結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包 括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼 子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和 起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄 起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用重組 表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基 因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因， 直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0032] 在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述蛋白質(zhì)的編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為 35S啟動(dòng)子。
[0033] 更為具體的，所述重組表達(dá)載體為將所述ZTL基因插入pRTL2載體的多克隆位點(diǎn) KpnI與BamH I之間后得到的重組質(zhì)粒。
[0034] 在上述方法中，將攜帶有所述ZTL基因的所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體植物， 具體可為：通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿 菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
[0035] 在上述應(yīng)用或方法中，所述植物即可為雙子葉植物（如十字花科植物），也可為單 子葉植物。
[0036] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述植物為雙子葉植物，具體為十字花科植物擬南芥， 更加具體為擬南芥野生型（C24生態(tài)型）。
[0037] 在本發(fā)明中，以上所有所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)均 可替換為序列3所不蛋白質(zhì)與標(biāo)簽蛋白所形成的融合蛋白，具體如在pRTL2載體的多克隆 位點(diǎn)Kpn I與BamH I之間插入序列2的第174-2000位所示DNA片段后所得重組質(zhì)粒表達(dá) 得到的融合蛋白。
[0038] 實(shí)驗(yàn)證明，ZTL基因突變株，相比野生型對(duì)照植株，對(duì)干旱逆境脅迫的耐受性顯著 提高，而ZTL轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)干旱逆境脅迫的耐受性在顯著降低。本發(fā)明對(duì)植物抗干旱分 子機(jī)制的研宄具有重要意義，在提高作物對(duì)自然氣候?yàn)?zāi)害和不良土壤環(huán)境的抗逆性和耐受 性，及作物抗干旱品種的選育等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1為ZTL基因突變體ztl-1的示意圖。ztl-1點(diǎn)突變體突變位點(diǎn)位于ZTL基 因第二個(gè)外顯子區(qū)域，即序列1中從起始密碼子（ATG)開(kāi)始第2103個(gè)堿基G突變?yōu)锳， 導(dǎo)致序列3中第425個(gè)氨基酸天冬氨酸（D)置換為天冬酰胺（N)，從而使ZTL蛋白功能 發(fā)生變化（Somers D E, Schultz T F，Milnamow M，et al.ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis. Cell, 2000 (101), 319-329)〇
[0040] 圖2為western blot檢測(cè)ZTL過(guò)表達(dá)材料中ZTL蛋白的表達(dá)情況。
[0041] 圖3為ZTL各遺傳材料在MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)10天的情況。
[0042] 圖4為ZTL各遺傳材料在ABA促進(jìn)氣孔關(guān)閉實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)情況。*表示與C24組 相比，差異極顯著（P〈〇. 05);林表示與C24組相比，差異極顯著（P〈0. 01)。
[0043]圖5為ZTL各遺傳材料在植株離體失水實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)情況。
[0044] 圖6為ZTL各遺傳材料在干旱實(shí)驗(yàn)中的反應(yīng)情況。
[0045] 圖7為ZTL各遺傳材料在復(fù)水后的存活率情況。**表示與C24組相比，差異極顯 著（P〈0. 01) 〇
【具體實(shí)施方式】
[0046] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0047] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0048] 下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中的定量試 驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0049] pRTL2 載體：由 Andrew J. Leinicke 教授贈(zèng)送（記載文獻(xiàn)：Carrington J C, Freed D D,Leinicke A J. Bipartite Signal Sequence Mediates Nuclear Translocation of the Plant Potyviral Nla Protein. The Plant Cell, 1991 (3)，953-962.)在 pRTL2 載體 中，位于多克隆位點(diǎn)（MCS)上游的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子。在pRTL2載體中，含有YFP基因 (Clontech，http://www. clontech. com/)〇
[0050] 擬南芥野生型（C24生態(tài)型）：擬南芥野生型種子，為擬南芥生物研究中心（ABRC) 產(chǎn)品。
[0051] ZTL突變體ztl-1種子：由Steve A. Kay教授贈(zèng)送，背景為C24(記載文獻(xiàn)：Somers DE, Schultz T F, Milnamow M, et al. ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis. Cell, 2000(101),319-329)〇
[0052] 根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens):根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101，由清華 大學(xué)提供（記載文獻(xiàn)：R. Berres, L. otten, B. Tinland et al. Transformation of vitis tissue by different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene.Plant Cell Reports,1992(11):192-195. )〇
[0053] 大腸桿菌（Escherichia coli)菌株DH5 a (DE3)感受態(tài)：為全式金生物有限公司 產(chǎn)品。
[0054] GFP蛋白鼠源單克隆抗體：由北京亞太恒信生物公司提供，貨號(hào)ZA009,由 于YFP蛋白是GFP蛋白的衍生變種蛋白，蛋白質(zhì)序列上只有幾個(gè)氨基酸的區(qū)別，所 以GFP抗體可以同時(shí)識(shí)別GFP和YFP(記載文獻(xiàn)：Wu XY，Shi YP，Li JR，et al.A role for the RNA-binding protein M0S2in microRNA maturation in Arabidopsis.Cell Research, 2013(23)，645-657)〇
[0055] 實(shí)施例1、ZTL轉(zhuǎn)基因植物的獲得及鑒定
[0056]本實(shí)施例中所涉及的ZTL基因來(lái)源于擬南芥（Arabidopsis thaliana)，其在擬南 芥基因組中的序列如序列表中序列1所示，序列1由3164個(gè)核苷酸組成，其中第416-1245 位為內(nèi)含子序列；所述ZTL基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由2334個(gè)核苷 酸組成，其中第171-2000位為編碼序列（0RF);序列1和序列2均編碼序列表中序列3所 示的蛋白質(zhì)，序列3由609個(gè)氨基酸殘基組成。
[0057] 一、重組表達(dá)載體pRTL2-ZTL的構(gòu)建
[0058] 提取擬南芥野生型（C24生態(tài)型）的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。以所得cDNA為 模板，通過(guò)引物1與引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化，表明擴(kuò)增得到約 1800bp片段，測(cè)序表明，該片段具有自序列表中的序列2自5'端起第174-2000位核苷酸序 列（ZTL基因的編碼序列，0RF)。
[0059]引物 1 :5' -CGGGGTACCGGGAGTGGGACAGTGGTTC-3' (下劃線部分為 Kpn I 的識(shí)別位 點(diǎn)，該序列的第12-28位為序列2的第174-190位）；
[0060]引物2 :5'-CGCGGATCCCTTACGTGAGATAGCTCGC-3'(下劃線部分為BamH I的識(shí)別位 點(diǎn)，該序列的第11-28位為序列2的第1983-2000位的反向互補(bǔ)序列）。
[0061] 用限制性內(nèi)切酶Kpn I和BamH I雙酶切以上所得PCR產(chǎn)物，膠回收酶切片段，與 經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的PRTL2載體骨架相連，得到重組質(zhì)粒。將所述重組質(zhì)粒送樣測(cè)序，將經(jīng)測(cè) 序表明在PRTL2載體的酶切位點(diǎn)Kpn I和BamH I之間插入"GG+序列2的第174-2000位 +G"所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pRTL2-ZTL。在重組表達(dá)載體pRTL2-ZTL中，啟動(dòng)所述 ZTL基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子。
[0062] 在重組表達(dá)載體PRTL2-ZTL