本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體為一種融合基因pml-rarα來源的ctl表位肽；此外，本發(fā)明還涉及該ctl表位肽的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
急性早幼粒細(xì)胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，apl)是急性髓細(xì)胞白血病(aml)的一種特殊類型，被fab協(xié)作組定為急性髓細(xì)胞白血病m3型。apl是急性白血病中病情十分兇險(xiǎn)的一種類型，其出血癥狀是十分常見的，發(fā)生率達(dá)72％～94％，明顯高于其他急性白血病，往往是彌散性血管內(nèi)血(dic)的表現(xiàn)，尤其是在化療過程中dic可以加重，常致患者早期死亡。apl具有兩個(gè)顯著特點(diǎn)，其一為95％apl患者具有t(15；17)染色體異常，其形成的pml-rarα融合基因是其分子標(biāo)志；其二為對全反式維甲酸(atra)和三氧化二砷療效良好。apl具有特異性的染色體易位t(15；17)，易位使17號染色體上的rarα基因與15號染色體上的pml基因融合，產(chǎn)生融合基因pml-rarα。由于pml基因的斷裂點(diǎn)不同，而rarα斷裂點(diǎn)恒定，導(dǎo)致可以產(chǎn)生相應(yīng)的3種不同pml-rarα融合基因的異構(gòu)體，即pml第3外顯子與rarα第3外顯子結(jié)合形成的p3r3(s型，短型)，pml第6外顯子與rarα第3外顯子結(jié)合形成的p6r3(l型，長型)，極少數(shù)患者為l變異型(v型,5％)，其中以長型(55％)和短型(40％)異構(gòu)體為主。
pml-rarα融合基因表達(dá)的融合蛋白干擾了正常rarα在核內(nèi)的分布和對細(xì)胞分化的調(diào)控，使大量細(xì)胞阻滯在早幼細(xì)胞階段，在apl發(fā)病機(jī)制中起重要作用。其不同的基因異構(gòu)體分型的預(yù)后有明顯不同，s型患者緩解前的死亡率及緩解后的復(fù)發(fā)率均高于l型。因此，將不同類型的apl特異性腫瘤抗原(pml-rarα融合蛋白)加載dc細(xì)胞，用于apl的免疫治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種融合基因pml-rarα來源的高親和力、穩(wěn)定的ctl表位肽。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是上述ctl表位肽的應(yīng)用。
ctl表位的篩選和鑒定是apl特異性免疫治療以及治療性多肽疫苗研制的重要前提。本發(fā)明主要采用理論和實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，預(yù)測、合成并初步鑒定出具有強(qiáng)結(jié)合力的pml-rarα 來源的候選ctl表位肽。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題采用的技術(shù)方案為：
在本發(fā)明的一方面，提供一種融合基因pml-rarα來源的ctl表位肽，為九肽，其序列為plccscall，如seqidno.1所示。
作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述ctl表位肽位于pml-rarα的第210-218位。
作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，所述ctl表位肽是經(jīng)syfpeithi、mhcpep及bimas綜合預(yù)測分析得到，采用標(biāo)準(zhǔn)fmoc方案合成。
所述“pml-rarα來源”是指根據(jù)apl特異性抗原pml-rarα的氨基酸序列，用生物信息學(xué)方法(syfpeithi、mhcpep及bimas等)進(jìn)行預(yù)測分析，綜合分析結(jié)果得到肽段序列，也就是說上述九肽的序列是來自于pml-rarα的序列。
所述“syfpeithi”是基于抗原蛋白氨基酸序列信息預(yù)測t細(xì)胞表位的在線數(shù)據(jù)庫，其數(shù)據(jù)來源于已發(fā)表的數(shù)據(jù)，網(wǎng)址為：http://www.syfpeithi.de。
所述“mhcpep”是mhc(主要組織相容性復(fù)合體)連接肽數(shù)據(jù)庫，預(yù)測肽段的親和力，網(wǎng)址為：http://wehih.wehi.edu.au/mhcpep。
所述“bimas”也是t細(xì)胞表位預(yù)測數(shù)據(jù)庫，網(wǎng)址為：http://www-bimas.cit.nih.gov/。
“syfpeithi、mhcpep及bimas”均為常用的ctl表位預(yù)測數(shù)據(jù)庫。
所述“標(biāo)準(zhǔn)fmoc方案”是指以fmoc(9-芴甲氧羰基)為α-氨基保護(hù)基的一種固相合成法，是多肽合成中應(yīng)用最普遍的合成方法。
在本發(fā)明的另一方面，提供所述ctl表位肽在制備治療apl疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開了來源于apl特異性腫瘤抗原pml-rarα的天然ctl表位肽，上述表位肽經(jīng)t2細(xì)胞結(jié)合力試驗(yàn)及肽/mhc復(fù)合物穩(wěn)定性分析試驗(yàn)，顯示出了高結(jié)合力和穩(wěn)定性，可應(yīng)用于apl治療性多肽疫苗、長肽疫苗、多表位疫苗等的研制，在apl免疫治療領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
實(shí)施例一、pml-rarα來源的ctl表位肽的預(yù)測
本發(fā)明所述的融合基因pml-rarα來源的ctl表位肽，是根據(jù)抗原的一級結(jié)構(gòu)，采用免疫信息學(xué)手段，運(yùn)用在線生物學(xué)軟件syfpeithi、mhcpep及bimas對pml-rarα抗原結(jié)構(gòu)的hla-a*0201限制性進(jìn)行預(yù)測分析，綜合分析結(jié)果篩選得到plccscall，如seqidno.1所示(以下簡稱為“p210”)作為候選ctl表位肽。
實(shí)施例二、候選ctl表位肽的合成
候選ctl表位肽委托吉爾生化(上海)有限公司采用標(biāo)準(zhǔn)fmoc方案進(jìn)行合成，采用反向高效液相色譜法進(jìn)行純化和純度分析，質(zhì)譜法進(jìn)行鑒定和分子量測定，結(jié)果顯示，候選ctl表位肽的純度高于95％，分子量與理論值相符。
實(shí)施例三、上述制備的ctl表位肽可用于apl免疫治療，其應(yīng)用實(shí)驗(yàn)如下：
1候選ctl表位肽t2細(xì)胞結(jié)合力試驗(yàn)
1.1收集t2細(xì)胞(atcccrl-1992tm，為本實(shí)驗(yàn)室保存的atcc標(biāo)準(zhǔn)株)，用無血清rpmi1640培養(yǎng)基洗3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/ml，鋪于24孔板中，1ml/孔。每孔加入2.5μg/ml的β2微球蛋白，50μm的候選肽，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中共孵育18h。
1.2收集孵育后的細(xì)胞，用冰pba洗3次，加入100μl1:100稀釋的一抗bb7.2，4℃避光孵育30min。
1.3冷pba洗3次，加入50μl1:50稀釋的fitc-羊抗鼠igg溶液，4℃避光孵育30min。
冷pba洗滌1次，1mlpba重懸，上流式細(xì)胞儀檢測。以已被鑒定的cox-2321-320(iligeyiki)作為結(jié)合力試驗(yàn)的陽性肽，pbs作為陰性對照，未加肽刺激的t2細(xì)胞作為背景。
檢測結(jié)果用熒光系數(shù)(fi)表示：熒光系數(shù)(fi)＝(候選肽平均熒光強(qiáng)度-背景平均熒光強(qiáng)度)/背景平均熒光強(qiáng)度。
結(jié)果判定：若fi＞1.5，候選肽與hla分子具有強(qiáng)結(jié)合力；若1.5＜fi小于1.0，候選肽具有中等結(jié)合力；若fi＜0.5，候選肽具有弱結(jié)合力。
結(jié)果：p210的fi值為1.67，具有高親和力。
2.肽/mhc復(fù)合物穩(wěn)定性分析
2.1收集t2細(xì)胞，用無血清rpmi1640培養(yǎng)基洗3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/ml，鋪于24孔板中，1ml/孔。每孔加入2.5μg/ml的β2微球蛋白，50μm的候選肽，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中共孵育18h。
2.2收集孵育后的細(xì)胞，用冰pba洗滌3次以洗凈未結(jié)合的肽，加入10μg/mlbrefeldina孵育1h。
2.3分別以0h，2h，4h，6h為時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。
2.4用冷pba洗滌2次，加入100μl1:100稀釋的一抗bb7.2，4℃避光孵育30min。
2.5用冷pba洗滌2次，加50μl1:50稀釋的fitc-羊抗鼠igg，4℃避光孵育30min。
2.6冷pba洗滌1次，1mlpba重懸，上流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果以dc50表示。
結(jié)果：p210的復(fù)合物半衰期大于6小時(shí)。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可說明pml-rarα來源的ctl表位肽p210具有高親和力和穩(wěn)定性，在apl特異性免疫治療領(lǐng)域有著巨大的開發(fā)應(yīng)用潛力。