miRNA410-在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因治療和醫(yī)學診斷領域，具體涉及一種miRNA410-在制備前列腺癌 診斷試劑盒中的應用。
【背景技術】
[0002] 前列腺癌是發(fā)生于男性前列腺組織中的惡性腫瘤，是前列腺腺泡細胞異常無序生 長的結果。在歐美等發(fā)達國家和地區(qū)，它是男性最常見的惡性腫瘤，其死亡率居各種癌癥的 第二位；在亞洲，其發(fā)病率低于西方國家，但近年來呈迅速上升趨勢。上海2007年前列腺癌 在泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)病率已經從第3位躍居首位，并在男性十大腫瘤排名中由原 來的第9位迅速上升至第5位。據預測，10年后，上海市前列腺癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中 的排行將晉升至前三位。
[0003]與其它癌癥一樣，前列腺癌的早期診斷對前列腺癌病人治療效果及生存質量有極 為重大的意義。有研究指出，通過血清指標檢測出來的極早期前列腺癌，其治療效果較好， 生存率有明顯提升，生存質量影響較小。但是對于晚期前列腺癌患者（格里森評分>7)，其 治療后不僅生存率沒有提高，而且生活質量影響較大。所以，前列腺癌的治療成功與否，與 早期診斷是否成功有較大聯(lián)系。
[0004]目前公認的前列腺癌篩查最簡便的方法是：前列腺直腸指檢（DRE)、血清PSA檢 測、前列腺超聲波檢查。
[0005] 前列腺直腸指檢是前列腺癌診斷的經典技術，通過該檢查可以判斷前列腺結節(jié)的 大小和形狀，從而判斷是否患有前列腺癌，但由于前列腺直腸指檢發(fā)現(xiàn)的腫瘤一般較嚴重， 對臨床治療幫助有限，所以歐美國家該技術不常使用。
[0006] 其它診斷方法還有前列腺超聲波檢查等，但該方法容易與前列腺炎和前列腺肥大 混同，所以已不再用于前列腺癌分期診斷
[0007]目前發(fā)明人所在的中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院使用的是血清PSA 和穿刺相結合的方法。但是，PSA作為臨床前列腺癌的診斷也存在諸多弊端，因為包括前列 腺增生在內的多重泌尿系統(tǒng)疾病，都有可能導致PSA升高，而這也就有可能導致疾病的誤 檢、誤診或者病情的延誤。而穿刺活檢的檢出率與活體穿刺的次數(shù)、位置都有較大關系，不 是非常穩(wěn)定的診斷方案。
[0008] 所以，如果能有一種檢測試劑盒，可以提高前列腺癌的檢出率和準確率，對于前列 腺癌的臨床治療有著重大的意義。
[0009] 微RNA(microRNAs;miRNA，又譯小分子RNA)是真核生物中廣泛存在的一種長約21 到23個核苷酸的RNA分子，可調節(jié)其他基因的表達。miRNA來自一些從DNA轉錄而來，但無 法進一步轉譯成蛋白質的RNA(屬于非編碼RNA)。miRNA通過與靶信使核糖核酸（mRNA)特 異結合，從而抑制轉錄后基因表達，在調控基因表達、細胞周期、生物體發(fā)育時序等方面起 重要作用。在動物中，一個微RNA通?？梢哉{控數(shù)十個基因.
[0010]目前，在各種癌癥的研究中，包括前列腺癌，miRNA仍舊是最為重要的研究熱點之 一。至今，已經有大量的證據證明，miRNA與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。而且，有 文獻指出，在癌癥病人人群血液中會出現(xiàn)與正常人群迥然不同的miRNA表達譜。換句話說， 如果我們能夠在病人身上發(fā)現(xiàn)這種被證實的miRNA表達譜，毫無疑問會大大提高我們做出 臨床診斷的把握。
[0011] 而且，就技術而言，miRNA的檢測本質上是一種血清RNA的QPCR檢測，具有操作簡 便、檢測靈敏、特異性好、重復性高等特點，現(xiàn)今已越來越多地被應用于臨床檢驗技術中。
[0012]miRNA-410-(miRBase編號：MIMAT0001091)，其序列如下所示： AGGUUGUCUGUGAUGAGUUCG，該miRNA目前僅在小鼠和人體內被證實存在，且在新生小鼠中被 證實存在表達差異。目前尚無對于人類的miRNA410-的功能研究的文獻報道。

【發(fā)明內容】

[0013] 本發(fā)明的目的在于提供前列腺癌診斷標志物，也在于提供miRNA410-的新用途， 即在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用。
[0014] 本發(fā)明提供了miRNA410-作為前列腺癌診斷標志物的應用。
[0015] 本發(fā)明提供了miRNA410-在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用。
[0016] 本發(fā)明人在前期動物實驗中已證實，miR410-的高表達具有前列腺癌特異性。在 普通實驗動物，正常人及其非癌癥細胞株中，幾乎無法檢測到miR410-的存在。但前列腺癌 動物模型、細胞株、前列腺癌患者體內，可以檢測到極高含量的miR410-。
[0017]本發(fā)明的主要技術方案如下：本發(fā)明是基于miRNA定量PCR檢測的前列腺癌診斷 試劑盒，可以通過定量PCR技術準確計算血清中miR410-的含量。
[0018] 本發(fā)明所述的miRNA410-在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用，miRNA410-的序 列如下所示：
[0019] AGGUUGUCUGUGAUGAGUUCG(SEQIDN0:l)〇
[0020] 所述的應用，具體是指采用該試劑盒檢測生物樣品中miRNA410-的表達量。
[0021] 所述的試劑盒，包括：對miRNA410-具有檢測特異性的探針、基因芯片，或PCR引物 等。
[0022] 所述的生物樣品選自：獲自對象的新鮮組織或細胞、福爾馬林固定或石蠟包埋組 織或細胞、血液或體液。
[0023] 所述的生物樣品優(yōu)選為人外周血。
[0024] 所述的對miRNA410_具有檢測特異性的PCR引物如下：
[0025] ATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACTTTTTTTTTTTTTTTA
[0026] RT-miRNA-a(SEQIDNO:2)
[0027] ATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACTTTTTTTTTTTTTTTC
[0028] RT-miRNA-c(SEQIDNO:3)
[0029] ATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACTTTTTTTTTTTTTTTG
[0030] RT-miRNA-g(SEQIDNO:4)
[0031] 本發(fā)明具體包括以下內容：
[0032] 1.利用酚-氯仿法抽提血清RNA的試劑，
[0033] 2.利用引物對miRNA進行反轉錄的試劑，
[0034] 3.利用退火粘連法制備的pMD18T-miR410-標準品，
[0035] 4.將反轉錄產物與標準品進行定量PCR的試劑，利用儀器自帶軟件產生的標準曲 線換算出血清miR410_含量的配套計算軟件。
[0036] 本發(fā)明進一步地提供了一種利用針對miR-410-的定量PCR檢測來進行前列腺癌 診斷的試劑盒，包括：（1)用酚-氯仿法抽提血清總RNA后，利用特殊引物對miRNA進行發(fā) 轉錄，使其在反轉錄的同時連接特殊的引物接頭。
[0037] (2)用miR-410-的特異引物對cDNA進行定量PCR檢測，并使用特殊的標準曲線分 析，計算出的血清miR-410-含量。
[0038] 利用本發(fā)明的試劑盒，進行檢測的方法如下：
[0039] 步驟1所述反轉錄引物序列為
[0040]
【主權項】
1. 一種miRNA410-在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用。
2. 根據權利要求1所述的一種miRNA410-在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用，其特 征在于，該試劑盒是通過定量PCR技術檢測生物樣品中miRNA410-的表達量。
3. 根據權利要求2所述的一種miRNA410-在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用，其特 征在于，所述的試劑盒，包括：對miRNA410-具有檢測特異性的探針、基因芯片，或PCR引物。
4. 根據權利要求2或3所述的一種miRNA410-在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用， 其特征在于，所述的生物樣品選自：獲自對象的新鮮組織或細胞、福爾馬林固定或石蠟包埋 組織或細胞、血液或體液。
5. 根據權利要求2或3所述的一種miRNA410-在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用， 其特征在于，所述的生物樣品為人外周血。
6. 根據權利要求2至3任一所述的一種miRNA410-在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應 用，其特征在于，所述的對miRNA410-具有檢測特異性的PCR引物如下： RT-miRNA-a 如 SEQ ID NO:2 所示； RT-miRNA-c 如 SEQ ID NO:3 所示； RT-miRNA-g 如 SEQ ID NO:4 所示。
7. 根據權利要求1所述的一種miRNA410-在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用，其特 征在于，所述的試劑盒包括： a) 利用酚-氯仿法抽提血清RNA的試劑； b) 利用引物對miRNA進行反轉錄的試劑，所述的引物為如SEQ ID NO: 2、3和4所示； c) 利用退火粘連法制備的pMD18T-miR410-標準品； d) 將反轉錄產物與標準品進行定量PCR的試劑； e) 利用儀器自帶軟件產生的標準曲線換算出血清miR410-含量的配套計算軟件。
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因治療和醫(yī)學診斷領域，本發(fā)明提供了miRNA410-在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用，本發(fā)明進一步提供了一種利用針對miR-410-的定量PCR檢測來進行前列腺癌診斷的試劑盒，包括(1)用酚-氯仿法抽提血清總RNA后，利用特殊引物對miRNA進行發(fā)轉錄，使其在反轉錄的同時連接特殊的引物接頭。(2)用miR-410-的特異引物對cDNA進行定量PCR檢測，并使用特殊的標準曲線分析，計算出的血清miR-410-含量。(3)利用血清miR-410-含量診斷前列腺癌。本發(fā)明的試劑盒和檢測技術成熟，周期短，特異性好。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104651492
【申請?zhí)枴緾N201510003826
【發(fā)明人】孫穎浩, 劉善榮, 張丹丹, 汪佳祺, 胡晶晶, 劉淑鵬, 肖瀟, 程凱
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年1月6日