本發(fā)明涉及煙用添加劑領(lǐng)域，具體涉及利用固定化醋酸菌制備煙用覆盆子提取物的制備方法。

背景技術(shù)：

加香加料是卷煙工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是完善產(chǎn)品風(fēng)格的決定因素和提高卷煙香氣質(zhì)量的有效手段之一。目前煙用香精香料主要還是通過對天然動植物的提取、化學(xué)合成制備。由于受到天然植物資源有限以及化學(xué)合成條件較苛刻限制。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，近年來，利用微生物發(fā)酵法制備煙用香原料，為煙用香原料的生產(chǎn)提供一條經(jīng)濟(jì)、高效的途徑，開發(fā)一些傳統(tǒng)方法無法生產(chǎn)的新型煙用香原料。

微生物固定化技術(shù)，是將特選的微生物固定在選證的載體上，使其高度密集并保持生物活性，在適應(yīng)條件下能夠快速、大量增殖的生物技術(shù)，能夠彌補(bǔ)懸浮微生物發(fā)酵處理效率低、固液分離困難、抗毒性差等缺點(diǎn)。因此，近年來，微生物固定化技術(shù)的研究非?；钴S，發(fā)展較快，已應(yīng)用到許多工業(yè)部門如食品發(fā)酵工業(yè)，環(huán)境保護(hù)，新能源開發(fā)以及生物傳感器等，并取得了深入發(fā)展，顯示出了強(qiáng)大的優(yōu)越性。主要涉及到以下幾個方面：在食品發(fā)酵工業(yè)中用于生產(chǎn)乙醇、啤酒、酸奶等；在環(huán)境保護(hù)中用于環(huán)境監(jiān)測和工業(yè)廢水的處理；在新能源開發(fā)中用于生產(chǎn)氫氣、甲烷、生化電池、微生物電池等；固定化微生物還可作為分子識別元件，用于制作各種生物傳感器。而隨著固定微生物技術(shù)的不斷成熟、完善，逐漸向高效低能耗、低成本、簡單化、安全自動化、無污染等方向發(fā)展，在能源危機(jī)、資源短缺、環(huán)境污染日趨嚴(yán)重的情況下，由此將推動其在廢水處理方面更加深入和廣泛的應(yīng)用，具有更加深遠(yuǎn)的意義。尤其在廢水處理方面，具有很大的應(yīng)用前景。但在利用微生物固定化技術(shù)制備煙用覆盆子提取物卻未見報道。

覆盆子(學(xué)名：rubuschingiihu)為薔薇科懸鉤子屬植物的干燥果實(shí)，分布于江蘇、浙江、安徽、福建、江西、廣西等地。具有益腎固精縮尿，養(yǎng)肝明目之功效，常用于治療遺精滑精，遺尿尿頻，陽痿早泄，目暗昏花等。以覆盆子為原料的覆盆子浸膏、覆盆子提取物在卷煙中應(yīng)用廣泛，具有豐富煙香、柔和細(xì)膩煙氣、增加煙氣濃度、降低刺激性的作用。

醋酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量醋酸等有機(jī)酸細(xì)菌的通稱，醋酸菌廣泛應(yīng)用于食醋、果醋等釀造行業(yè)中，但在煙用天然香料的制備中卻很少報道。醋酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量有機(jī)酸，這些有機(jī)酸在卷煙中具有降低刺激性和柔和細(xì)膩煙氣的作用，同時，還能賦予卷煙特征的酸香風(fēng)格，因此，醋酸菌發(fā)酵在提升煙用天然香料的品質(zhì)方面具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種煙用煙用覆盆子提取物的制備方法，采用固定化醋酸菌發(fā)酵技術(shù)，開發(fā)了一種新型的覆盆子提取物，該提取物可以在卷煙中使用，能夠豐富煙香，提升卷煙香氣質(zhì)量，增加卷煙香氣透發(fā)性，柔和細(xì)膩煙氣，降低刺激性，改善喉部舒適性，掩蓋雜氣，改善余味

本發(fā)明提供一種固定化醋酸菌制備煙用覆盆子提取物的方法，其特征在于具體包括以下步驟：

(1)取覆盆子干果，加入其重量2～6倍的水，浸泡12-24h，在95～100℃下回流提取2～3次，每次提取時間為5～8小時，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并多次提取液，得到覆盆子提取物a；

(2)將醋酸菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48小時，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；

(3)醋酸菌的聚乙烯醇-海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質(zhì)量百分比6％～10％的聚乙烯醇和質(zhì)量百分比1％～3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總?cè)芤后w積的2～5％的步驟(2)中制備的醋酸菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動泵經(jīng)過1～5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到cacl2的質(zhì)量百分比為1～3％的硼酸飽和溶液中，交聯(lián)1h形成小球，然后將小球取出再加入飽和na2so4溶液中交聯(lián)3-5h，得到pva-sa固定化醋酸菌小球，最后采用無菌水沖洗，烘干備用；

(4)將覆盆子提取物a與步驟(3)中烘干的pva-sa固定化醋酸菌小球按照質(zhì)量比5～10:1混合，在溫度為30～37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為1～5rpm的條件下發(fā)酵2～4d，然后置于4℃冷柜中靜置7～14d；

(5)將步驟(4)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，并將發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，其冷凍干燥的料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時間為6～12h；

(6)將步驟(5)冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2～4倍的80～95％酒精溶液，沉淀24～48小時，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對密度為1.10～1.15，得覆盆子提取物。

本發(fā)明中采用的醋酸菌為醋化醋桿菌(acetobacteraceti)pdh2.05，于2016年8月29日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為cctccno：m2016436。

本發(fā)明采用的微生物固定化技術(shù)具有發(fā)酵處理效率高、固液分離容易、抗毒性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)傳統(tǒng)生物工藝的不足。

本發(fā)明以覆盆子為原料，利用固定化醋酸菌發(fā)酵覆盆子提取物，獲得了一種品質(zhì)優(yōu)良的煙用覆盆子提取物，該提取物在卷煙中具有豐富煙香、增加覆盆子特征香韻、柔和細(xì)膩煙氣、增加煙氣成團(tuán)性、增加煙氣濃度、降低刺激性、改善喉部舒適性等作用，還能賦予卷煙特色的酸香風(fēng)格。與現(xiàn)有覆盆子浸膏和覆盆子提取物相比，該覆盆子提取物在卷煙中降低激性和柔和細(xì)膩煙氣的效果較明顯，同時還賦予卷煙特色的酸香風(fēng)格；與懸浮醋酸菌發(fā)酵相比，該方法制備的覆盆子提取物有機(jī)酸含量增加了4.32％～9.65％，卷煙效果評價中，口腔余味更加舒適，香氣更加豐富。該方法替代了覆盆子提取物傳統(tǒng)的提取技術(shù)，更新了生物發(fā)酵制備工藝，使得其能夠在卷煙中適用性增加，對煙用覆盆子提取物的制備提供了一條新途徑。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)的描述。

本發(fā)明中采用的醋酸菌為醋化醋桿菌(acetobacteraceti)pdh2.05，于2016年8月29日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為cctccno：m2016436。

本發(fā)明以下實(shí)施例中的pva-sa(聚乙烯醇-海藻酸鈉)固定化醋酸菌小球是按照以下方法采用聚乙烯醇(pva)和海藻酸鈉(sa)對醋酸菌進(jìn)行固定化得到的：

(1)將醋酸菌接種到肉湯培養(yǎng)基中，在溫度37℃、攪拌轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下培養(yǎng)48小時，取培養(yǎng)液于8000rpm下離心，離心后的濕菌體備用；上述方法中肉湯培養(yǎng)基為常用的普通肉湯培養(yǎng)基，其具體配方為(每升)：蛋白胨10g，牛肉膏粉3g，氯化鈉5g，最終ph7.3±0.1；

(2)醋酸菌的聚乙烯醇-海藻酸鈉固定化：采用聚乙烯醇水溶液與海藻酸鈉水溶液配制含質(zhì)量百分比6％-10％的聚乙烯醇和質(zhì)量百分比1％-3％的海藻酸鈉的混合溶液，然后向混合溶液中加入總?cè)芤后w積的2-5％的步驟(2)中制備的醋酸菌濕菌體，配制成混合液，用蠕動泵經(jīng)過1-5mm孔徑的針頭將配制好的混合液逐滴加入到cacl2的質(zhì)量百分比為1-3％的硼酸飽和溶液中，交聯(lián)1h形成小球，然后將小球取出再加入飽和na2so4溶液中交聯(lián)3-5h，得pva-sa固定化醋酸菌小球，最后采用無菌水沖洗，烘干備用；所述含有1-3％cacl2的硼酸飽和溶液的量和飽和na2so4溶液的量并無特殊要求，含有1-3％cacl2的硼酸飽和溶液只需要能夠使混合液產(chǎn)生沉淀，滿足醋酸菌的固定化要求即可，na2so4溶液的只需要將小球完全浸泡便可；所述硼酸飽和溶液和飽和na2so4溶液均為飽和水溶液。

實(shí)施例1，一種固定化醋酸菌制備煙用覆盆子提取物的方法，包括以下步驟：

(1)向覆盆子干果中加入其重量加入5倍的水，在100℃下回流提取2次，每次提取時間為5小時，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并兩次提取液，得到覆盆子提取物a，兩次提取的條件完全相同；

(2)將覆盆子提取物a與上述方法制備的pva-sa固定化醋酸菌小球按照質(zhì)量比5:1混合，在溫度為30℃，攪拌轉(zhuǎn)速為5rpm的條件下發(fā)酵4d，然后置于4℃冷柜中保存10d；

(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，并將過濾后的發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時間為8h；

(4)將步驟(3)冷凍干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量3倍的95％酒精溶液，沉淀24小時，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對密度為1.15，得覆盆子提取物。

實(shí)施例1中制備的覆盆子提取物添加到卷煙中豐富煙香，增加覆盆子特征香韻和酸香香韻，柔和細(xì)膩煙氣，增加煙氣成團(tuán)性，增加煙氣濃度，降低刺激性，改善喉部舒適性。

實(shí)施例2，一種固定化醋酸菌制備煙用覆盆子提取物的方法，包括以下步驟：

(1)取覆盆子干果，加入其重量6倍的水，在95℃下回流提取3次，每次提取時間為7小時，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并三次提取液，得到覆盆子提取物a；三次提取的條件完全相同；

(2)將覆盆子提取物a與制備的固定上述方法中制備的pva-sa固定化醋酸菌小球按照質(zhì)量比8:1混合，在溫度為35℃，攪拌轉(zhuǎn)速為1rpm的條件下發(fā)酵3d，然后置于4℃冷柜中保存8d；

(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，并將過濾后的發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時間為10h；

(4)將步驟(3)中干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量4倍的濃度80％酒精溶液，沉淀48小時，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對密度為1.10，得覆盆子提取物。

實(shí)施例2中制備的覆盆子提取物添加到卷煙中豐富煙香，增加覆盆子特征香韻和酸香香韻，柔和細(xì)膩煙氣，增加煙氣成團(tuán)性，增加煙氣濃度，降低刺激性，改善喉部舒適性。

實(shí)施例3，一種固定化醋酸菌制備煙用覆盆子提取物的方法，包括以下步驟：

(1)取覆盆子花，加入其重量3倍的水，在95℃下回流提取3次，每次提取時間為8小時，提取完后冷卻至室溫，并過濾得到提取液，合并三次提取液，得到覆盆子提取物a；三次提取條件完全相同；

(2)將覆盆子提取物a與上述方法制備的pva-sa固定化醋酸菌小球按照質(zhì)量比10:1混合，在溫度為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為4rpm的條件下發(fā)酵2d，然后置于4℃冷柜中保存7d；

(3)將步驟(2)發(fā)酵后發(fā)酵液過濾，得澄清發(fā)酵液，并將過濾后的發(fā)酵液進(jìn)行冷凍干燥，料液厚度為1～2厘米，真空度為10pa，干燥時間為6h；

(4)將步驟(3)干燥后的發(fā)酵液，加入其質(zhì)量2倍的濃度95％酒精溶液，沉淀48小時，過濾取上清液在壓力為0.1mpa，溫度為45℃的條件下濃縮至相對密度為1.15，得覆盆子提取物。

實(shí)施例3中制備的覆盆子提取物添加到卷煙中豐富煙香，增加覆盆子特征香韻和酸香香韻，柔和細(xì)膩煙氣，增加煙氣成團(tuán)性，增加煙氣濃度，降低刺激性，改善喉部舒適性。

對比實(shí)驗(yàn)，申請人將本發(fā)明制備的黃春菊提取物與現(xiàn)有傳統(tǒng)提取方法制備的黃春菊提取物、采用懸浮醋酸菌發(fā)酵制備的黃春菊提取物按照正常加香方式添加到煙絲中，制成卷煙，并進(jìn)行評吸，其評吸效果如下：

三種不同工藝制備的覆盆子提取在卷煙中的感官評價效果比較

從上述對比實(shí)驗(yàn)可以看出來，本發(fā)明中制備的黃春菊提取物添加到卷煙中效果更好，而且根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與懸浮醋酸菌發(fā)酵相比，該方法制備的覆盆子提取物有機(jī)酸含量增加了4.32％～9.65％，卷煙效果評價中，口腔余味更加舒適，香氣更加豐富。