體Clq結 合。GB2542是多聚化斯塔都體，且GB2554和GB2555是不含任何多聚化結構域的線性斯塔 都體。
[0087] 圖31示出了補體Clq對抗體GB2500、多聚化斯塔都體GB2542和非多聚化斯塔都 體GB2554和GB2555的結合的EC50值。
[0088] 發(fā)明詳述
[0089] 用于本文中所描述的具有FcR結合能力的抗原結合復合物的理性分子設計的方 法包括以重組和/或生物化學方式產(chǎn)生免疫活性生物模擬物，令人驚訝的是，所述免疫活 性生物模擬物在誘導細胞毒性（包括抗體介導的細胞毒性、補體依賴性細胞毒性、直接細 胞毒性和其它細胞毒性機制）方面與對相同抗原具有特異性的mAb相比更有效。所述復合 物具有治療例如癌癥、自身免疫疾病和炎性疾病以及傳染病的用途。下文詳細描述各實施 方案連同具體的示例性實施方案。
[0090] 如本文中所使用，在權利要求和/或本說明書中與術語"包含"聯(lián)合使用時，詞"一 個"或"一種"的用途可以意指"一個/種"，但是它還符合以下意思："一個/種或多個/種"、 "至少一個/種"和"一個/種或多于一個/種"。
[0091] 如本文中所使用，術語"生物模擬物"、"生物模擬分子"、"生物模擬化合物"和相關 的術語是指模擬另一種復合物（諸如匯集的人靜脈用免疫球蛋白（"hIVIG")、單克隆抗體 或抗體的Fc或Fab片段）的功能的人造復合物。"生物活性"生物模擬物是擁有與其天然 存在的對應物相同或相似的生物學活性的復合物。"天然存在的"意指在生物中正常找到的 分子或其部分。天然存在還意指基本上天然存在。"免疫活性"生物模擬物是展現(xiàn)與天然存 在的免疫活性分子相同或相似的免疫活性的生物模擬物，諸如抗體、細胞因子、白介素和本 領域中已知的其它免疫分子。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的生物模擬物是如本文中所限定 的斯塔都體。
[0092] "同源的"意指在給定的核酸或氨基酸序列的整個序列范圍內的同一性。例如， "80%同源"意指給定的序列與要求保護的序列共有約80%同一性并且可以包括插入、缺 失、置換和移碼。本領域普通技術人員將理解，可以進行序列比對以便考慮插入和缺失，以 確定整個序列長度范圍內的同一性。
[0093] 本發(fā)明的免疫活性生物模擬物能夠結合一個或多個抗原。在一些實施方案中，本 發(fā)明的免疫活性生物模擬物能夠結合兩種不同的抗原，這類似于雙特異性抗體。在其它 實施方案中，本發(fā)明的免疫活性生物模擬物能夠結合多于兩種不同的抗原。本發(fā)明的生 物模擬物還擁有IgG Fc結構域的一種或多種免疫調節(jié)活性并且至少具有能夠結合FcRn、 DC-SIGN、SIGN-Rl 和 / 或 Fe γ R(包括 Fe γ RI、Fe γ RII、Fe γ RIII 和 Fe γ RIV)的第一 Fe 結構域。在一些實施方案中，本發(fā)明的生物模擬物擁有能夠結合FcRn、DC-SIGN、SIGN-Rl和 /或？〇丫1?(包括？〇丫1?1、？〇丫1?11、？〇丫1?111和？〇丫1?1￥)的第二？(3結構域。因此，在多聚 化時，免疫活性生物模擬物含有至少兩個二聚體結構，各二聚體結構能夠結合一個或多個 抗原，并且能夠結合FeRn、DC-SIGN、SIGN-Rl和/或和Fe γ R中的一個或多個。
[0094] 以下段落在結構和功能方面限定本發(fā)明生物模擬物的結構單元且隨后限定生物 模擬物本身。然而，首先有幫助的是提到，如上文所指示，本發(fā)明的各生物模擬物具有至少 兩個Fe結構域和至少一個Fab結構域。至少，F(xiàn)e結構域是二聚體多肽（或較大多肽的二 聚體區(qū)域），其包含締合以形成功能性Fcy受體結合位點的兩條肽鏈或臂（單體）。因此， 本文中討論的各個Fe片段和Fe結構域的功能形式通常以二聚體（或多聚體）形式存在。 本文中討論的各個片段和結構域的單體是必須與第二鏈或臂締合以形成功能性二聚體結 構的單鏈或臂。
[0095] Fe 區(qū)和 Fab 區(qū)
[0096] "Fc片段"是用來描述在免疫球蛋白羧基末端常規(guī)存在的蛋白質區(qū)域或蛋白質折 疊結構的技術術語。Fe片段由抗體重鏈的羧基末端部分組成。Fe片段中的每條鏈具有約 220-265個氨基酸長度并且這些鏈經(jīng)常通過二硫鍵連接。Fe片段經(jīng)常含有一個或多個獨立 的結構折疊或功能性亞結構域。具體地說，F(xiàn)e片段涵蓋Fe結構域，在本文中定義為可結合 Fey受體的最小結構。分離的Fe片段由發(fā)生二聚化的兩個Fe片段單體（例如，抗體重鏈 的兩個羧基末端部分；本文中進一步限定）構成。當兩個Fe片段單體締合時，所得Fe片段 具有Fcy受體結合活性。
[0097] "Fab片段"是用于描述含有抗體的抗原結合結構域的蛋白質區(qū)域或蛋白質折疊結 構的技術術語。Fab片段由重鏈與輕鏈構成，且長度在約200-250個氨基酸之間。在一些 實施方案中，F(xiàn)ab片段由親本抗體的可變區(qū)和CHl區(qū)構成。Fab片段可以通過使用酶消化 (例如木瓜蛋白酶消化）從單克隆抗體的Fe片段中分離，這種方法是一種不完整和不完善 的方法（參見 Mihaesco C 和 Seligmann M. Papain Digestion Fragments Of Human IgM Globulins. Journal of Experimental Medicine,第 127 卷，431-453 (1968))。Fab 片段和 Fe片段一起構成全抗體，這里意指完整抗體。
[0098] "Fc局部片段"是包含小于抗體的整個Fe片段，卻仍保留與Fe片段具有相同 活性（包括Fcy受體結合活性）的足夠結構的結構域。因此，取決于源自其中的Fe 局部結構域的抗體的同種型，F(xiàn)e局部片段可以缺少部分或全部的鉸鏈區(qū)、部分或全部 的CH2結構域、部分或全部的CH3結構域和/或部分或全部的CH4結構域。Fe局部片 段的實例包括了包含IgG3的上鉸鏈區(qū)、核心鉸鏈區(qū)和下鉸鏈區(qū)外加 CH2結構域的分 子(Tan, LK, Shopes, RJ, 0i, VT 和 Morrison, SL, Influence of the hinge region on complement activation, CIq binding, and segmental flexibility in chimeric human ;[1111]11111〇區(qū)1〇13111;[118，？1'00似1:140&(13(3；[113六.1990 年1月；87(1):162-166)。因此，在這個 實例中，F(xiàn)e局部片段缺少在IgG3的Fe片段中存在的CH3結構域。Fe局部片段的另一個實 例包括了包含IgGl的CH2和CH3結構域的分子。在這個實例中，F(xiàn)e局部片段缺乏IgGl中 存在的鉸鏈結構域。Fe局部片段由兩個Fe局部片段單體構成。如本文中進一步限定，當兩 個這樣的Fe局部片段單體締合時，所得Fe局部片段具有Fe γ受體結合活性。
[0099] 術語"Fab結構域"描述了可結合抗原的最小區(qū)域（在較大多肽的情況下）或最小 蛋白質折疊結構（在分離的蛋白質的情況下）。Fab結構域是Fab片段中允許所述分子與 抗原結合的最小結合區(qū)。"Fab結構域"與"Fab"在本文中可互換使用。
[0100] 如本文中所使用，"Fc結構域"描述了可結合Fe受體（FcR)或被Fe受體結合的最 小區(qū)域（在較大多肽的情況下）或最小蛋白質折疊結構（在分離的蛋白質的情況下）。在 Fe片段和Fe局部片段中，F(xiàn)e結構域是允許所述分子與Fe受體結合的最小結合區(qū)。盡管Fe 結構域可以限于由Fe受體結合的分離的同源二聚體多肽，但是還將清楚的是，F(xiàn)e結構域可 以是Fe片段的部分或全部以及Fe局部片段的部分或全部。當本發(fā)明中使用術語"Fc結構 域"時，它將由熟練技術人員視為意指多于一個Fe結構域。Fe結構域由兩個Fe結構域單 體構成。如本文中進一步限定，當兩個這樣的Fe結構域單體締合時，所得Fe結構域具有Fe 受體結合活性。因此，F(xiàn)e結構域是可結合Fe受體的二聚體結構。
[0101] 如本文中所使用，"Fc局部結構域"描述了 Fe結構域的一部分。Fe局部結構域包 括不同的免疫球蛋白類別和亞類的各個重鏈恒定區(qū)結構域（例如，CH1、CH2、CH3和CH4結 構域）和鉸鏈區(qū)。因此，本發(fā)明的人Fe局部結構域包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、 IgA2、IgD和IgE的CHl結構域；IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD和IgE的CH2 結構域；IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD 和 IgE 的 CH3 結構域；IgM 和 IgE 的 CH4結構域和IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、IgD和IgE的鉸鏈區(qū)。其它物種中相 應的Fe局部結構域將取決于這個物種中存在的免疫球蛋白和其命名。在一個優(yōu)選實施方 案中，本發(fā)明的Fe局部結構域包括IgGl的CHl、CH2和鉸鏈結構域。在另一個優(yōu)選實施方 案中，本發(fā)明的Fe局部結構域包括IgGl的CHl、CH2及鉸鏈結構域和IgG2的鉸鏈結構域。 本發(fā)明的Fe局部結構域還可包含這些結構域和鉸鏈中的多于一個的組合。然而，本發(fā)明的 各個Fe局部結構域及其組合缺乏結合Fe YR的能力。因此，F(xiàn)e局部結構域及其組合包含 小于Fe的結構域。Fe局部結構域可以連接在一起以形成具有Fcy受體結合活性的肽，因 此形成Fe結構域。在本發(fā)明中，將Fe局部結構域與Fe結構域一起用作結構單元以產(chǎn)生如 本文中所限定的本發(fā)明的生物模擬物。各Fe局部結構域由兩個Fe局部結構域單體構成。 當兩個這樣的Fe局部結構域單體締合時，形成Fe局部結構域。
[0102] 如上文所指示，F(xiàn)e片段、Fe局部片段、Fe結構域和Fe局部結構域各自是二聚體蛋 白質或結構域。因此，這些分子各自由可締合以形成二聚體蛋白質或結構域的兩個單體構 成。盡管上文討論了同源二聚體形式的特征和活性，如下討論單體肽。
[0103] 如本文中所使用，"Fc片段單體"是在與另一個Fe片段單體締合時包含F(xiàn)e片段的 單鏈蛋白質。所述Fe片段單體因此是抗體重鏈之一的羧基末端部分，其補足全抗體的Fe 片段（例如，包括IgG的鉸鏈區(qū)、CH2結構域和CH3結構域的重鏈連續(xù)部分）。在一個實施 方案中，F(xiàn)e片段單體至少包含一條鉸鏈區(qū)鏈（鉸鏈區(qū)單體）、一條CH2結構域鏈（CH2結構 域單體）和一條CH3結構域鏈（CH3結構域單體），它們連續(xù)地連接以形成肽。在另一個實 施方案中，F(xiàn)e片段單體至少包含一條鉸鏈區(qū)鏈、一條CH2結構域鏈、一條CH3結構域鏈和一 條CH4結構域鏈（CH4結構域單體），它們連續(xù)地連接以形成肽。在一個實施方案中，CH2、 CH3和鉸鏈結構域來自于不同的同種型。在具體實施方案中，F(xiàn)e片段單體含有IgG2鉸鏈結 構域和IgGlCH2及CH3結構域。
[0104] 如本文中所使用，"Fc結構域單體"描述了單鏈蛋白質，與另一個Fe結構域單體締 合時，所述單鏈蛋白質包含可以與Fcy受體結合的Fe結構域。兩個Fe結構域單體的締合 產(chǎn)生一個Fe結構域。單獨的Fe結構域單體（僅包含F(xiàn)e結構域的一側）不能結合Fe γ受 體。
[0105] 如本文中所使用，"Fc局部結構域單體"描述了與另一個Fe局部結構域單體締合 時包含F(xiàn)e局部結構域的單鏈蛋白質。兩個Fe局部結構域單體的締合產(chǎn)生一個Fe局部結 構域。
[0106] 斯塔都聚體
[0107] 本發(fā)明的斯塔都體由斯塔都體和Fab結構域構成。在一個實施方案中，本發(fā)明的 斯塔都體由多聚化斯塔都聚體和Fab結構域構成。斯塔都聚體是能夠結合兩個或更多個Fe 受體，優(yōu)選地兩個或更多個Fe γ受體，且更優(yōu)選地顯示相對于Fe結構域得以顯著改善的結 合并且最優(yōu)選地顯示親合力的緩慢解離特征的生物模擬化合物。在一個實施方案中，本發(fā) 明的斯塔都體用來結合諸如NK細胞的效應細胞和諸如不成熟樹突狀細胞和巨噬細胞的單 核細胞源性細胞上的FcRn、DC-SIGN、SIGN-Rl和/或Fcy受體。在另一個實施方案中，本 發(fā)明的斯塔都體用于結合B細胞上的Fe YRIIb受體。在一個實施方案中，F(xiàn)cy受體是低親 和力Fcy受體，諸如Fcy Ilia。先前已在美國專利申請公開號2010/0239633和PCT公開 號TO 2012/016073中描述了物理斯塔都聚體構象，這兩個文獻都通過引用整體并入本文。
[0108] "連續(xù)斯塔都聚體"是由當締合時形成能夠結合兩個或更多個Fe γ受體的兩個或 更多個Fe結構域的兩個線性斯塔都聚體單體構成的二聚多肽。連續(xù)斯塔都聚體優(yōu)選地具 有2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或更多個Fe結 構域以及Fe局部結構域。Fe結構域和/或Fe局部結構域可通過如本文中進一步限定的結 構域連接來連接。
[0109] 如將顯而易見，上文討論的Fe片段、Fe局部片段、Fe結構域和Fe局部結構域用于 多種斯塔都聚體構象的構建中。也如上文討論，正是各個Fe結構域單體和Fe局部結構域 單體進行自締合以形成作為包含本文中所描述的斯塔都體的斯塔都聚體的二聚體結構。此 外，斯塔都聚體與Fab結構域締合以形成本發(fā)明的斯塔都體。
[0110] 如本文中所使用，術語"斯塔都聚體單體"或"斯塔都聚體單元"是指單一的連續(xù) 肽分子，其中與至少第二個斯塔都聚體單體締合時，所述肽分子形成包含至少兩個Fe結構 域的多肽。斯塔都聚體單體可以通過斯塔都聚體單體間連接進行締合以形成斯塔都聚體， 或它們可以通過經(jīng)由共價鍵和非共價鍵進行的自組裝來形成斯塔都聚體。
[0111] 與另一個斯塔都聚體單體締合以形成斯塔都聚體時，斯塔都聚體單體可以具有形 成一個、二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、i 個、十二個、十三個、十四 個或更多個Fe結構域的氨基酸序列。與另一個斯塔都聚體單體締合以形成斯塔都聚體時， 斯塔都聚體單體還可以具有形成一個、二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十 個、十一個、十二個、十三個、十四個或更多個Fe局部結構域的氨基酸序列。
[0112] 將在斯塔都聚體的背景下形成Fe結構域和Fe局部結構域的斯塔都聚體單體的區(qū) 域可以簡單地從斯塔都聚體單體分子的連續(xù)區(qū)域的羧基末端至氨基末端布置。具體Fe結 構域單體和Fe局部結構域單體的布置允許在兩個斯塔都聚體單體締合后形成兩個功能性 Fe結構域。
[0113] Fe結構域可以由其結合FeRn、DC-SIGN、SIGN-Rl和/或Fe γ受體的能力在功能 上限定。本發(fā)明復合物與同族典型FC受體（包括FcγIIIa、FcγRIIb和/或SIGN-Rl)結 合的親和力和/或親合力比人IgGlFc對照高得多。可選地，由于IgGlFc的297位上的點 突變，相對于Fe典型受體，本發(fā)明復合物優(yōu)先結合新生兒受體FeRn。因此，F(xiàn)e結構域的具 體氨基酸序列將基于構成Fe結構域的Fe局部結構域而變化。然而，在本發(fā)明的一個實施 方案中，F(xiàn)e結構域包含免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)和CH2結構域。在進一步優(yōu)選實施方案中， Fe結構域包含免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、CH2結構域和CH3結構域。在另一實施方案中，F(xiàn)e 結構域包含免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、CH2結構域、CH3結構域和CH4結構域。在另一個實 施方案中，F(xiàn)e結構域包含免疫球蛋白分子的鉸鏈區(qū)、CH2結構域和CH4結構域。在進一步 優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)e結構域包含CH2結構域和CH3結構域。在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)e結 構域含有IgGl的鉸鏈、CH2結構域和CH3結構域（SEQ ID NO:2)。在另一個優(yōu)選實施方案 中，F(xiàn)e結構域含有IgGl的CH2結構域和CH3結構域（SEQ ID NO: 19)。
[0114] 結構域連接
[0115] 如上文所指示，"結構域連接"是包含本發(fā)明的斯塔都體的各個斯塔都聚體單體的 Fe結構域單體和/或Fe局部結構域單體的之間的肽連接。結構域連接可以是1個、2個、 3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18 個、19個、20個或更多個氨基酸。在呈其天然序列形式的Fe局部結構域單體之間不存在結 構域連接。即，在使用Fe結構域單體的天然連接的連續(xù)部分，諸如IgG的鉸鏈區(qū)、CH2結構 域和CH3結構域的情況下，這些Fe局部結構域單體包含連續(xù)序列且在這些元件之間不需要 結構域連接。相比之下，例如，當兩個或更多個Fe結構域單體或局部Fe結構域單體以非天 然存在的方式連接以形成各個斯塔都聚體單體時，可以使用結構域連接。一個實例是在兩 個鉸鏈/CH2/CH3肽之間連接，從而產(chǎn)生斯塔都聚體的各個斯塔都聚體單體，其包含：鉸鏈/ CH2/CH3/L/鉸鏈/CH2/CH3,其中"L"是結構域連接。在所描述的各種情況下，結構域連接 可以是接合抗體Fe結構域單體中的鉸鏈與CH結構域的重鏈的天然存在的部分之一?？蛇x 地，結構域連接可以是在各個斯塔都聚體單體的Fe結構域單體和局部Fe結構域單體之間 提供所需間隔和柔性且允許各個斯塔都聚體單體彼此配對以形成組成本發(fā)明的斯塔都體 的斯塔都聚體的任何其它氨基酸序列。示例性結構域連接是GS連接子序列。GS連接子序 列可以包含1個、2個、3個、4個或更多個GGGGS重復序列。優(yōu)選地，GS連接子序列包含3 個（G3S)或4個（G4S)GGGGS重復序列。
[0116] 在一些實施方案中，各免疫活性生物模擬化合物將優(yōu)選地在斯塔都體的各斯塔都 聚體單體中含有至少一個結構域連接，這將用于將免疫活性生物模擬物的Fe結構域維持 在受限的空間區(qū)域內并且將通過例如借助共結合于免疫活性生物模擬物內的Fe結構域而 使Fe γ R聚集來促進Fe γ R活化活性。優(yōu)選地，結構域連接將允許與IgG分子的鉸鏈結構 域所提供的相同或更大程度的構象可變性。所有上述連接在本領域中都是眾所周知的。
[0117] 斯塔都聚體單體間連接
[0118] 本發(fā)明的生物模擬化合物中存在的獨立連接是在構成本發(fā)明斯塔都體的兩個或 更多個獨立斯塔都聚體單體之間出現(xiàn)的"斯塔都聚體單體間連接"。盡管結構域連接是起 到使構成生物模擬化合物的各個斯塔都聚體單體的Fe結構域單體和局部Fe結構域單體彼 此連接作用的短氨基酸序列，但是斯塔都聚體單體間連接起到接合構成生物模擬化合物的 兩個或更多個獨立斯塔都聚體單體的作用。斯塔都聚體單體間連接可以是能夠使各個斯塔 都聚體單體穩(wěn)定締合的任何連接。在一些實施方案中，斯塔都聚體單體間連接可以是斯塔 都聚體單體之間的共價連接?？蛇x地，斯塔都聚體單體之間的斯塔都聚體單體間連接可以 借助直接化學交聯(lián)形成。在優(yōu)選實施方案中，斯塔都聚體單體結構利用Fe結構域單體之間 的天然自組裝性質來產(chǎn)生包含本發(fā)明的斯塔都體的自組裝斯塔都聚體。熟練技術人員將理 解，斯塔都聚體單體間連接允許兩個或更多個獨立斯塔都體單體形成包含本多聚化斯塔都 體發(fā)明的斯塔都