一種dna四面體納米結(jié)構(gòu)信號(hào)探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種DNA四面體納米結(jié)構(gòu)信號(hào)探針及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA電化學(xué)生物傳感器以其快速、靈敏、低成本及易微型化等優(yōu)點(diǎn)在臨床醫(yī)藥、食 品檢驗(yàn)、環(huán)境檢測(cè)以及反恐等各個(gè)領(lǐng)域有著巨大的潛在用途。決定DNA電化學(xué)生物傳感器 性能的一個(gè)重要方面就是信號(hào)放大體系。
[0003] 由于DNA作為生物標(biāo)志物在疾病診斷中具有非常重要的地位。因此用于檢測(cè)臨床 樣本中低濃度的DNA的生物標(biāo)志物的超靈敏DNA傳感器至關(guān)重要。其中，電化學(xué)DNA傳感 器是有前途的一個(gè)，因?yàn)槠漤憫?yīng)速度快，使用方便，成本低，可以直接進(jìn)行DNA檢測(cè)。電化學(xué) DNA傳感器于2003年被首次發(fā)明，其中"三明治"式的電化學(xué)DNA傳感器得到了廣泛的應(yīng) 用。一個(gè)典型的"三明治"式的電化學(xué)DNA傳感器由固定到電極上的單鏈DNA捕獲探針識(shí) 別層的和一個(gè)單鏈DNA信號(hào)探針將目標(biāo)DNA固定在電極表面，并通過(guò)各種方式轉(zhuǎn)化為電化 學(xué)信號(hào)。捕獲探針和信號(hào)探頭與目標(biāo)DNA形成夾心結(jié)構(gòu)，看起來(lái)像一個(gè)"三明治"。
[0004] 要想使得"三明治"式的電化學(xué)DNA傳感器提高靈敏度，兩個(gè)關(guān)鍵部分是"識(shí)別層" 與"信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)"。"識(shí)別層"最常用于電化學(xué)DNA傳感器的捕獲探針是巰基修飾的單鏈DNA， 通過(guò)金-硫鍵實(shí)現(xiàn)捕獲探針在電極上的固定。但這種方法存在一定的缺陷，因?yàn)閱捂淒NA 是一種柔性的分子，并且探針DNA的堿基與金之間有吸附位點(diǎn)，單鏈DNA容易平躺在金表面 上?？茖W(xué)家們嘗試了多種方法來(lái)改善這種情況。例如，添加一些小分子稀釋劑，這樣小分子 可以取代探針堿基與金之間的相互作用，使探針DNA-定程度直立在電極表面。最近，DNA 四面體納米結(jié)構(gòu)捕獲探針吸引了極大的興趣。三維的DNA四面體納米結(jié)構(gòu)最早在2004年 開發(fā)，然后首次在2010年用于電化學(xué)DNA傳感器。根據(jù)報(bào)道，DNA四面體可以固定在金電極 表面，通過(guò)修改其三個(gè)頂點(diǎn)與硫醇基團(tuán)，而第四頂點(diǎn)可以被設(shè)計(jì)成具有為互補(bǔ)的靶DNA或 miRNA的一部分的延伸的DNA捕獲探針。由于其剛性結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)，該DNA四面體納米結(jié)構(gòu) 可保證該DNA捕獲探針具有良好控制的密度和取向。"信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)"是提高電化學(xué)檢測(cè)性能又 一個(gè)非常重要的因素。大量的信號(hào)分子如氧化還原酶，納米顆粒標(biāo)記已經(jīng)被用來(lái)放大信號(hào)。 辣根過(guò)氧化物酶（HRP)具有穩(wěn)定，高效，可商購(gòu)的，容易與DNA探針上的生物素共價(jià)結(jié)合等 優(yōu)點(diǎn)。因此被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0005]通常，用于結(jié)合HRP的信號(hào)探針是生物素修飾的單鏈DNA。然而，由于一條單鏈DNA信號(hào)探針通常只能結(jié)合一個(gè)HRP酶，從而導(dǎo)致酶反應(yīng)的效率不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的第一方面提供一種DNA四面體納米結(jié)構(gòu) 信號(hào)探針，所述信號(hào)探針為由一條5'端延伸出來(lái)一段DNA識(shí)別序列的單鏈DNA和三條5'端 修飾了標(biāo)記分子的單鏈DNA自組裝形成的一個(gè)具有四面體底座的DNA信號(hào)探針，所述四面 體的一個(gè)頂點(diǎn)上延伸所述DNA識(shí)別序列，所述的DNA識(shí)別序列與待測(cè)目標(biāo)DNA或miRNA互 補(bǔ)結(jié)合，其他三個(gè)頂點(diǎn)含有標(biāo)記分子。
[0007] 優(yōu)選的，所述標(biāo)記分子為生物素分子。所述標(biāo)記分子能特異性地與帶修飾的信號(hào) 分子結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多信號(hào)放大。所述帶修飾的信號(hào)分子為帶修飾的氧化還原酶；更優(yōu)選的，所 述帶修飾的氧化還原酶為親和素修飾的氧化還原酶，通過(guò)生物素和親和素的結(jié)合作用連接 和氧化還原酶分子，進(jìn)而通過(guò)DNA堿基互補(bǔ)產(chǎn)生信號(hào)。
[0008] 優(yōu)選的，所述氧化還原酶選自辣根過(guò)氧化酶或葡萄糖氧化酶；更優(yōu)選辣根過(guò)氧化 酶。
[0009] 優(yōu)選的，所述四面體的邊長(zhǎng)可以通過(guò)調(diào)整DNA堿基配對(duì)數(shù)來(lái)改變其長(zhǎng)度。更優(yōu)選 的，所述四面體的邊長(zhǎng)是由17對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成。
[0010] 優(yōu)選的，構(gòu)成所述DNA四面體納米結(jié)構(gòu)信號(hào)探針的四條單鏈DNA的序列，如SEQID NO. 1~4所示：
[0011] Tetra-a-reporter：
[0012] 5'-AAAAAAAAAAACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAG TA-3'。（SEQ ID NO. 1)
[0013] 優(yōu)選的，Tetra-a-reporter的5'端延伸一段DNA識(shí)別序列。
[0014] Tetra-b：
[0015] 5'-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3'。（SEQ ID NO. 2)
[0016] Tetra-c：
[0017] 5'-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3'。（SEQ ID NO. 3)
[0018] Tetra-d：
[0019] 5'-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3'。（SEQ ID NO. 4)
[0020] 優(yōu)選的，自組裝形成DNA四面體納米結(jié)構(gòu)信號(hào)探針的形成條件為95°C3min，而后 立即降溫到4攝氏度。
[0021] 本發(fā)明第二方面公開了一種電化學(xué)檢測(cè)方法，具體包括如下步驟：
[0022] (1)先將待測(cè)目標(biāo)DNA或miRNA和四面體DNA納米結(jié)構(gòu)信號(hào)探針混合預(yù)雜交得混 合液，再將組裝好的含四面體捕獲探針的工作電極插入到所述混合液中再雜交；
[0023] (2)加入氧化還原酶和相應(yīng)的底物，進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。
[0024] 優(yōu)選的，步驟（1)中，所述DNA四面體納米結(jié)構(gòu)信號(hào)探針，所述信號(hào)探針為由一條 5'端延伸出來(lái)一段DNA識(shí)別序列的單鏈DNA和三條5'端修飾了標(biāo)記分子的單鏈DNA自組 裝形成的一個(gè)具有四面體底座的DNA信號(hào)探針，所述四面體的一個(gè)頂點(diǎn)上延伸所述DNA識(shí) 別序列，所述的DNA識(shí)別序列與待測(cè)目標(biāo)DNA或miRNA互補(bǔ)結(jié)合，其他三個(gè)頂點(diǎn)含有標(biāo)記分 子。
[0025] 優(yōu)選的，所述標(biāo)記分子為生物素分子。
[0026] 優(yōu)選的，所述四面體的邊長(zhǎng)可以通過(guò)調(diào)整DNA堿基配對(duì)數(shù)來(lái)改變其長(zhǎng)度。更優(yōu)選 的，所述四面體的邊長(zhǎng)是由17對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成。
[0027] 優(yōu)選的，構(gòu)成所述DNA四面體納米結(jié)構(gòu)信號(hào)探針的四條單鏈DNA的序列，如SEQID NO. 1~4所示：
[0028] 5'-AAAAAAAAAAACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAG TA-3'。（SEQ ID NO. 1)
[0029] 優(yōu)選的，Tetra-a-reporter的5'端延伸一段DNA識(shí)別序列。
[0030] Tetra-b：
[0031] 5' -TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCMTAC -3'〇(SEQ ID NO. 2)〇
[0032] Tetra-c：
[0033] 5'-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3'。（SEQ ID NO. 3)〇
[0034] Tetra-d：
[0035] 5'-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3' （SEQ ID NO.4)〇
[0036] 優(yōu)選的，自組裝形成DNA四面體納米結(jié)構(gòu)信號(hào)探針的形成條件為95°C3min，而后 立即降溫到4攝氏度。
[0037] 優(yōu)選的，步驟（2)中，DNA四面體捕獲探針，為將三條5'修飾了巰基的單鏈DNA和 一條在3'延伸出來(lái)一段DNA識(shí)別序列的單鏈DNA自組裝形成具有四面體底座的DNA探針， 所述四面體的其中三個(gè)頂點(diǎn)含有巰基基團(tuán)，用于固定在電極表面，在剩下的一個(gè)頂點(diǎn)上延 伸所述DNA識(shí)別序列，所述的DNA識(shí)別序列與目標(biāo)DNA或miRNA的序列互補(bǔ)，通過(guò)所述信號(hào) 探針末端的標(biāo)記分子與帶修飾的信號(hào)分子結(jié)合產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。
[0038] 優(yōu)選的，步驟（2)中，所述捕獲探針可以保證頂端的DNA識(shí)別序列不易和電極表面 相互作用，而且作為底座的四面體納米結(jié)構(gòu)，由于自身的特殊結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可