殺蟲劑之一。

目前，現(xiàn)有技術(shù)存在莫西菌素產(chǎn)量低、成本高昂的問題。

鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種藍(lán)灰鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基以及利用該發(fā)酵培養(yǎng)基制備莫西菌素的方法。

本發(fā)明所采用的菌株為藍(lán)灰鏈霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003，已于2014年1月17日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，分類命名為藍(lán)灰鏈霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)，保藏編號(hào)為：CGMCC No.8731。

藍(lán)灰鏈霉菌BJX003孢子絲短，為相當(dāng)緊密的2～3圈螺旋形。孢子卵圓形至短柱形，不易分開，表面光滑。

具體地，本發(fā)明提供了一種利用藍(lán)灰鏈霉菌BJX003制備莫西菌素的方法，包含以下步驟：

步驟(1)：將所述藍(lán)灰鏈霉菌的種子液接種于含有乳糖或玉米淀粉的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得發(fā)酵液；

步驟(2)：從所述發(fā)酵液中提取莫西菌素。

本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中，乳糖或玉米淀粉的加入，可以與其他發(fā)酵培養(yǎng)及組分發(fā)生良好的協(xié)同作用，從而顯著提高莫西菌素的產(chǎn)量。

本發(fā)明中所述步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下成分：葡萄糖40～60g/L、乳糖或玉米淀粉20～50g/L、酵母粉20～50g/L、磷酸氫二鉀1～3g/L、七水硫酸鎂0.5～2g/L、氯化鈉8.5～12.5g/L和碳酸鈣10～30g/L，余量為水；調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5，優(yōu)選7.2。

本發(fā)明所述步驟(1)中玉米淀粉為玉米淀粉原料或經(jīng)過酶解后的玉米淀粉原料；所述酶解步驟如下：取1000份玉米淀粉原料加入水中至完全溶解，得到玉米淀粉溶液，向所述玉米淀粉溶液中加入1～2份α-淀粉酶，在100～110℃條件下快速攪拌，酶解5～10min，冷卻后加入1～2份糖化酶，50～60℃條件下酶解24～28h，即得。

本發(fā)明所采用的玉米淀粉價(jià)格低廉，且經(jīng)過酶解處理后，充分發(fā)揮與其他組分的協(xié)同作用，從而顯著提高莫西菌素的產(chǎn)量。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下成分：葡萄糖40～60g/L、乳糖或玉米淀粉30～40g/L、酵母粉30～40g/L、磷酸氫二鉀1～3g/L、七水硫酸鎂1～1.5g/L、氯化鈉9～11g/L和碳酸鈣15～25g/L，余量為水。

本發(fā)明所述步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25～30℃，相對(duì)濕度為 50～60％，以170～210rpm轉(zhuǎn)數(shù)振蕩培養(yǎng)190～240h；優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28℃，在旋轉(zhuǎn)半徑50～80mm條件下，以190rpm轉(zhuǎn)數(shù)振蕩培養(yǎng)240h。

本發(fā)明所述藍(lán)灰鏈霉菌的種子液接種量為5～10％。所述提取方式為浸提，提取劑為甲醇。

本發(fā)明發(fā)酵液以甲醇為提取劑，采用本領(lǐng)域常規(guī)浸提提取方法，以甲醇為提取劑的浸提過程可以將莫西菌素有效提取出來，且提取過程簡(jiǎn)單、提取率高、提取過程不影響藥物有效成分的生理活性。

作為一個(gè)整體的技術(shù)方案，本發(fā)明優(yōu)選采用以下步驟：

步驟(1)：將所述藍(lán)灰鏈霉菌BJX003的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，接種量為5～10％；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：葡萄糖50g/L、玉米淀粉35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氫二鉀2g/L、七水硫酸鎂1.2g/L、氯化鈉10g/L和碳酸鈣20g/L，余量為水；其中，玉米淀粉為經(jīng)過酶解后的玉米淀粉原料；酶解步驟如下：取1000份玉米淀粉加入水中至完全溶解，得到玉米淀粉溶液，向所述玉米淀粉溶液中加入2份α-淀粉酶(酶活力100000U)，在105℃條件下快速攪拌，酶解5min，冷卻后加入2份糖化酶，60℃條件下酶解24h，即得；調(diào)節(jié)pH值至7.2；發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28℃，相對(duì)濕度為50％，在旋轉(zhuǎn)半徑50mm條件下，以190rpm轉(zhuǎn)數(shù)振蕩培養(yǎng)240h，得發(fā)酵液；

步驟(2)：向所述發(fā)酵液中，加入甲醇浸提提取莫西菌素。

本發(fā)明所述發(fā)酵制備莫西菌素的方法，產(chǎn)量可達(dá)到2890μg/mL，產(chǎn)量可以與乳糖發(fā)酵工藝相媲美，但乳糖價(jià)格高昂，經(jīng)核算成本發(fā)現(xiàn)，使用玉米淀粉發(fā)酵的工藝比乳糖發(fā)酵的工藝成本節(jié)約30％～35％。

本發(fā)明提供了一種發(fā)酵培養(yǎng)基，包含以下組分：葡萄糖40～60g/L、乳糖或玉米淀粉20～50g/L、酵母粉20～50g/L、磷酸氫二鉀1～3g/L、七水硫酸鎂0.5～2g/L、氯化鈉8.5～12.5g/L和碳酸鈣10～30g/L，余量為水；其中所述玉米淀粉為玉米淀粉原料或經(jīng)過酶解后的玉米淀粉原料；所 述酶解步驟如下：取1000份玉米淀粉原料加入水中至完全溶解，得到玉米淀粉溶液，向所述玉米淀粉溶液中加入1～2份α-淀粉酶，在100～110℃條件下快速攪拌，酶解5～10min，冷卻后加入1～2份糖化酶，50～60℃條件下酶解24～28h，即得。

本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基可應(yīng)用于莫西菌素的生產(chǎn)中。

本發(fā)明所采用的藍(lán)灰鏈霉菌BJX003菌株遺傳穩(wěn)定性好，連續(xù)傳代5次后其生產(chǎn)莫西菌素的能力仍保持原來水平。本發(fā)明采用玉米淀粉和乳糖來制備莫西菌素的方法，能夠提高生產(chǎn)莫西菌素的產(chǎn)量，而且方法簡(jiǎn)單；尤其是采用玉米淀粉在保持產(chǎn)量的前提下，成本低廉。因此，本發(fā)明菌株及制備莫西菌素的方法適合于在莫西菌素的工業(yè)生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

本發(fā)明藍(lán)灰鏈霉菌BJX003在驅(qū)蟲藥物中有良好應(yīng)用。本發(fā)明的莫西菌素作為一種廣譜驅(qū)蟲藥物，成分單一，有著更廣譜的驅(qū)蟲活性、長(zhǎng)效和安全等特性，并且在極低劑量下就有很強(qiáng)的抗線蟲和節(jié)肢動(dòng)物等體內(nèi)外寄生蟲的藥物活性。

本發(fā)明所述產(chǎn)品皆為市售，份數(shù)皆為重量份，接種量為體積比，濃度為質(zhì)量濃度。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所采用的菌株為藍(lán)灰鏈霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)BJX003，已于2014年1月17日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，分類命名為藍(lán)灰鏈霉菌(Streptomyces cyaneogriseus)，保藏編號(hào)為：CGMCC No.8731。

實(shí)施例中的產(chǎn)品均為市售產(chǎn)品，檢測(cè)手段為本領(lǐng)域常規(guī)檢測(cè)手段。

實(shí)施例1

本實(shí)施例具體提供了一種通過發(fā)酵藍(lán)灰鏈霉菌BJX003制取莫西 菌素的生產(chǎn)方法。包含以下步驟：

步驟(1)：將所述藍(lán)灰鏈霉菌的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，接種量為5％，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下組分：葡萄糖50g/L、玉米淀粉35g/L、酵母粉35g/L、磷酸氫二鉀2g/L、七水硫酸鎂1.2g/L、氯化鈉10g/L和碳酸鈣20g/L，余量為水；其中，玉米淀粉為經(jīng)過酶解后的玉米淀粉原料；酶解步驟如下：取1000份玉米淀粉加入水中至完全溶解，得到玉米淀粉溶液，向所述玉米淀粉溶液中加入2份α-淀粉酶(酶活力100000U)，在105℃條件下快速攪拌，酶解5min，冷卻后加入2份糖化酶，60℃條件下酶解24h，即得；調(diào)節(jié)pH值至7.2；發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28℃，相對(duì)濕度為50％，在旋轉(zhuǎn)半徑50mm條件下，以190rpm轉(zhuǎn)數(shù)振蕩培養(yǎng)240h，得發(fā)酵液；

步驟(2)：從所述發(fā)酵液中提取莫西菌素，加入甲醇浸提提取莫西菌素，具體提取方法為：將1mL發(fā)酵液加入到裝有9mL甲醇的具塞比色管中，用力混勻后超聲20min，0.45μm濾膜過濾可得。

經(jīng)檢測(cè)，本實(shí)施例所制得莫西菌素產(chǎn)量為2890μg/mL。

實(shí)施例2

本實(shí)施例具體提供了一種通過發(fā)酵藍(lán)灰鏈霉菌BJX003制取莫西菌素的生產(chǎn)方法。本實(shí)施例包含以下步驟：

步驟(1)：將所述藍(lán)灰鏈霉菌的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，接種量為10％，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下組分：葡萄糖40g/L、乳糖20g/L、酵母粉20g/L、磷酸氫二鉀1g/L、七水硫酸鎂0.5g/L、氯化鈉8.5g/L和碳酸鈣10g/L，余量為水；調(diào)節(jié)pH值至7.5；發(fā)酵培養(yǎng)溫度為28℃，相對(duì)濕度60％，在旋轉(zhuǎn)半徑80mm條件下，以210rpm轉(zhuǎn)數(shù)振蕩培養(yǎng)190h，得發(fā)酵液；

步驟(2)：從發(fā)酵液中提取莫西菌素。

經(jīng)檢測(cè)，本實(shí)施例所制得莫西菌素產(chǎn)量為2810μg/mL。

實(shí)施例3

本實(shí)施例具體提供了一種通過發(fā)酵藍(lán)灰鏈霉菌BJX003制取莫西菌素的生產(chǎn)方法。本實(shí)施例包含以下步驟：

步驟(1)：將所述藍(lán)灰鏈霉菌的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，接種量為8％，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖60g/L、乳糖50g/L、酵母粉50g/L、磷酸氫二鉀3g/L、七水硫酸鎂2g/L、氯化鈉12.5g/L和碳酸鈣30g/L；調(diào)節(jié)pH值至7.0；發(fā)酵培養(yǎng)溫度為25℃，相對(duì)濕度55％，在旋轉(zhuǎn)半徑70mm條件下，以170rpm轉(zhuǎn)數(shù)振蕩培養(yǎng)220h，得發(fā)酵液；

步驟(2)：從發(fā)酵液中采用甲醇以浸提方式提取莫西菌素。

經(jīng)檢測(cè)，本實(shí)施例所制得莫西菌素產(chǎn)量為2731μg/mL。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供了一種發(fā)酵培養(yǎng)基，包含以下組分：葡萄糖40g/L、乳糖或玉米淀粉20g/L、酵母粉20g/L、磷酸氫二鉀1g/L、七水硫酸鎂0.5g/L、氯化鈉8.5g/L和碳酸鈣10g/L，余量為水；其中所述玉米淀粉為玉米淀粉原料或經(jīng)過處理的玉米淀粉，所述經(jīng)過處理的玉米淀粉處理步驟如下：取1000份玉米淀粉原料加入水中至完全溶解，得到玉米淀粉溶液，向所述玉米淀粉溶液中加入1份α-淀粉酶，在100℃條件下快速攪拌，酶解5min后，加入1份糖化酶，50℃條件下酶解24h，即得。

步驟(2)：從發(fā)酵液中采用甲醇以浸提方式提取莫西菌素。

經(jīng)檢測(cè)，本實(shí)施例所制得莫西菌素產(chǎn)量為2690μg/mL。

實(shí)施例5

本實(shí)施例提供了一種發(fā)酵培養(yǎng)基，包含以下組分：葡萄糖60g/L、乳糖或玉米淀粉50g/L、酵母粉50g/L、磷酸氫二鉀3g/L、七水硫酸鎂2g/L、氯化鈉12.5g/L和碳酸鈣30g/L，余量為水；其中所述玉米淀粉為玉米淀粉原料或經(jīng)過處理的玉米淀粉，所述經(jīng)過處理的玉米淀粉處理步驟如下：取1000份玉米淀粉原料加入水中至完全溶解，得到玉米淀粉溶液，向所述玉米淀粉溶液中加入2份α-淀粉酶，在110℃條件下 快速攪拌，酶解10min后，加入2份糖化酶，60℃條件下酶解28h，即得。

步驟(2)：從發(fā)酵液中采用甲醇以浸提方式提取莫西菌素。

經(jīng)檢測(cè)，本實(shí)施例所制得莫西菌素產(chǎn)量為2723μg/mL。

由于實(shí)施例1是最佳實(shí)施例，因此實(shí)施例2-5均低于實(shí)施例1。

對(duì)比例1

與實(shí)施例1相比，區(qū)別點(diǎn)僅在于，本對(duì)比例采用的蔗糖取代玉米淀粉或乳糖，其他條件均相同。

本對(duì)比例所制備得到的莫西菌素經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)量為1700μg/mL。

結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米淀粉或乳糖的加入，可以有效提升莫西菌素的收率。

對(duì)比例2

與實(shí)施例1相比，區(qū)別點(diǎn)僅在于，本對(duì)比例所采用的玉米淀粉用量為10g/L，其他條件均相同。

本對(duì)比例所制備得到的莫西菌素經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)量為2000μg/mL。

結(jié)果表明，玉米淀粉20～50g/L的用量范圍，可以與發(fā)酵培養(yǎng)基的其他組分發(fā)生良好的協(xié)同作用，從而有效提升莫西菌素的收率。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。