本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種水稻粒寬基因gw2的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國是最主要的水稻生產(chǎn)與消費大國，在過去的幾十年間，水稻產(chǎn)量翻了幾番，水稻產(chǎn)量相關(guān)基因的研究也取得巨大突破，包括qgl3、gw2、qsw5/gw5、gs3、gs5、gw8等基因相繼被克隆。水稻的產(chǎn)量主要取決于穗數(shù)、每穗粒數(shù)和粒重，而粒重則主要由粒形的長、寬、厚三個基本性狀決定。在構(gòu)成水稻產(chǎn)量的三要素中，粒重(通常用千粒重表示)的遺傳比較穩(wěn)定，同時，由于粒重又與水稻的外觀品質(zhì)和蒸煮食味品質(zhì)等存在著密切的關(guān)系，因而一直倍受水稻育種家和科研工作者的重視。

水稻gw2是song等(songxj,huangw,shim,etal.aqtlforricegrainwidthandweightencodesapreviouslyunknownring-typee3ubiquitinligase.naturegenetics,2007,39:623-630)克隆到的一個控制粒寬和粒重的主效基因。其功能性堿基突變?yōu)閷捔Ｋ镜膅w2等位基因在第四外顯子上缺失了一個a，導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，丟失310個氨基酸殘基。gw2編碼一個新類型的ring型e3泛素連接酶，通過將其底物錨定到蛋白酶體進行降解，從而負調(diào)節(jié)細胞的分裂。大粒水稻中氨基酸殘基的缺失使gw2無法結(jié)合底物，無法控制泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解，進而導(dǎo)致穎花外殼細胞分裂和細胞數(shù)目增加，從而正調(diào)控穎花外殼的寬度，增加了粒重。

目前已報道的能用于gw2基因型篩選的標(biāo)記有張亞東等(張亞東，梁彥麗，鄭佳等.極端粒形水稻粒寬基因gw2的序列分析和效應(yīng).中國水稻科學(xué)，2014，28(6)：581-588)設(shè)計的一個dcaps標(biāo)記，利用該標(biāo)記他們檢測8個秈稻骨干恢復(fù)系和10個江蘇省主栽粳稻品種，結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)寬粒表型gw2等位基因的存在，證明gw2基因在水稻育種應(yīng)用中還比較有限，表明gw2基因利用潛能巨大。

雖然利用張亞東等設(shè)計的dcaps功能分子標(biāo)記，能準(zhǔn)確鑒定gw2基因型。但該標(biāo)記在進行pcr后還需要進行酶切反應(yīng)，操作過程相對繁瑣、實驗成本上也相對較高，在檢測通量上也受到限制。因此，開發(fā)一種成本更低、檢測準(zhǔn)確性和通量更高的分子標(biāo)記用于gw2基因分型，將極大促進水稻寬粒新種質(zhì)的篩選和突變型gw2基因在粒型改良中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點與不足，提供一種水稻粒寬基因gw2的分子標(biāo)記。

本發(fā)明的第二個目的是提供利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻粒寬基因gw2基因型的方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個目的是提供利用上述分子標(biāo)記鑒定水稻粒寬或同時鑒定水稻粒寬基因gw2基因型和水稻粒寬的方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種水稻粒寬基因gw2的分子標(biāo)記，其通過核苷酸序列如seqidno.1-3所示的引物擴增得到。

本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記在鑒定水稻粒寬基因gw2基因型中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記在鑒定水稻粒寬中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了用于檢測水稻粒寬基因gw2的特異性引物組合，含有核苷酸序列如seqidno.1-3所示的引物。

其中，seqidno.1所示的正向引物gw2-f1:cacaatgtccattctgccaact，seqidno.2所示的正向引物gw2-f2:agcctacacaatgtcgattctgcaaaac，和seqidno.3所示的反向引物gw2-r:tgttctatgctcctttcctcctttg。

本發(fā)明上述引物組合是針對寬粒水稻gw2等位基因第四外顯子上，一個導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止并丟失310個氨基酸殘基的堿基缺失設(shè)計、篩選后獲得。gw2-f1和gw2-f2的引物結(jié)合位置相同，但3’末端堿基分別為ct和ac，只能分別與突變型(寬粒)和野生型(窄粒)品種的gw2進行堿基配對。此外gw2-f2的5’端增加了特異序列agccta用以引入擴增片段長度多態(tài)性，gw2-f1的3’端第5個堿基引入了a→c的突變，gw2-f2的3’端第13個堿基引入了c→g的突變用以擴大gw2-f1和gw2-f2對目標(biāo)序列識別能力的差異。gw2-r可以分別與gw2-f1和gw2-f2配對擴增出81bp和88bp的pcr產(chǎn)物。

本發(fā)明提供了前述特異性引物組合在鑒定水稻粒寬基因gw2基因型中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了前述特異性引物組合在鑒定水稻粒寬中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了前述特異性引物組合在水稻種質(zhì)資源改良中的應(yīng)用。

進一步地，本發(fā)明提供了檢測水稻粒寬基因gw2基因型的方法，首先對待測樣本提取基因組dna后，利用seqidno.1和seqidno.2所示的正向引物、seqidno.3所示的反向引物進行pcr，對pcr擴增產(chǎn)物大小進行分析，

若擴增產(chǎn)物只出現(xiàn)88bp條帶，則表明待測樣品的gw2基因為野生型；若只出現(xiàn)81bp條帶，則表明待測樣品的gw2基因為突變型；若同時出現(xiàn)88bp和81bp條帶，則表明待測樣品的gw2基因為雜合型。

81bp條帶的參考序列如seqidno.4所示，88bp條帶的參考序列如seqidno.5所示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，由于水稻品種的差異，設(shè)計引物時預(yù)測的pcr產(chǎn)物序列只能作為參考序列，而從不同品種中擴增出來的產(chǎn)物的序列可能和參考序列完全一致，也可能與參考序列有部分堿基差異，但這種差異通常不會影響標(biāo)記的使用。

本發(fā)明還提供了一種檢測水稻粒寬的方法，對待測樣本提取基因組dna后，利用seqidno.1和seqidno.2所示的正向引物、seqidno.3所示的反向引物進行pcr，對pcr擴增產(chǎn)物大小進行分析，

若擴增產(chǎn)物只出現(xiàn)88bp條帶，則表明待測樣品的谷粒較窄；若只出現(xiàn)81bp條帶，則表明待測樣品的谷粒較寬；若同時出現(xiàn)88bp和81bp條帶，則待測樣品的粒寬處于兩親本之間。

進一步地，上述pcr的反應(yīng)體系為：biomiga的2×benchtop^tmtaqmastermix5μl，10μm的兩個正向、一個反向引物各0.5μl，10％dmso0.5μl，模板dna約50-100ng，補滅菌ddh2o至10μl；

pcr反應(yīng)條件為：94℃，4min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，20s，共35個循環(huán)；72℃，5min，16℃，1min。

在本發(fā)明的一個實施例中，是通過將pcr擴增產(chǎn)物進行page膠電泳進行判斷，page膠電泳條件為：6％page膠，u＝2000v，i＝200ma，p＝85w，電泳50min。

含有本發(fā)明所述的特異性引物組合的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明提供了上述含有seqidno.1-3所示引物的試劑盒在寬粒型水稻選育中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述含有seqidno.1-3所示引物的試劑盒在水稻種質(zhì)資源篩選和改良中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明基于水稻粒寬基因gw2第四個外顯子上的一個功能性堿基缺失，設(shè)計開發(fā)了一種擴增片段短，特異性強的三引物分子標(biāo)記。利用該標(biāo)記，只需通過簡單的pcr和page凝膠電泳檢測即可完成對gw2的基因分型，預(yù)測水稻粒寬。本發(fā)明具有基因分型更準(zhǔn)確、成本更低廉、檢測通量更高等優(yōu)勢，更適合在大規(guī)模分子標(biāo)記輔助選擇中運用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明分子標(biāo)記的引物設(shè)計示意圖。包括兩條正向引物gw2-f1和gw2-f2，一條公共反向引物gw2-r。其中，gw2-f1和gw2-f2的引物結(jié)合位置相同，但3’末端堿基分別為ct和ac，只能分別與突變型(gw2，寬粒)和野生型(gw2，窄粒)品種進行堿基完全匹配；gw2-f2的5’端增加了特異序列agccta用以引入擴增片段長度多態(tài)性，gw2-f1的3’端第5個堿基引入了a→c的突變，gw2-f2的3’端第13個堿基引入了c→g的突變用以擴大gw2-f1和gw2-f2對目標(biāo)序列識別能力的差異。單堿基缺失位點用紅色方框標(biāo)出，引入的堿基突變用下劃線標(biāo)出。

圖2是用本發(fā)明分子標(biāo)記檢測10個水稻品種/品系的page膠電泳圖。泳道1-10分別為n411、五豐b、華占、r51084、青豐1號b、南h197、元豐9918s、9311、岳4b、h28b。pcr產(chǎn)物大小標(biāo)記在膠圖右側(cè)。

圖3是用本發(fā)明分子標(biāo)記檢測n411/五豐b的f2代單株的page膠電泳圖。泳道1-16為不同的f2單株，17為n411，18為五豐b。pcr產(chǎn)物大小標(biāo)記在膠圖右側(cè)。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；若未特別指明，實施例中所用試劑均為市售。

實施例1水稻gw2基因分子標(biāo)記的引物設(shè)計及擴增片段分析

1、引物設(shè)計

通過對水稻粒寬基因gw2在寬粒和窄粒品種中等位基因的序列比對，分析得到了寬粒和窄粒品種在gw2編碼區(qū)第四外顯子上的一個功能性單堿基缺失。根據(jù)該堿基位點上下游的序列設(shè)計引物組合：

gw2-f1:cacaatgtccattctgccaact(seqidno.1)，

gw2-f2:agcctacacaatgtcgattctgcaaaac(seqidno.2)，

和gw2-r:tgttctatgctcctttcctcctttg(seqidno.3)(引物設(shè)計示意圖見圖1)。

2、擴增片段分析

用上述引物組合對水稻粒寬基因gw2進行擴增，窄粒粒材料將只能擴出一條88bp條帶，寬粒材料將只能擴出一條81bp條帶。81bp和88bp條帶的核苷酸序列分別如seqidno.4和seqidno.5所示。

實施例2用本發(fā)明分子標(biāo)記鑒定水稻品種/品系的gw2基因型

1、水稻粒寬測量方法：每個品種/品系隨機挑選3株，每株挑選10粒飽滿籽粒背腹相連測量平均粒寬代表各株的粒寬，3株粒寬的平均值代表該品種/品系粒寬。

2、水稻粒重測量方法：每個品種/品系隨機挑選3株，每株挑選100粒飽滿籽粒測量百粒重，3株百粒重的平均值代表該品種/品系粒重。

3、水稻基因組dna的提取

用n411、五豐b、華占、中香黃占、r51084、青豐1號b、南h197、福豐恢1658、元豐9918s、9311、岳4b、h28b等12個水稻品種/品系為材料，采用ctab法提取水稻基因組dna，具體步驟如下：取3cm長的水稻葉片，在800μl抽提緩沖液[1.5％(w/v)ctab，1.05mol/lnacl，75mmol/ltris-hcl(ph8.0)，15mmol/ledta(ph8.0)]中磨碎，收集到一個1.5ml離心管中。65℃水浴30min，間或顛倒混勻。加入800μl氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)，顛倒混勻15min。12000r/min室溫離心10min。吸上清450μl，轉(zhuǎn)移到一個新的1.5ml離心管中，加入2倍體積95％乙醇，混勻后-20℃沉淀30min。12000r/min離心15min。倒掉95％乙醇，用75％乙醇洗沉淀。倒掉75％乙醇，干燥后加100μl滅菌ddh2o溶解dna。

3、pcr擴增

利用實施例1篩選得到的特異性引物組合(gw2-f1，gw2-f2，gw2-r)對本實施例所述12個水稻品種/品系的dna進行pcr擴增，pcr的反應(yīng)體系為：biomiga的2×benchtop^tmtaqmastermix5μl，10μm的兩個正向、一個反向引物各0.5μl，10％dmso0.5μl，模板dna約50-100ng，補滅菌ddh2o至10μl；

pcr反應(yīng)條件為：94℃，4min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，20s，共35個循環(huán)；72℃，5min，16℃，1min。

4、pcr產(chǎn)物檢測

擴增產(chǎn)物經(jīng)6％page膠電泳檢測，電泳條件為：u＝2000v，i＝200ma，p＝85w，電泳50min。電泳完成后用0.1％agno3染色，觀片燈上觀察拍照。

5、結(jié)果與分析

粒寬(以10粒稻谷總粒寬表示)測量表明，水稻品種/品系n411的粒寬為4.77±0.05cm，百粒重為6.950±0.10g，其它品種的粒寬為2.43±0.05到3.03±0.05cm，百粒重為1.826±0.04g到3.134±0.07g，n411的粒寬和粒重均明顯大于其它品種的粒寬和粒重(表1)。用本發(fā)明實施例1的分子標(biāo)記的引物組合擴增這些品種/品系，發(fā)現(xiàn)只有n411擴增出了一條81bp的帶，為純合突變基因型，而所有其它品種/品系都只擴增出了一條88bp的帶，為純合野生基因型(見圖2和表1)。這些結(jié)果表明突變型gw2在現(xiàn)有水稻栽培品種中分布稀少，只存在于少數(shù)特異的寬粒種質(zhì)資源中。此外，和野生型gw2相比，突變型gw2確實有使谷粒變寬的效應(yīng)。最后，野生型和突變型gw2與粒寬的對應(yīng)關(guān)系驗證了本發(fā)明分子標(biāo)記在鑒定gw2基因型時的準(zhǔn)確性和可靠性。

表1水稻品種/品系的基因型、粒寬和百粒重

實施例3本發(fā)明分子標(biāo)記的應(yīng)用

1、水稻材料水稻品種n411與五豐b的f2代16個單株。

2、水稻基因組dna的提取在苗期提取葉片基因組dna，具體方法同實施例2。

3、pcr擴增和產(chǎn)物判斷標(biāo)準(zhǔn)參見實施例2。

4、水稻粒寬和粒重測量方法參見實施例2。

5、結(jié)果與分析用本發(fā)明實施例1的分子標(biāo)記(特異性引物組合gw2-f1，gw2-f2，gw2-r通過pcr擴增得到)在苗期檢測n411與五豐b的16個f2單株中g(shù)w2的基因型，發(fā)現(xiàn)有8個單株只擴增出了88bp條帶，有2個單株只擴增出了81bp條帶，有6個單株同時擴增出了88bp和81bp條帶(見圖3)。對雜合f1自交收種單株的粒寬和粒重進行鑒定，發(fā)現(xiàn)平均粒寬為3.77±0.05cm，百粒重為4.495±0.03g，粒寬小于n411但大于五豐b，粒重小于n411但大于五豐b(見表1)。說明本發(fā)明分子標(biāo)記能在n411的雜交后代中有效區(qū)分不同基因型，在大規(guī)模育種實踐中能較為準(zhǔn)確的對水稻粒寬基因gw2進行輔助選擇。

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<110>海南波蓮水稻基因科技有限公司

<120>一種水稻粒寬基因gw2的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

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