本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及UCKL1AS在制備前列腺癌診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：前列腺癌是發(fā)生于男性前列腺組織中的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)已經(jīng)成為男性第二大類常見(jiàn)腫瘤，位于癌癥相關(guān)死亡率第六位。在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，它是男性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率居各種癌癥的第二位；在亞洲，其發(fā)病率低于西方國(guó)家，但近年來(lái)呈迅速上升趨勢(shì)，且增長(zhǎng)比歐美發(fā)達(dá)國(guó)家更加迅速。我國(guó)前列腺癌發(fā)病率也在逐年提高，已位于男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第三位，僅次于膀胱癌和腎癌。前列腺癌一般在50歲以后發(fā)病，95％發(fā)生于60歲以上的老年男性，發(fā)生率持續(xù)地隨著年齡增長(zhǎng)而增加。前列腺癌早期多無(wú)任何癥狀，即使有所不適，也不足以引起病人的重視，當(dāng)腫瘤增大壓迫尿道時(shí)，又往往與前列腺增生相混淆。在我國(guó)約80％的病人首先發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶才發(fā)現(xiàn)前列腺癌。此時(shí)，病變已達(dá)晚期，預(yù)后不良。所以，前列腺癌的早期診斷對(duì)前列腺癌病人的治療有極為重大的意義。目前前列腺癌的臨床診斷方式目前主要有前列腺直腸指檢(DRE)、血清前列腺特異性抗原(PSA)檢測(cè)、直腸超聲波檢測(cè)、活組織病理檢查等。直腸指檢是前列腺癌診斷的經(jīng)典技術(shù)，主要通過(guò)醫(yī)生的食指觸摸前列腺，以判斷前列腺結(jié)節(jié)的大小和形狀，從而判斷是否患有前列腺癌。但直腸指檢的局限性也很強(qiáng)：(1)患者前列腺腫塊不大時(shí)，易漏診；(2)部分患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬于晚期；(3)患者直腸有疾患時(shí)不能使用此檢測(cè)；(4)醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)不足時(shí)可能有漏診或者誤診的可能。前列腺超聲波檢測(cè)雖然操作簡(jiǎn)單直觀、無(wú)損傷，但該方法容易與前列腺炎和前列腺肥大混同，已不再用于前列腺癌分期診斷?；罱M織病理檢查因其創(chuàng)傷性、復(fù)雜性不能作為初篩的手段，但它是前列腺癌確診的金標(biāo)準(zhǔn)，一般與其他方法技術(shù)連用。目前對(duì)前列腺癌的篩查診斷主要依靠血清PSA檢測(cè)和前列腺穿刺病理活檢相結(jié)合的方法。正常情況下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml)，當(dāng)處于前列腺癌及其他前列腺疾病患病狀態(tài)時(shí)，PSA升高成為目前篩查前列腺癌最敏感的瘤標(biāo)，但PSA增高也常見(jiàn)與非前列腺癌疾病，如前列腺炎癥、前列腺增生等多重泌尿系統(tǒng)疾病有關(guān)，因此不易確診，甚至可能導(dǎo)致疾病的誤檢、誤診或者病情的延誤。此外，PSA增高確診前列腺癌時(shí)，往往患者已經(jīng)屬于中后期，達(dá)不到早期診斷的目的。而穿刺活檢的檢出率與活體穿刺的次數(shù)、位置都有較大關(guān)系，不是非常穩(wěn)定的診斷方案。因此，研究更有效的前列腺癌標(biāo)記物對(duì)提高前列腺癌的早期診斷及為患者制定合理的個(gè)體化治療方案，減少前列腺癌患者死亡率和改善生活質(zhì)量有重要的意義，如果能有一種檢測(cè)試劑盒，可以提高前列腺癌的檢出率和準(zhǔn)確率，對(duì)于前列腺癌的臨床治療有著重大的意義。lncRNA(longnon-codingRNA，長(zhǎng)鏈非編碼RNA)，是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200bp核苷酸的非編碼RNA，近年研究發(fā)現(xiàn)它是一類具有重要生物學(xué)功能的RNA，參與基因組印記、染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過(guò)程，在細(xì)胞分化和發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、遺傳和表觀遺傳等生命活動(dòng)中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的權(quán)威研究證實(shí)lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著抑制或促進(jìn)腫瘤的作用，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移能力等方面，均具有十分重要作用。目前己有較多l(xiāng)ncRNAs被證實(shí)在包括乳腺癌、前列腺、黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等在內(nèi)的人類多種腫瘤中存在差異表達(dá)并執(zhí)行重要的調(diào)控功能。早期有效檢測(cè)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及提高抗癌藥物的療效對(duì)于癌癥的治療尤為重要，發(fā)明新型腫瘤標(biāo)志物作為診斷與治療的靶點(diǎn)一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)。UCKL1AS屬于lncRNA，全稱是UCKL1antisenseRNA1，位于第20號(hào)染色體，全長(zhǎng)3571bp，目前尚未發(fā)現(xiàn)它在前列腺癌發(fā)生發(fā)展和診斷中的相關(guān)報(bào)道。近年來(lái)的研究表明，lncRNA與前列腺癌密切相關(guān)，它們可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，所以對(duì)腫瘤的發(fā)病機(jī)制、早期診斷、個(gè)體化治療、轉(zhuǎn)移的檢測(cè)和預(yù)后等可能有相應(yīng)的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了實(shí)現(xiàn)前列腺癌的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)，本發(fā)明的目的在于提供一種與前列腺癌相關(guān)的新的分子標(biāo)記物。本發(fā)明的還一目的是提供該分子標(biāo)記物在制備前列腺癌診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供UCKL1AS作為檢測(cè)前列腺癌的分子標(biāo)記物的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述分子標(biāo)記物UCKL1AS包含如SEQIDNO:2所示的特異核苷酸序列。本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)UCKL1AS在前列腺癌生物學(xué)樣品中表達(dá)下調(diào)，顯示UCKL1AS與前列腺癌的腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在著密切的相關(guān)性。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了UCKL1AS在制備前列腺癌診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述的試劑是指檢測(cè)所述的UCKL1AS表達(dá)量的寡聚核苷酸，所述的試劑盒是指包含檢測(cè)所述的UCKL1AS表達(dá)量的寡聚核苷酸。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了檢測(cè)UCKL1AS表達(dá)量的寡聚核苷酸序列在制備前列腺癌診斷試劑或試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，所述寡聚核苷酸包含如SEQIDNO:3-6的組合。更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種前列腺癌診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括以下組分：(1)組織樣本、血液或尿液中總RNA提取試劑：Trizol、氯仿、異丙醇和75％乙醇等。(2)反轉(zhuǎn)錄試劑：逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定DNA聚合酶活性的酶、RNA酶抑制劑和T重復(fù)寡核苷酸OligodT。(3)定量PCR試劑：PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs組成的SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，引物和RNaseFreeH2O。(4)前列腺正常組織cDNA：作為陰性對(duì)照與檢測(cè)樣本cDNA共同定量PCR檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)體系使用與檢測(cè)樣本cDNA相同量。優(yōu)選的，所述試劑盒中的定量PCR試劑中的引物為SEQIDNO:3-6的組合。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明公開(kāi)了一種與前列腺癌相關(guān)的新的分子標(biāo)記物UCKL1AS，并進(jìn)一步證實(shí)UCKL1AS在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，可在制備檢測(cè)前列腺癌的試劑或工具中應(yīng)用。利用該分子標(biāo)記物可以在腫瘤發(fā)生的早期進(jìn)行診斷，快速有效，不僅對(duì)腫瘤的早期治療和醫(yī)療成本的節(jié)約有重要意義，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點(diǎn)和重要依據(jù)。附圖說(shuō)明圖1本發(fā)明中實(shí)施例2中前列腺癌組織樣本中UCKL1AS表達(dá)下調(diào)。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購(gòu)買(mǎi)得到。本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)10例前列腺癌組織樣本及對(duì)應(yīng)癌旁組織樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)方法進(jìn)行基因篩選，挑選出候選lncRNAUCKL1AS，現(xiàn)有研究中并沒(méi)有UCKL1AS和前列腺癌相關(guān)的報(bào)道，進(jìn)一步，發(fā)明人進(jìn)行了分子生物學(xué)方法驗(yàn)證，證實(shí)了UCKL1AS在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，其相關(guān)制劑可用于治療前列腺癌。本發(fā)明的UCKL1AS是在本發(fā)明之前的已知lncRNA，其基本信息如下：Genbank登錄號(hào)：GeneID:100113386，來(lái)源于人類基因組，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明采用RT-PCR方法檢測(cè)上述lncRNA在前列腺癌患者和正常人群中的表達(dá)，并驗(yàn)證了該lncRNA在前列腺癌患者中表達(dá)下調(diào)。熒光定量PCR法是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。熒光定量PCR的出現(xiàn)，極大地簡(jiǎn)化了定量檢測(cè)的過(guò)程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對(duì)定量。多種檢測(cè)系統(tǒng)的出現(xiàn)，使實(shí)驗(yàn)的選擇性更強(qiáng)。自動(dòng)化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。本發(fā)明UCKL1AS的核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA作為模板，擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次擴(kuò)增，然后再將多次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。實(shí)施例1高通量測(cè)序篩選差異表達(dá)基因1、取樣選取10例新鮮前列腺癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織，取樣來(lái)源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間行根治性前列腺切除并雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的前列腺癌病人，手術(shù)切除前列腺后在病理科醫(yī)生的指導(dǎo)下立即取前列腺癌及癌旁組織放入液氮，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。2、對(duì)組織樣本進(jìn)行總RNA提取采用Reagent(invitrogen，貨號(hào)15596-018)進(jìn)行樣本RNA提取，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織樣本放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①入1mLTrizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過(guò)的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時(shí)后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無(wú)明顯差異。3、RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進(jìn)而通過(guò)NanoDrop1000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品的提取情況，RNA-seq測(cè)序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。4、高通量測(cè)序測(cè)序平臺(tái)為Illumina公司的HiSeq2500高通量測(cè)序平臺(tái)，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序，測(cè)序后我們運(yùn)用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達(dá)分析時(shí)，根據(jù)得到的FPKM值，采用國(guó)際公認(rèn)算法EBSeq進(jìn)行差異篩選。其中，篩選時(shí)，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。為了更好的理解差異表達(dá)基因的功能，我們對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了GeneOntology和信號(hào)通路分析，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)我們篩選了差異表達(dá)UCKL1AS，UCKL1AS在前列腺癌樣本組織中表達(dá)下調(diào)。實(shí)施例2RT-PCR驗(yàn)證前列腺癌組織中UCKL1AS表達(dá)情況1、材料選取10例前列腺癌患者，取樣來(lái)源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間行根治性前列腺切除并雙側(cè)盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)的前列腺癌病人，手術(shù)切除前列腺后在病理科醫(yī)生的指導(dǎo)下立即取前列腺癌及癌旁組織放入液氮，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。2、方法2.1對(duì)被試者組織樣本進(jìn)行總RNA提取，同實(shí)施例1的提取方法。2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號(hào)18080-044)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，具體操作如下：使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)lμg總RNA進(jìn)行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總RNA作為模板RNA。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。2.3、Real-TimePCR2.3.1儀器及分析方法用ABI7500型熒光定量PCR儀，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。2.3.2引物設(shè)計(jì)采用在線引物設(shè)計(jì)軟件，基因序列參照NCBI:NR_027287.1(UCKL1AS)，內(nèi)參選GAPDH，引物設(shè)計(jì)后由invitrogen公司合成。具體引物序列如表1所示：表1引物序列操作過(guò)程如下：(一)反應(yīng)體系：用PowerGreenPCRMasterMix(invitrogen，貨號(hào)4367659)進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5min，(95℃15sec，61℃45sec，72℃35sec)×40個(gè)循環(huán)。表2RealTime反應(yīng)體系組分加入量2×mix10μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μL模板2μL加入滅菌蒸餾水至25μL(二)引物篩選將各樣本cDNA混合后，以此為模板進(jìn)行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在60-95℃進(jìn)行融解曲線分析，根據(jù)擴(kuò)增效率高和溶解曲線單峰原則進(jìn)行引物篩選。(三)樣品RealTime-PCR檢測(cè)將各樣品cDNA10倍稀釋后取2μL作模板，分別對(duì)目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在60-95℃進(jìn)行溶解曲線分析。(四)瓊脂糖電泳上述反應(yīng)結(jié)束后，取5μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖電泳，用快速膠回收試劑盒(invitrogen公司)將大小為346bp的片段進(jìn)行切膠回收，取部分測(cè)序，結(jié)果用blast軟件進(jìn)行同源性分析。(五)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，極限平而無(wú)上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說(shuō)明擴(kuò)增效率較高；樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增；根據(jù)qRT-PCR的相對(duì)定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較UCKL1AS在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，其中UCKL1AS在前列腺癌組織中的表達(dá)水平僅為對(duì)照組織的38％，如圖1所示。以上結(jié)果驗(yàn)證了高通量轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)的整合分析UCKL1AS在前列腺癌患者中表達(dá)下調(diào)的結(jié)果。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后，在ABI3730全自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序，該346bp的片段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。用VectorNTIadvance10軟件(Invitrogen公司)將該序列與UCKL1AS整個(gè)mRNA序列進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示，如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列為UCKL1AS的一部分序列，符合率為100％。實(shí)施例3試劑盒的制備基于實(shí)施例2得到的引物組，組裝本發(fā)明所述的前列腺癌診斷試劑盒，特異擴(kuò)增如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的引物對(duì)如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示，和特異擴(kuò)增管家基因(GAPDH)的引物對(duì)如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示；還包括SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，如PCR緩沖液、SYBRGreen熒光染料、dNTPs。所述PCR緩沖液的成分為25mMKCl，2.5mMMgCl2，200mM(NH4)2SO4。通過(guò)對(duì)引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，最終確定前列腺癌診斷試劑盒的組成包括：(1)組織樣本、血液或尿液中總RNA提取試劑；(2)反轉(zhuǎn)錄試劑；(3)定量PCR試劑；(4)前列腺正常組織cDNA:作為陰性對(duì)照與檢測(cè)樣本cDNA共同定量PCR檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)體系使用與檢測(cè)樣本cDNA相同量。每50mg組織或200μL血液或200μL尿液中總RNA提取試劑如表3所示，反轉(zhuǎn)錄試劑的具體成分和用量如表4所示，定量PCR試劑的具體成分和用量如表5所示。表3組織樣本、血液或尿液中總RNA提取試劑組分使用量Trizol1mL氯仿0.2mL異丙醇0.5mL75％乙醇1mL表4反轉(zhuǎn)錄試劑組分每個(gè)反應(yīng)體系使用量5xPrimeScriptBuffer2μLPrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μLOligodTPrimer(50微摩爾)0.5μLRandom6mers(100微摩爾)0.5μLRNaseFreedH20補(bǔ)齊至10μL表5定量PCR試劑組分每個(gè)反應(yīng)體系使用量SYBRGreen聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系12.5μLForwardPrimer(1μM)1μLReversePrimer(1μM)1μLRNaseFreedH2O至25μL最佳反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，(95℃變性15sec，61℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40個(gè)循環(huán)，72℃延伸15min。實(shí)施例4本前列腺癌的診斷試劑盒的應(yīng)用1、病例選取30例待篩查的前列腺癌患者，取樣來(lái)源于北京協(xié)和醫(yī)院2012年10月到2015年12月期間泌尿科治療的病人。獲取所有研究對(duì)象的前列腺癌組織樣本，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。本研究的所有臨床樣本，均對(duì)患者進(jìn)行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)。2、方法使用常規(guī)方法或使用特定的試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用實(shí)施例3中的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)反應(yīng)。以試劑盒中前列腺正常組織cDNA作為QPCR定量檢測(cè)中的對(duì)照cDNA，檢測(cè)組織樣本中的UCKL1AS相對(duì)前列腺正常組織表達(dá)量變化。3、結(jié)果通過(guò)溶解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量，樣本和對(duì)照間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。結(jié)果顯示，待篩查的30例前列腺癌患者的組織樣本中有4例患者組織樣本中UCKL1AS的表達(dá)量和前列腺癌正常組織表達(dá)量無(wú)顯著差異；有26例患者組織樣本中UCKL1AS的表達(dá)量是前列腺癌正常組織表達(dá)量的65％以下，其中有23例患者組織樣本中UCKL1AS的表達(dá)量是前列腺癌正常組織表達(dá)量的40％以下。經(jīng)臨床進(jìn)一步檢測(cè)，30例待篩查的患者中確診23例前列腺癌，這23例前列腺癌患者與本發(fā)明制備的試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致。據(jù)此推斷，本前列腺癌的診斷試劑盒可以明確區(qū)分出前列腺癌患者，并以此為臨床提供診斷線索。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3