br>[0090]檢測越南衛(wèi)星DNAP的引物為引物對0，由P-F(序列表中序列4所示的單鏈 DNA)和f3-R(序列表中序列5所示的單鏈DNA)組成。
[0091]制備引物TY-F、TY-R、0-F和0-R。
[0092] 實(shí)施例2、試劑盒的制備
[0093] 制備檢測番茄黃化曲葉病毒和/或越南衛(wèi)星DNAP的試劑盒A;制備檢測番茄黃 化曲葉病毒的試劑盒B;制備檢測越南衛(wèi)星DNA的試劑盒C。
[0094] 試劑盒A為將反應(yīng)試劑A和空白對照組裝在一起得到的產(chǎn)品；試劑盒B為將反應(yīng) 試劑B和空白對照組裝在一起得到的產(chǎn)品；試劑盒C為將反應(yīng)試劑C和空白對照組裝在一 起得到的產(chǎn)品。
[0095]所述反應(yīng)試劑A，包括 10XEasyTaqBuffer(含Mg2+) 2. 5yL、TaqDNA聚合酶（5U/ yL) 0? 5yL、ddH20 18. 0yL、dNTP(2. 5mmol/L) 1. 0yL、TY-F(濃度為 10ymol/L) 0? 5yL、 TY-R(濃度為 10umol/UO. 5yL、0 -F(濃度為 10umol/UO. 5yL和 0 -R(濃度為 10ymol/L) 0? 5yL，共 24yL。
[0096]所述反應(yīng)試劑B，包括lOXEasyTaqBuffer(含Mg2+) 2. 5yL、TaqDNA聚合酶（5U/ yL) 0? 5yL、ddH20 19. 0yL、dNTP(2. 5mmol/L) 1. 0yL、TY-F(濃度為 10ymol/L) 0? 5yL和 TY-R(濃度為 10ymol/L) 0? 5yL，共 24yL。
[0097]所述反應(yīng)試劑C，包括 10XEasyTaqBuffer(含Mg2+) 2. 5yL、TaqDNA聚合酶（5U/ yL) 0? 5yL、ddH20 19. 0yL、dNTP(2. 5mmol/L) 1. 0yL、0-F(濃度為 10ymol/L) 0? 5yL和 0-R(濃度為 10ymol/L)0. 5yL，共 24yL〇
[0098] 所述空白對照為滅菌超純水，使用時(shí)加入1yL。
[0099] 實(shí)施例3、利用實(shí)施例2中制備的試劑盒A檢測待測樣本
[0100] -、核苷酸序列的獲得
[0101] 1、用DNA提取試劑盒提取番茄黃化曲葉病毒的基因組DNA，基因組DNA的濃度均為 140ng/yL〇
[0102] 2、將實(shí)施例2制備的24yL反應(yīng)試劑A與1yL步驟1得到的基因組DNA混合，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C3min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30 個(gè)循環(huán)： 72°C10min〇
[0103]3、將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，然后用PCR產(chǎn)物膠回 收試劑盒回收，進(jìn)行測序。
[0104] 4、用DNA提取試劑盒提取越南衛(wèi)星DNAI3的基因組DNA，基因組DNA的濃度均為 140ng/yL〇
[0105]5、將實(shí)施例2制備的24yL反應(yīng)試劑A與1yL步驟4得到的基因組DNA混合，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C3min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30 個(gè)循環(huán)： 72°C10min〇
[0106]6、將步驟5得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，然后用PCR產(chǎn)物膠回 收試劑盒回收，進(jìn)行測序。
[0107] 7、將實(shí)施例2制備的24yL反應(yīng)試劑A與1yL滅菌超純水混合，進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 然后進(jìn)行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C3min;94°C30s，55°C30s， 72°Clmin，30 個(gè)循環(huán)：72°ClOmin。
[0108] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以番茄黃化曲葉病毒的基因組DNA為模板，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有 序列表中序列3所示的核苷酸序列；以越南衛(wèi)星DNAP的基因組DNA為模板，其PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物中含有序列表中序列6所示的核苷酸序列；以無菌超純水為模板，不能得到任何PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物。
[0109] 二、利用實(shí)施例2制備的試劑盒A檢測待測樣本
[0110] 2014年，從河南?。òㄠ嵵菔?、安陽市、新鄉(xiāng)市和焦作市）、河北省和山東?。ò?括泰安市、壽光縣和德州市）采集54個(gè)番茄植株的番茄葉片，作為待測樣本，然后進(jìn)行如下 實(shí)驗(yàn)：
[0111] 1、對各個(gè)待測樣本進(jìn)行觀察：如果番茄植株具有發(fā)病表征A(初期主要表現(xiàn)為生 長遲緩或停滯，植株節(jié)間變短，植株明顯矮化，葉片變小變厚，葉質(zhì)脆硬，葉片有褶皺、向上 卷曲，葉片邊緣至葉脈區(qū)域黃化，植株上部葉片癥狀比較典型，下部老葉癥狀不明顯），說明 待測樣本中只含有或疑似只含有番茄黃化曲葉病毒；如果番茄植株的發(fā)病表征A具有不同 程度的加重，則說明待測樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒和越南衛(wèi)星DNAP;如 果番茄植株不具有發(fā)病表征A，則說明待測樣本中不含有或疑似不含有番茄黃化曲葉病毒 和越南衛(wèi)星DNAI3。在番茄植株中不存在只含有越南衛(wèi)星DNAI3的情形，所以也不存在相應(yīng) 的發(fā)病表征。
[0112] 2、提取待測樣本的基因組DNA，基因組DNA的濃度均為140ng/ y L。
[0113]3、將實(shí)施例2制備的24yL反應(yīng)試劑A與1yL步驟2得到的基因組DNA混合，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C3min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30 個(gè)循環(huán)： 72°C10min〇
[0114] 4、將步驟3得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，然后用PCR產(chǎn)物膠 回收試劑盒回收450bp-500bp的特異條帶A和/或700bp-750bp的特異條帶B，進(jìn)行測序。 將特異條帶A的測序結(jié)果與序列表中序列6進(jìn)行比對，將特異條帶B的測序結(jié)果與序列表 中序列3分別進(jìn)行比對，得到相應(yīng)的一致性數(shù)據(jù)。
[0115] 結(jié)果判定：如果待測樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有DNA分子1，則待測樣本中含有或 疑似含有番茄黃化曲葉病毒；如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中含有DNA分子2,則待測樣本中含有或疑 似含有越南衛(wèi)星DNA;如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)含有DNA分子1和DNA分子2,則待測樣 本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒和越南衛(wèi)星DNAP;如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中既不含有 DNA分子1又不含有DNA分子2,則待測樣本中不含有或疑似不含有番茄黃化曲葉病毒和越 南衛(wèi)星DNA0。
[0116] 54個(gè)待測樣本得到的部分結(jié)果如下：
[0117] 樣本編號為1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)含有與序列表中序列6具有99. 59%-致性 的核苷酸序列（如序列表中序列9所示）和序列表中序列3具有97. 66% -致性的核苷酸 序列（如序列表中序列10所示），判斷該樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒和越南 衛(wèi)星DNAP，該判斷結(jié)果與通過發(fā)病表征判斷的結(jié)果一致；
[0118] 樣本編號為2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只含有與序列表中序列3具有99. 04% -致性的 核苷酸序列（如序列表中序列11所示），判斷該樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒， 該判斷結(jié)果與通過發(fā)病表征判斷的結(jié)果一致；
[0119] 樣品編號為3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)含有與序列表中序列6具有98. 56%-致性 的核苷酸序列（如序列表中序列12所示）和序列表中序列3具有98. 21 % -致性的核苷酸 序列（如序列表中序列13所示），判斷該樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒和越南 衛(wèi)星DNAP，該判斷結(jié)果與通過發(fā)病表征判斷的結(jié)果一致；
[0120] 樣品編號為4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只含有與序列表中序列3具有97. 94% -致性的 核苷酸序列（如序列表中序列14所示），判斷該樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒， 該判斷結(jié)果與通過發(fā)病表征判斷的結(jié)果一致；
[0121] 樣本編號為5的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只含有與序列表中序列3具有97. 94% -致性的 核苷酸序列（如序列表中序列15所示），判斷該樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒， 該判斷結(jié)果與通過發(fā)病表征判斷的結(jié)果一致；
[0122] 樣品編號為6的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)含有與序列表中序列6具有99. 59%-致性 的核苷酸序列（如序列表中序列16所示）和序列表中序列3具有98. 08% -致性的核苷酸 序列（如序列表中序列17所示），判斷該樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒和越南 衛(wèi)星DNAP，該判斷結(jié)果與通過發(fā)病表征判斷的結(jié)果一致；
[0123] 樣品編號為7的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)含有與序列表中序列6具有99. 38%-致性 的核苷酸序列（如序列表中序列18所示）和序列表中序列3具有97. 80% -致性的核苷酸 序列（如序列表中序列19所示），判斷該樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒和越南 衛(wèi)星DNAP，該判斷結(jié)果與通過發(fā)病表征判斷的結(jié)果一致；
[0124] 樣品編號為8的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只含有與序列表中序列3具有98. 21 % -致性的 核苷酸序列（如序列表中序列20所示）判斷該樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒， 該判斷結(jié)果與通過發(fā)病表征判斷的結(jié)果一致；
[0125] 樣品編號為9的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中只含有與序列表中序列3具有98. 49% -致性的 核苷酸序列（如序列表中序列21所示）判斷該樣本中含有或疑似含有番茄黃化曲葉病毒， 該判斷結(jié)果與通過發(fā)病表征判斷的結(jié)果一致；
[0126] 樣品編號為10